专利名称：核酸外切酶保护dna探针杂交dna微阵列芯片检测dna结合蛋白的制作方法
技术领域：
DNA结合蛋白(DNA-binding protein)是生物蛋白质组(proteomics)中一类能够与DNA发生结合从而产生重要功能的蛋白质，这类蛋白质在基因表达调控(gene expression regulation)、DNA重组(DNA recombination)、DNA修复(DNA reparation)、DNA限制(DNA restriction)等细胞过程(cellular processes)中发挥重要作用。这类蛋白质中有一部分与DNA相互作用时，呈现DNA序列特异性结合功能，如与DNA发生DNA序列特异性结合的各类DNA结合蛋白、各种限制性内切酶等。由于这类蛋白质在细胞过程中发挥的重要作用作用，它们已经成为功能基因组(functional genomics)和蛋白质组(proteomics)研究的重要对象。因为这类蛋白质参与众多基因的表达调节，因此与很多疾病存在密切的关系，成为诊断、治疗和药物研究的重要靶点(drug target)。DNA结合蛋白表达及活化程度的检测分析是研究其功能的主要手段。本专利提出了一种检测DNA结合蛋白表达和活化水平的新方法，该方法将为是分子生物学(molecular biology)、功能基因组学、蛋白质组学及生物医学(Biomedicine)领域中的DNA结合蛋白相关研究提供一种新的检测分析技术，可促进这些领域中DNA结合蛋白相关的科学研究，以及在生物医学领域中提供一种疾病相关DNA结合蛋白的诊断技术、以及DNA结合蛋白为靶点的药物筛选(drug screening)技术。
背景技术：
DNA结合蛋白是生物蛋白质组中一类重要的蛋白质，是功能基因组和蛋白质组研究的重要对象；许多疾病都与DNA结合蛋白的异常表达及活化存在密切的关系，成为疾病治疗和药物研究的重要靶点。DNA结合蛋白表达及活化程度的检测分析是研究其功能的主要手段。因此，有关检测分析DNA结合蛋白表达及活化程度技术的研究一直受到科学界的重视。
时至目前，科学家们已经建立多种基于DNA/蛋白质相互作用这一层次的DNA结合蛋白表达及活化程度的检测分析技术。其中最经典的是电泳迁移率变动分析(Electrophoresis MobilityShift Assay)，即凝胶迁移实验(gel shift assay)。该技术一般是人工合成含有DNA结合蛋白结合序列(consensus，binding sites)的双链(double-stranded)寡核苷酸(oligonucleotides)，并用放射性同位素标记寡核苷酸，将标记寡核苷酸与含有DNA结合蛋白的细胞或组织抽提物混合孵育一段时间后，进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳(native polyacrylamide gel eletrophoresis，PAGE)，分离游离(free DNA)和与蛋白质结合的DNA(retarded DNA)，在通过X-光底片暴光显现与蛋白质结合的DNA(retarded DNA)，来反映DNA结合蛋白表达及活化程度。这一技术目前仍非常有效地用于DNA结合蛋白检测分析。但存在放射性标记对实验人员及环境危害的缺陷。因此，对这一技术后来进行了非放射性标记的改进。即用地高辛(digoxigenin，DIG)标记寡核苷酸，进行自然聚丙烯酰胺凝胶电泳，再将电泳产物转印(blotting)到尼龙膜(nylonmembrane)等介质上，依靠碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶耦联的DIG抗体和相应酶的生色(colorimetric)或发光(chemiluminescent)底物(substrate)，进行化学生色或发光检测，来反映DNA结合蛋白表达及活化程度。也有采用荧光(fluorescent)标记寡核苷酸进行电泳迁移率变动分析的改进技术。这些技术也能够很好地用于DNA结合蛋白检测分析。但这些技术仍然存在自身的缺点，即它们虽然避免了经典放射性标记探针凝胶迁移实验的缺点，但同时带来实验流程的复杂化和更多的影响因素，如尼龙膜实验的高背景、转引设备需求及实验成本提高等问题。同时，这些改进技术从根本上未摆脱种凝胶迁移实验的技术思想，无法克服凝胶迁移实验对实验样品数量需求大、实验耗时长、分析效率低等缺陷。
鉴于这些技术目前仍然存在的缺点，建立从技术思想角度上完全不同于凝胶迁移实验的DNA结合蛋白表达及活化检测及分析技术是非常必要的。因此我们多年来一直从事DNA结合蛋白检测新技术的研究，并且已经建立了多种双链DNA微阵列芯片技术(中国专利ZL02112780.8、02137945.9、03152881.3、03132206.9)。在我们已经发明的专利技术中，对DNA结合蛋白的检测是在芯片上直接制备双链DNA，将DNA结合蛋白的结合位点嵌合固定在芯片上双链DNA上，通过待检蛋白溶液与双链DNA芯片的反应，使蛋白质结合在芯片DNA上，进行DNA结合蛋白的检测。这种方法在检测中需要用荧光素标记蛋白质，或准备蛋白质的抗体并用荧光素进行标记才能实现芯片检测，这不仅要求标记蛋白、制备抗体等实验，而且标记对蛋白可能造成DNA结合功能的影响。