专利名称：腺苷脱氨酶活性测定方法及腺苷脱氨酶诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种测定腺苷脱氨酶活性的方法，同时本发明还涉及用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。
背景技术：
医学研究表明，腺苷脱氨酶是一种与机体细胞免疫活性有重要关系的核酸代谢酶。因此，腺苷脱氨酶活性的测定被作为良恶性胸腹水，脑脊液鉴别诊断，重症联合免疫缺陷病(SCID)，急、慢性肝炎，肝硬化，肝癌等疾病鉴别的重要诊断标志。
腺苷脱氨酶的活性测定方法主要有放射核素法、物理方法和生化法。据申请人了解，目前国际上普遍采用紫外光法，其测定原理是腺苷(白色结晶粉末)+水(H2O)腺苷脱氨酶肌苷(Inosine)+氨离子(NH4+)，此反映过程生成的肌苷会在波长为265nm处显现，因此可以通过测定此波长处吸光度的大小直接反映腺苷脱氨酶活性的大小。然而，此方法无法用一般医院的可见光分析仪测定，而需要使用专门的紫外光分析仪，因此难以切实推广应用。
检索发现，申请号为03128092.7、申请日为2003.05.29、名称为《一种测定腺苷脱氨酶的试剂及其制法》的中国专利申请公开了应用酶反应产物氧化型烟酰氨辅酶配制的测定试剂。该发明所指的酶法测定试剂并不加入测定反应所需的还原型烟酰氨辅酶或其类似物，而加入其反应产物氧化型烟酰氨辅酶或其类似物，及其相应的生成还原型辅酶所需的酶和底物系统，通过在试剂内形成酶-底物-NAD或酶-底物-NADP等慢反应系统，将这类氧化型辅酶或其类似物缓慢循环还原为还原型烟酰氨辅酶或其类似物，当被还原的还原型烟酰氨辅酶或其类似物达到一定的浓度时，该发明所指的酶法试剂就可达到测定样本中腺苷脱氨酶及其同工酶活力的目的。该发明的特点在于为腺苷脱氨酶的测试提供一个内源合成腺苷脱氨酶反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的腺苷脱氨酶试剂。其缺点之一为，这个系统在生成反应所需要的还原型烟酰氨辅酶的同时，也抵消了部分腺苷脱氨酶试剂(腺苷脱氨酶偶联谷氨酸脱氢酶反应必定将还原型烟酰氨辅酶氧化成氧化型烟酰氨辅酶)的活性，造成试剂测试的准确性大大降低。其缺点之二是，该试剂在正式测试前必须事先反应一段时间，以便能够产生足够的还原型烟酰氨辅酶，这样一来就造成了缓不济急的结果，给测试带来很大的不便。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种可以克服以上现有技术缺点的腺苷脱氨酶活性的测定方法，同时给出用以实现该方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒。采用该试剂盒中的试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪上进行腺苷脱氨酶活性测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明测定腺苷脱氨酶活性的方法步骤如下1)、将样品与主要由腺苷、2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水腺苷三磷酸+谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸+谷氨酸5-磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
通常步骤2)将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，得出腺苷脱氨酶测定结果。
以上样品与试剂的混合比例按体积为1/10到1/250，以上过程的测定温度控制在常规的20℃到50℃范围，反应时间控制在常规的2-30分钟。
这种方法应用腺苷脱氨酶偶联谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶反应连续监测法。腺苷脱氨酶酶解腺苷产生氨，再通过偶联谷氨酸脱氢酶的作用，产生谷氨酸，通过谷氨酸激酶催化和ATP生成ADP，ADP再和磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下最后产生丙酮酸，再通过偶联乳酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算腺苷脱氨酶的活性大小。本发明的优点是反应利用了二个分子的还原型辅酶，也产生了二个分子的氧化型辅酶，因此吸光度有二倍的变化速度，灵敏度也就提高了二倍。
实现本发明方法的腺苷脱氨酶诊断试剂盒可以是单剂，包括缓冲液40--200mmol/l
腺苷 0.5--50mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l还原型辅酶0.15--0.3mmo/l腺苷三磷酸1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l谷氨酸脱氢酶 1000--50000U/l谷氨酸激酶1000--50000U/l丙酮酸激酶500--20000U/l乳酸脱氢酶1000--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)也可以将以上单剂配成如下双剂，更有利于消除内、外源氨、谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸污染试剂I缓冲液40--200mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l还原型辅酶0.15--0.3mmo/l腺苷三磷酸1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l谷氨酸脱氢酶 1000--50000U/l谷氨酸激酶1000--50000U/l丙酮酸激酶500--20000U/l乳酸脱氢酶1000--50000U/l稳定剂10--80％(总体积)试剂II缓冲液40--200mmol/l