这种方法在检测一种蛋白质与芯片上众多的DNA间的相互作用时，非常有效；但在检测多种蛋白时，面临一定的困难。特别重要的是，在实践中需要检测的对象常常是组织(tissue)、细胞(cell)等的核抽提物(nuclearextract)，要对这样的复杂混合物进行荧光标记是很困难的，特别是对那些低丰度的DNA结合蛋白，要在核抽提物中标记它们是非常困难的。另外如果采用抗体，则需要制备所需要检测的所有蛋白质的抗体，并用荧光标记它们，才能用于高通量检测多种DNA结合蛋白，这一途径显然更加困难。由此，我们着力改进现有的DNA结合蛋白检测技术，希望建立一些更加有效的技术，推动相关技术的产业化和应用。本发明中，我们将核酸外切酶保护分析(Exonuclease Protection Assay)技术、PCR(Polymerase Chain Reaction)技术及DNA微阵列芯片(DNA microarray chip)技术有效地结合在一起，建立了“核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白”技术，用于在不标记蛋白的情况下，同步(simultaneous)检测多种DNA结合蛋白，即实现DNA结合蛋白的高通量(high throughput)分析检测。
发明内容
(1)、发明目的本发明的目的是提供一种不需要对DNA结合蛋白进行任何标记就可以高灵敏高通量检测DNA结合蛋白的新技术，便于依靠基因芯片技术平台实现DNA结合蛋白的高效分析。为分子生物学(molecular biology)、功能基因组学(functional genomics)、蛋白质组学(proteomics)及生物医学(biomedicine)等领域中的DNA结合蛋白(DNA-binding protein)的相关研究提供一种新的实验技术，促进这些领域中DNA结合蛋白相关的科学研究，以及针对DNA结合蛋白的临床检测和药物筛选研究。
(2)、技术方案本专利提出了一种检测DNA结合蛋白表达和活化水平的新技术，即“核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白”，运用该技术可以实现对DNA结合蛋白表达(expression)和活化(activation)水平的检测分析。该技术的核心是将鉴定DNA结合蛋白DNA结合位点的核酸外切酶保护分析(Exonuclease Protection Assay)技术、核酸扩增的PCR(Polymerase Chain Reaction)技术及高通量检测生物信息的DNA微阵列芯片(DNAmicroarray chip)技术巧妙地结合在一起，达到对DNA结合蛋白表达和活化水平的非标记(label-free)高通量(High throughput)分析。
运用该技术分析DNA结合蛋白表达及活化水平时，首先依据要检测的DNA结合蛋白的DNA结合位点的核苷酸序列，如一般的共同基序(consensus)，以及本技术中运用核酸外切酶保护分析对PB-Probe结构的要求，设计并合成具有“旁侧序列——DNA结合蛋白结合位点——PCR引物结合位点——标签序列——PCR引物结合位点——DNA结合蛋白结合位点——旁侧序列”结构的蛋白质结合DNA探针(简称“PB-Probe”)；对DNA结合蛋白进行检测时，首先将多个PB-Probe等摩尔混合，成为PB-Probe溶液，再将待检测的DNA结合蛋白溶液与PB-Probe溶液在有利与DNA/蛋白质结合的结合缓冲液中混合，在适宜反应温度下进行结合反应适当时间；向DNA/蛋白质结合反应体系中加入核酸外切酶(exonuclease)反应液，在适宜温度下酶切(digestion)适当时间，再加入终止液彻底终止核酸外切酶酶切活性；酶切反应终止后，对反应体系进行DNA纯化，将纯化后的DNA作为模板(template)，用PCR引物进行PCR扩增反应。在DNA/蛋白质结合反应中，若待检溶液中存在相应PB-Probe的DNA结合蛋白，则DNA结合蛋白就会与溶液中的PB-Probe发生序列特异性结合反应(sequence-specific binding)，形成“PB-Probe/DNA结合蛋白”复合物(complex)，在这种复合物中，DNA结合蛋白结合在PB-Probe两端的DNA结合位点上，形成了一种物理障碍(physicalhindrance)，当核酸外切酶消化时，则结合的DNA结合蛋白阻挡了核酸外切酶沿着PB-Probe的外切反应，使核酸外切酶不能降解PB-Probe上DNA结合位点内侧的PCR引物结合位点(PCR primer-binding site)及标签序列(Tag sequence)，因此在PCR反应中，被DNA结合蛋白保护的PB-Probe的PCR引物结合位点及标签序列就可以实现扩增；而当待检溶液中不存在相应PB-Probe的DNA结合蛋白时，裸露(naked)的PB-Probe就会受到核酸外切酶的攻击，核酸外切酶对PB-Probe发生彻底降解，因此在PCR反应中，因无PCR引物结合位点及标签序列，PCR就扩增不出产物。因此，PCR产物的有无及多少代表了待检蛋白质溶液中DNA结合蛋白的有无及多少。为便于检测PCR扩增产物，在PCR扩增中可运用荧光标记的单核苷酸(Mononuleotide)或引物(primer)，对PCR产物进行标记，再将荧光标记的PCR扩增产物与Tag-DNA微阵列芯片杂交，依据芯片应该光扫描图像获得PCR产物中各种PB-Probe的数量信息，从而高通量判定待检蛋白质溶液中DNA结合蛋白的有无及多少。此处所使用的Tag-DNA微阵列芯片是一种普通的单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)微阵列芯片(microarray chip)，但芯片上固定的DNA探针是专门针对PB-Probe上的标签序列(Tagsequence)设计的，因此这些芯片DNA探针(CD-Probe)可检测PCR产物中各种PB-Probe的数量信息。
运用该技术检测DNA结合蛋白包括如下五个步骤
①制备PB-Probe、CD-Probe和Tag-DNA微阵列芯片；②PB-Probe与DNA结合蛋白结合；③核酸外切酶酶切；④PCR扩增及标记；⑤PCR产物与DNA微阵列芯片杂交检测。
制备PB-Probe是运用该技术检测DNA结合蛋白的第一步，也是很重要的一步。为实现本技术检测DNA结合蛋白的功用，PB-Probe的设计和制备具有下列结构①PB-Probe为双链DNA(double-stranded DNA，dsDNA)分子；②PB-Probe的两端各含有一个以上的相同DNA结合蛋白的结合位点；③PB-Probe的DNA结合蛋白结合位点内侧有PCR引物结合位点；④PB-Probe的两PCR引物结合位点之间存在特定的标签(Tag)序列。因此本发明中使用的PB-Probe具有这样的结构，即“旁侧序列——DNA结合蛋白结合位点——PCR引物结合位点——标签序列——PCR引物结合位点——DNA结合蛋白结合位点——旁侧序列”。
PB-Probe是由两碱基序列反向互补的单链核酸分子构成的线性(linear)双链DNA分子。构成PB-Probe的两碱基序列反向互补的单链核酸分子可以依靠两种途径获得，一是运用固相化学合成两条单链寡核苷酸，通过核酸退火，形成双链DNA分子；二是设计并合成具有“旁侧序列——DNA结合蛋白结合位点——引物序列1——引物序列2”或“旁侧序列——DNA结合蛋白结合位点——引物序列1”的PCR引物，依靠PCR扩增反应从序列已知的自然生物基因组DNA中扩增获得需要的PB-Probe。PCR扩增时可利用针对不同DNA片段的特异引物序列2扩增制备PB-Probe，而在DNA结合蛋白检测中使用针对引物序列1合成的通用PCR引物方便地扩增PB-Probe。若有可能，在PB-Probe制备及检测中都可以使用引物序列1，如利用克隆在具有通用引物结合序列载体中的基因组DNA片段制备PB-Probe。
为了运用核酸外切酶保护分析(Exonuclease Protection Assay)技术实现对DNA结合蛋白的检测，本发明对传统DNA足迹分析(DNA footprinting)中的DNA探针进行了重要改造，即在DNA探针的两端各设立一个DNA结合蛋白结合位点，在两DNA结合蛋白结合位点之间设立具有信息检测功能的PCR引物结合序列和标签序列，蛋白质与PB-Probe的两DNA结合蛋白结合位点的结合与否，可依靠随后的酸外切酶保护分析、PCR扩增和芯片杂交加以指示。DNA结合蛋白的结合位点，可以是从自然生物基因组中鉴定发现的结合序列如共同基序(consensus)外，例如，p53蛋白的DNA结合位点为 SP1蛋白的DNA结合位点为 NF-κ蛋白的DNA结合位点为 等；也可以是经体内外实验筛选的DNA结合蛋白对其有良好序列特异性结合亲合性的核酸序列。由于有些核酸外切酶如核酸外切酶III有时会越过结合位点较小的DNA结合蛋白，在探针设计上，可以在PB-Probe的每一端增设一个以上的蛋白质结合位点，或设计使用亲合力较高的蛋白质结合位点。在PB-Probe设计上还需要注意在PB-Probe的两个末端增设一些旁侧序列，以便DNA结合蛋白与PB-Probe的良好结合。有些DNA结合蛋白不需要旁侧序列，也可以和DNA结合蛋白结合位点发生良好的结合，此中情况下，也可以减少旁侧序列的核苷酸数目或不要旁侧序列。为了保证DNA结合蛋白按预定的行为与PB-Probe结合并实现对其检测，一个PB-Probe上除专门在PB-Probe两端设立的DNA结合蛋白结合位点外，其他序列包括旁侧序列、PCR引物结合位点和标签序列中都不得在含有DNA结合蛋白结合位点。为了检测不同的DNA结合蛋白，不同的PB-Probe含有不同DNA结合蛋白的结合位点，在检测体系中需要检测多少种DNA结合蛋白，就需要设计并合成相应种类的PB-Probe。在检测的探针溶液中则含有所有种类的PB-Probe，以同步(simultaneously)检测多种DNA结合蛋白。但是，由于在检测中将多种PB-Probe混合在一起作为探针溶液与蛋白质溶液进行结合反应，因此一个PB-Probe上的DNA结合蛋白结合位点序列不仅在该PB-Probe上是唯一的，在探针溶液中的所有PB-Probe上也必须是唯一的，特异的，即一种PB-Probe上不得出现两种DNA结合蛋白的结合位点。
为了便于进行PCR扩增及检测，本发明在PB-Probe的DNA结合蛋白结合位点内侧设计了PCR引物结合位点。在一个PB-Probe上，PCR引物结合位点的序列必须是唯一的，即只有PCR引物结合位点可供PCR引物结合，其他序列包括旁侧序列、蛋白质结合位点和标签序列都不能和PCR引物退火。在一个PB-Probe上，标签序列两侧的两PCR引物结合位点序列可以相同(5′→3′)，也可以不同；若不同，在PCR扩增时就需要两个不同的引物，及一对PCR引物；若相同，则只需要一个引物，就如RAPD一样。由于在检测中将多冲PB-Probe混合在一起作为探针溶液与蛋白质溶液进行结合反应，因此一个PB-Probe上的PCR引物结合位点序列不仅在该PB-Probe上是唯一的，在探针溶液中的所有PB-Probe上也必须是唯一的，特异的。可见，本发明中若对不同的PB-Probe设计不同的PCR引物结合位点时，探针溶液中PB-Probe种类越多，则需要设计合成的上PCR引物越多，则多重PCR的复杂性越大，特别是要兼顾PCR引物结合位点序列的特异性和一致的Tm值，则会更大地增加PB-Probe及PCR引物设计及合成的难度，因此这种设计方案显然不是本发明优先选择的。比较而言，在所有PB-Probe上使用一对或一个通用的PCR引物结合位点，则极大地简化了PB-Probe及PCR引物设计及合成，因此使用通用PCR引物结合位点和通用PCR引物是本发明最优先采取的方案。
为了运用DNA微阵列芯片实现DNA结合蛋白的高通量检测，本发明的PB-Probe的两PCR引物结合位点之间设立了特定的标签(Tag)序列。标签序列和蛋白质结合位点一样，不仅要求在同一PB-Probe上其序列是唯一的，在探针溶液中的所有PB-Probe上也必须是唯一的，特异的。这样，一个PB-Probe上的标签序列才能唯一性地代表该PB-Probe要检测的靶蛋白。PB-Probe标签序列的设计除序列特异性外，还应当注意其碱基组成，以便针对不同的PB-Probe标签序列设计Tag-DNA微阵列芯片的DNA探针，特别是要求所有CD-Probe要有一致的Tm值。若PB-Probe是从基因组DNA中扩增制备，应对每个PB-Probe的标签序列进行详尽的蛋白质结合位点筛查，杜绝所有PB-Probe的标签序列上含有任何已知的DNA结合蛋白的结合位点。对于序列已知的基因组及DNA克隆，这一工作并不困难。
运用本发明检测DNA结合蛋白，还需准备PCR引物，以便在核酸外切酶酶切后扩增PB-Probe。本发明PCR引物的准备出遵循一般PCR引物设计的所有要求外，还应当按PB-Probe上PCR引物结合位点的序列特征进行合成。正如前面对PB-Probe上PCR引物结合位点设计的阐述，本发明尽量避免进行多重的PCR引物设计和合成，也避免进行多重PCR，应是优先使用通用PCR引物。
Tag-DNA微阵列芯片检测PCR扩增产物是本发明实现DNA结合蛋白检测最后一步，也是体现本发明高通量特征的重要环节。Tag-DNA微阵列芯片的设计及制备具有如下特征①Tag-DNA微阵列芯片上固定着大量单链芯片DNA探针(Single-stranded CD-Probe)分子；②大量的CD-Probe分子的核苷酸序列各不相同，不同的CD-Probe分子其核苷酸序列在所有CD-Probe分子中是独特的；③每一种CD-Probe分子的核苷酸序列设计对应着一种PB-Probe的标签序列，即一种CD-Probe分子可与对应的PB-Probe的标签序列的其中一条链杂交退火；④芯片上不同的CD-Probe分子对应不同的PB-Probe的标签序列；⑤Tag-DNA微阵列芯片与PCR扩增的PB-Probe分子杂交时，不同CD-Probe分子可反映一种对应的PB-Probe分子的标签序列在PCR产物中的存在与否及数量多少；⑥为了提高芯片检测的精确性，可针对一个PB-Probe的标签序列设计一个以上的CD-Probe，通过多CD-Probe信号的共显性及信号强度的均匀性对PCR产物中相应PB-Probe的量做出精确的判别；⑦Tag-DNA微阵列芯片应设置阳性和阴性对照CD-Probe。
在DNA微阵列芯片检测，一般要对检测的DNA进行荧光标记，再与芯片杂交，杂交后芯片经荧光扫描分析，就可以获得各个探针的杂交信号，进而判定检测DNA中对应于各种芯片探针的靶DNA分子的数量信息。在本发明中，为便于运用Tag-DNA微阵列芯片对PCR扩增产物进行检测分析，也需要在PCR扩增中对扩增产物进行标记。若使用共PCR扩增标记，就可以在PCR扩增反应体系中，加入荧光素标记的单核苷酸，如Cy3-dUTP、Cy3-dCTP等，使其进入PCR扩增的DNA产物链中；或使用荧光素标记的PCR引物，进行PCR扩增反应，使PCR扩增的DNA产物链带上荧光分子。此种情况下PCR产物与Tag-DNA微阵列芯片杂交后，芯片经适当洗涤，就可以直接用基因芯片扫描仪、荧光显微镜等仪器进行荧光信号检测。另外还可以采用其他标记方法实现标记，如PCR中使用带DIG、生物素等的核苷酸，如DIG-dUTP、Biotin-dUTP等，也可以使用DIG、生物素等标记的PCR产物等，标记PCR产物；此种情况下PCR产物与Tag-DNA微阵列芯片杂交后，芯片经适当洗涤，再用荧光标记的DIG-抗体、生物素抗体或链亲合素等与Tag-DNA微阵列芯片杂交，芯片经洗涤后，再用基因芯片扫描仪、荧光显微镜等仪器进行荧光信号检测。除了标记PCR产物外，还可以采用不标记PCR产物的其他技术实现PCR产物与Tag-DNA微阵列芯片杂交后的信号反映，如在PCR引物的5′末端增加一段寡核苷酸，其上4个其他碱基相间的插入多个dATP或dGTP，PCR产物与Tag-DNA微阵列芯片杂交后，进行含Cy3-dUTP或Cy3-dCTP的在片DNA聚合酶延伸反应，也可反映杂交信号；不过此种情况要求Tag-DNA微阵列芯片的CD-Probe是固定5′末端，而3′末端游离。另外若PCR引物的5′末端增加一段寡核苷酸，可以在PCR产物与Tag-DNA微阵列芯片杂交后，也可用一荧光标记的寡核苷酸与PCR引物5′末端增加寡核苷酸再杂交，反映PCR产物与Tag-DNA微阵列芯片杂交信号。此外其他技术，如3D-DNADendrimers，Rolling Circle Amplification Technology(RCA)，Au-DNA等技术进行PCR产物与Tag-DNA微阵列芯片杂交信号的反映。
本技术中用于检测的DNA结合蛋白为各种来源的DNA结合蛋白，包括人工表达制备的DNA结合蛋白、从细胞或组织裂解物中分离纯化的DNA结合蛋白和含有DNA结合蛋白的细胞或组织抽提物。检测中首先要在适宜反应温度(如37C)将PB-Probe与DNA结合蛋白在结合缓冲液中一起孵育适当时间，如20分钟到半小时，其作用是DNA结合蛋白与PB-Probe在溶液中发生序列特异性识别并结合。结合反应体系中加入的PB-Probe的量要适宜。检测中可以在同一反应体系中加入检测不同DNA结合蛋白的PB-Probe，以高通量检测多种DNA结合蛋白。
在DNA结合蛋白与PB-Probe发生序列特异性结合后，将核酸外切酶反应液加入反应体系中，使核酸外切酶对PB-Probe发生消化反应，彻底降解未与DNA结合蛋白结合的PB-Probe，使降解的PB-Probe不能在随后的PCR扩增反应中扩增出来。消化PB-Probe所使用核酸外切酶为具有在双链DNA上可从3′→5′或5′→3′外切消化DNA逐个释放单核苷酸的酶，如Ba131、exonuclease III、E.coli DNA Polymerase I、T4 phage DNA Polymerase、T7 phage DNAPolymerase、λphage exonuclease等酶。在酶的选用上，应尽量选择那些反应效率高，反应条件接近DNA/蛋白质结合缓冲液性质的核酸外切酶。在选用核酸外切酶时，那些可在单链和双链DNA上都可以进行核酸外切消化的酶更有利。若选用只能在双链DNA上进行核酸外切消化的酶时，如核酸外切酶III，需在核酸外切酶反应适宜时间后，加入S1核酸酶消除核酸外切酶产生的单链DNA，在进行PCR扩增。
我们的实验表明，核酸外切酶III为本发明技术中可以使用的一个非常理想的核酸外切酶，该酶具有对双链DNA的3′→5′外切活性，而且在广泛的盐浓度(0-100nM NaCl活KCl)和pH(7.6-8.5)条件中都具有稳定的活性；该酶在一般DNA/蛋白质结合反应温度下(37℃)下具有很高的外切活性(～500bp/分钟，Promega)；另外，一般DNA/蛋白质结合缓冲液(具有Mg2+)就可以成为该酶的可行反应条件，因此在进行核酸外切酶III外切反应时，仅仅加入一些酶就可以了，不需要再加入其他缓冲液，所以非常适合运用本发明核酸外切酶酶切反应中。核酸外切酶III的消化效率非常高，在37℃，每分钟可切除420个核苷酸(Fermentas)，因此酶反应的时间一般很短，而DNA/蛋白质复合物的寿命一般比核酸外切酶III反应所需要的时间长，加之核酸外切酶III的加入一般不会影响DNA/蛋白质复合物，因此核酸外切酶III被广泛地用于常规DNA足迹分析(DNAfootprinting)或核酸外切酶保护分析(exonuclease IIIprotection assay)中。核酸外切酶III的另一好处是，该酶已经证实可用以分析细胞抽提物中的DNA结合蛋白，这对分析临床样品非常有利，因为临床样品常常是组织或细胞，从这些样品中只要抽提出核蛋白或细胞蛋白，就可以用核酸外切酶III进行分析。因此，核酸外切酶III是本发明最优先使用的核酸外切酶。但使用该酶时，不能使用3′端比5′端突出4个以上核苷酸的PB-Probe，平端和3′凹端的PB-Probe最好。
由于在核酸外切酶保护分析中延长酶反应会导致酶消化掉那些蛋白质结合后动态脱落的PB-Probe，导致出现假阴性结果。因此在核酸外切酶加入PB-Probe/蛋白质结合反应体系，反应适当时间后，应加入EDTA等终止试剂或高温加热完全终止核酸外切酶酶切反应，并立即对反应产物进行DNA纯化，消除DNA结合蛋白及核酸外切酶等蛋白质，以便PCR扩增。
本技术中上面所述对一种待蛋白质溶液检测时，对PCR产物用一种荧光素标记并与Tag-DNA微阵列芯片杂交，通过荧光信号的强弱反映蛋白质存在与否及数量。除了这种方式的检测外，还可以对两份蛋白质溶液，如一种为正常组织细胞核蛋白质抽提物，另一种为疾病状态组织细胞核蛋白质抽提物，进行比较检测，此种情况下，一种蛋白PCR产物用一种荧光素标记(如Cy3)，另一种蛋白PCR产物用另一种荧光素标记(如Cy5)，最后将两种PCR产物混合与Tag-DNA微阵列芯片共杂交，芯片用双通道荧光(Cy3、Cy5)扫描后，叠加双色荧光图像，判断蛋白质表达或活化水平的上调(upregulate)或下调(downregulate)。
(3)、技术效果DNA结合蛋白因负责基因表达的调控等重要的细胞功能而成为目前基因组和蛋白组研究所重视的一类重要蛋白质，而且许多疾病与DNA结合蛋白异常表达及活化间存在的密的关系，引起了生物医药领域对DNA结合蛋白研究的关注，DNA结合蛋白已经成为疾病治疗和药物研究的重要靶点。因此，建立高通量DNA结合蛋白功能检测及分析技术非常迫切。为此，本发明提出了一种非蛋白标记的DNA结合蛋白高通量检测技术，利用本技术检测DNA结合蛋白，可以克服传统检测DNA结合蛋白方法以及双链DNA微阵列芯片的一些技术缺陷，实现DNA结合蛋白的高效分析。
本发明提出的“核酸外切酶保护DNA探针杂交Tag-DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白”技术，将核酸外切酶III保护分析技术、PCR扩增技术和DNA微阵列芯片技术结合在一起，建立了一种高效检测分析DNA结合蛋白的新方法。经我们的实验研究，本发明提出的技术可操作性强，实验结果重复性良好。在推广应用中，当我们商业化生产和提供PB-Probe、CD-Probe和Tag-DNA微阵列芯片及相关成套试剂的情况下，只经过四个实验步骤就可以完成对多DNA结合蛋白的同步分析。本发明提供的DNA结合蛋白检测新技术，可以借助常规PCR仪、基因芯片点样仪、基因芯片扫描等仪器实现DNA结合蛋白的高通量检测，这些仪器已经在很多实验室得到应用，因此极大地方便了本技术的推广使用。商业化提供的试剂盒可投入到科研、医疗等应用领域，用与DNA结合蛋白的相关研究、诊断和药物筛选。因此，该技术将为分子生物学、功能基因组学、蛋白质组学等领域中的DNA结合蛋白的相关研究提供一种新的实验技术，促进这些领域中DNA结合蛋白相关的科学研究和开发。
本发明技术生产的DNA结合蛋白检测试剂盒，将在临床辅助诊断和生物医学中针对DNA结合蛋白的药物筛选研究具有非常重要的应用价值。例如，DNA结合蛋白p53、NF-kB的表达及活化异常，在许多疾病中发挥的重要作用，因此成为临床诊断中观测的重要靶点，同时也是转录治疗和药物筛选重要靶点。
四
图1核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白技术流程注解PB蛋白质结合(Protein Binding)；ED核酸外切酶消化(Exonuclease Digestion)；P纯化(Purification)；A扩增(Amplification by PCR)；CH芯片杂交(Chip Hybridization)；S扫描(Scanning)。
图2PCR扩增实验结果图3Tag-DNA微阵列芯片杂交实验结果五具体实施方式
此处仅以制备PB-Probe检测DNA结合蛋白NF-κB的实验为例，说明本发明技术的具体
1、NF-κB PB-Probe，PCR引物，Tag-DNA微阵列芯片制备NF-κB PB-Probe 其中＿＿为NF-κB结合位点， 为PCR primer结合位点， 为Tag序列。
NF-κB PB-Probe制备时，将两寡核苷酸以100μM浓度溶解在TEN缓冲液(10mM Tris，1mM EDTA，0.1M NaCl，pH8.0)中；将配对寡核苷酸溶液等摩尔(molar)混合，95℃保温10分钟，缓慢冷却到15～25℃。用TEN缓冲液稀释部分PB-Probe原液至浓度为5μM，4℃保存备用。
PCR引物primerR5′...GCTGGGCTGCTGC...3′Tm46.5GC76.9％primerF5′...CCGCTACGGCTCG...3′Tm47.5GC76.9％PCR引物寡核苷酸以50μM浓度溶解在水中。
Tag-DNA微阵列芯片CD-Probe5′...NH2-TTTTTTTTTTCTGCACTGCTCATTAATATACTTCTGG...3′positive5′...NH2-TTTTTTTTTTCTGCATGTATAGAACATAAGGTGTCGC...3′negative control将CD-Probe寡核苷酸以100μM浓度溶解在碳酸缓冲液(0.1M carbonatebuffer，pH9.0)。再将碳酸缓冲液稀释的50μM的CD-Probe寡核苷酸用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)点样到醛基修饰玻片(SuperAldehyde slide，Telechem)表面，点样后置于湿盒内用300mM K2HPO4(pH9.0)浸湿的滤纸上，密封湿盒，在37℃温育30分钟，再用2×SSC/1％SDS溶液洗涤2分钟，用水简单淋洗，N2吹干。芯片再用硼氢化钠溶液
浸泡玻片30分钟，除去过剩醛基，1％SDS溶液洗涤2分钟，用水简单淋洗，N2吹干。
2、NF-κB PB-Probe与DNA结合蛋白NF-κB的结合将2μl(1gsu/μl)DNA结合蛋白NF-κB蛋白[rhNF-κB(p50)，Promega)]、2μl 5×DNA结合缓冲液(50mM HEPES pH7.9，250mM KCl，12.5mM DTT，0.5mM EDTA，0.25％NP-40，50％Glycerol，25％fetal bovine serum)和2μl 5μM NF-κB PB-Probe混合，再加入4μl水，形成DNA/蛋白质结合反应液。将DNA/蛋白质结合反应液在37℃孵育30分钟。
3、核酸外切酶III反应将2μl 10×反应缓冲液[660mM Tris-HCl(pH8.0 at 30℃)，6.6mM MgCl2]和0.2μl 200U/μlExonuclease III(MBI Fermentas，#EN0191)加入结合反应体系中，37℃孵育5分钟。再向酶反应溶液中加入75μl S1核酸酶反应液[40.5mM potassium acetate(pH4.6)，0.34M NaCl，1.35mMZnSO4，6.75％glycerol，S1 Nuclease 0.25U/μl)，37℃孵育5分钟。加入10μl S1终止液(300mM Tris，50mM EDTA)，70℃加热10分钟灭活S1 Nuclease。用酚∶氯仿(1∶1)、酚∶氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提终止的酶反应溶液一次，再用冰乙醇沉淀DNA
，最后1ml 75％-20℃冰乙醇洗涤DNA一次，干燥DNA沉淀，将DNA溶解在10μl水中。
4、PCR扩增反应及标记用上面纯化的DNA做模板，primerF和primerR为引物进行PCR扩增。100μl-PCR反应体系为2μl模板DNA，0.5μM primerR，0.5μM primerF，0.2mM dATP，0.2mM dGTP，0.2mMdTTP，0.15mM dCTP，0.05mM Cy3-dCTP(Amersham Pharmacia)，2mM MgSO4，10mM KCl，8mM(NH4)SO4，10mM Tris-HCl，pH9.0，0.05％NP-40，0.05U/μl Taq(Shenergy Biocolor)。PCR程序95℃2分钟，94℃30秒、50℃45秒、72℃1分钟循环25次，72℃5分钟。用酚∶氯仿(1∶1)、酚∶氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提PCR产物一次，再用-20℃冰乙醇沉淀DNA
，最后用-20℃75％冰乙醇洗涤DNA一次，干燥DNA沉淀。将DNA溶解在50μl水中，95℃加热10分钟，冰上骤冷保存。
5、PCR扩增及标记产物与Tag-DNA微阵列芯片杂交检测取2μl经纯化溶解在水中的PCR产物与2μl 5×标准杂交液[25×SSC，0.5％N-lauroylsarcosine，0.1％SDS，5％blocking reagent(Roche)]混合，再加水6μl。将杂交液滴加到Tag-DNA微阵列芯片上，用盖玻片覆盖杂交液。将芯片放入杂交盒内，密封，60℃孵育3小时。取出芯片，用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗涤芯片一次，再用水简单淋洗，300rpm离心芯片，除去芯片上残留液体。用基因芯片扫描仪(ScanArrayLite，PackardBioScience BioChip Technologies)上获取荧光图像，扫描参数为Cy3通道、90％激光强度，80％PMT增益、5μm分辨率.。荧光伪彩图像的信号强度用微阵列分析软件(QuantArraymicroarray analysis software，Packard BioScience BioChip Technologies)进行分析。
权利要求
1.核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白，提出了一种检测DNA结合蛋白的新方法，其特征在于运用该方法检测DNA结合蛋白包括如下步骤a)制备蛋白质结合DNA探针(简称PB-Probe)、PCR引物和Tag-DNA微阵列芯片；b)PB-Probe与DNA结合蛋白结合；c)核酸外切酶酶切；d)PCR扩增及标记；e)PCR产物与Tag-DNA微阵列芯片杂交检测。
2.根据权利要求1所述的核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白，其特征在于步骤(a)准备的PB-Probe，每种PB-Probe都是由核苷酸序列组件“旁侧序列→DNA结合蛋白结合位点→PCR引物结合位点→标签序列→PCR引物结合位点→DNA结合蛋白结合位点→旁侧序列”构成的线性双链DNA分子。
3.根据权利要求2所述的PB-Probe的DNA结合蛋白结合位点，其特征在于一种PB-Probe只含有一种DNA结合蛋白的结合位点，不同PB-Probe含有不同DNA结合蛋白的结合位点；在所有PB-Probe的DNA序列中，一种PB-Probe的DNA结合蛋白结合位点只出现在该种PB-Probe的DNA结合蛋白结合位点位置上，其他PB-Probe DNA序列中不存在该种PB-Probe的DNA结合蛋白结合位点。
4.根据权利要求2所述的PB-Probe的PCR引物结合位点，其特征在于一种PB-Probe可含有两个序列不同或相同的PCR引物结合位点，不同PB-Probe也可含有序列不同或相同的PCR引物结合位点；在所有PB-Probe的DNA序列中，PCR引物结合位点只出现在PB-Probe的PCR引物结合位点位置上，其他PB-Probe DNA序列中不存在PCR引物结合位点。
5.根据权利要求2所述的PB-Probe的标签序列，其特征在于不同PB-Probe含有不同序列的标签序列；在所有PB-Probe的DNA序列中，一种PB-Probe的标签序列只出现在该种PB-Probe的标签序列位置上，其他PB-Probe DNA序列中不存在该种PB-Probe的标签序列。
6.根据权利要求2所述的PB-Probe的旁侧序列，其特征在于一种PB-Probe可含有两个序列不同或相同的旁侧序列，不同PB-Probe也可含有序列不同或相同的旁侧序列；在所有PB-Probe的旁侧序列中，不存在所有PB-Probe的DNA结合蛋白结合位点、PCR引物结合位点和标签序列。
7.根据权利要求1所述的核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白，其特征在于步骤(a)准备的PCR引物，可与PB-Probe的PCR引物结合位点特异性退火结合；依据PB-Probe上PCR引物结合位点的序列设计，不同PB-Probe可以使用不同的PCR引物，也可以使用相同的PCR引物。
8.根据权利要求1所述的核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白，其特征在于步骤(a)中准备的Tag-DNA微阵列芯片，固定着大量单链芯片DNA探针(简称CD-Probe)，各CD-Probe的核苷酸序列各不相同，一种CD-Probe只与一种PB-Probe的标签序列特异性杂交退火，不同的CD-Probe可与不同的PB-Probe标签序列特异性杂交退火；Tag-DNA微阵列芯片上有检测所有PB-Probe的CD-Probe。
9.根据权利要求1所述的核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白，其特征在于步骤(b)中PB-Probe与DNA结合蛋白结合，其中PB-Probe为多种PB-Probe的等量混合物，以便在一次检测中同步获得多种DNA结合蛋白的信息。
10.根据权利要求1所述的核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白，其特征在于步骤(b)中PB-Probe与DNA结合蛋白结合，其中DNA结合蛋白为各种来源的DNA结合蛋白，包括人工表达制备的DNA结合蛋白、从细胞或组织裂解物中分离纯化的DNA结合蛋白和含有DNA结合蛋白的细胞或组织抽提物。
11.根据权利要求1所述的核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白，其特征在于步骤(b)中PB-Probe与DNA结合蛋白的结合，是DNA结合蛋白与PB-Probe间发生序列特异性识别并结合的过程。
12.根据权利要求1所述的核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白，其特征在于步骤(c)中的核酸外切酶酶切是指将核酸外切酶加入步骤(b)反应产物中，使核酸外切酶从PB-Probe的两端发生外切消化反应的过程。
13.根据权利要求1所述的核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白，其特征在于步骤(c)中的核酸外切酶，为具有核酸外切活性的核酸酶，这些酶能从双链DNA的3′或5′发生外切反应，逐个释放单核苷酸。
14.根据权利要求1所述的核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白，其特征在于步骤(d)PCR扩增及标记，是指以步骤(c)DNA产物为模板，以步骤(a)制备的PCR引物为引物进行的PCR扩增反应；在PCR扩增反应体系中，可加入标记物修饰的单核苷酸，或标记物修饰的PCR引物，使PCR扩增的DNA产物带上标记。
15.根据权利要求1所述的核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白，其特征在于步骤(e)PCR产物与Tag-DNA微阵列芯片杂交检测，是将PCR产物与杂交液混合，再与Tag-DNA微阵列芯片进行杂交反应，使PCR产物与CD-Probe发生序列特异性退火的过程。
16.根据权利要求1所述的核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白，其特征在于步骤(e)PCR产物与Tag-DNA微阵列芯片杂交检测，在PCR产物与Tag-DNA微阵列芯片杂交后，要依据PCR产物标记的化学性质，进行信号获取的过程。
全文摘要
核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白，提出了一种检测DNA结合蛋白的新方法，其特征在于运用该方法检测DNA结合蛋白包括如下步骤(a)制备蛋白质结合DNA探针、PCR引物和Tag－DNA微阵列芯片；(b)蛋白质结合DNA探针与DNA结合蛋白结合；(c)核酸外切酶酶切；(d)PCR扩增及标记；PCR产物与Tag－DNA微阵列芯片杂交检测。本发明提出的“核酸外切酶保护DNA探针杂交DNA微阵列芯片检测DNA结合蛋白”检测DNA结合蛋白的特点是，不需对蛋白质进行任何化学修饰及标记，可同步对多种DNA结合蛋白进行高通量检测，检测灵敏度高。
文档编号C12Q1/68GK1746318SQ200410041930
公开日2006年3月15日 申请日期2004年9月10日 优先权日2004年9月10日
发明者王进科 申请人:王进科, 南京新益华集团有限公司