腺苷0.5--50mmol/l稳定剂 10--50mmol/l双剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶等可以放在试剂II。试剂II其中的成分，腺苷也可以放在试剂I，如此可以形成多种配方，不在此一一详述。
还可以将试剂配成如下三试剂，不但更有利于消除内、外源氨、谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸污染，还更有利于试剂的稳定试剂I缓冲液 40--200mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l还原型辅酶 0.15--0.3mmo/l腺苷三磷酸 1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l稳定剂 10--50mmol/l试剂II缓冲液 40--200mmol/l谷氨酸脱氢酶 1000--50000U/l谷氨酸激酶 1000--50000U/l丙酮酸激酶 500--20000U/l乳酸脱氢酶 1000--50000U/l稳定剂 10--80％(总体积)试剂III缓冲液 40--200mmol/l
腺苷0.5--50mmol/l稳定剂 10--50mmol/l三剂的配方不仅限于上述配方，其中的试剂I的成分，2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸等可以放在试剂II或试剂III中。试剂II其中的成分，谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶等也可以放在试剂I或试剂III中，试剂III其中的成分，腺苷也可以放在试剂I或试剂II中，如此可以形成多种配方，不一一详述。
缓冲剂的pH范围可以是6.0～11.0。缓冲剂可以是三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、磷酸盐(Phosphate)缓冲液、三乙醇胺(Triethanolamine)缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(2-Amino-2-methyl-1-propanol)缓冲液、咪唑(Imidazole)缓冲液或双甘氨肽(Glycylglycine)缓冲液等，但不仅限于这些缓冲液。
以上还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH等还原型烟酰胺辅酶或其衍生物。
此外，为了减少各试剂成分之间的交叉影响、保持试剂的稳定性，以便长期储存，以上单剂、双剂的试剂I、试剂II或三剂的试剂I、试剂II、试剂III中通常加入稳定剂10～80％或者10～50mmol/l，稳定剂可以是乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸胺或盐等中的一种或一种以上。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下配方成分关系的本发明腺苷脱氨酶诊断试剂盒较为理想缓冲液 80--120mmol/l腺苷 2--10mmol/l
2-酮戊二酸酯 5--20mmol/l还原型辅酶0.2--0.3mmo/l腺苷三磷酸2--8mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 2--8mmol/l谷氨酸脱氢酶 5000--20000U/l谷氨酸激酶5000--20000U/l丙酮酸激酶1000--10000U/l乳酸脱氢酶5000--20000U/l稳定剂20--50％(总体积)由于本发明是完全利用酶学方法，酶解反应具有特异性高的特点，不易受到内、外源其他物质的干扰。酶法方法简便、易于操作。酶解反应的特异性促使测试结果精确。酶解反应都是在缓冲液条件下进行，没有污染环境问题。酶法方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。因此可以保证具有较高的测试准确性，更便于推广应用。
此外，本发明的显著特色之一是可以消除内、外源氨、谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸的污染，消除内、外源氨、谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸的作用发生在整个反应时间段的前半部分，在后半段时间受污染的内、外源氨、谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸已经被消耗殆尽，而在后半段时间测试腺苷脱氨酶活性所需要的氨、谷氨酸、腺苷二磷酸、丙酮酸都是产生于腺苷脱氨酶的活性。
具体实施例方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一(单剂)本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂盒包括缓冲液 80mmol/l
腺苷2mmol/l2-酮戊二酸酯5mmol/l还原型辅酶 0.2mmo/l腺苷三磷酸 2mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸2mmol/l谷氨酸脱氢酶5000U/l谷氨酸激酶 5000U/l丙酮酸激酶 1000U/l乳酸脱氢酶 5000U/l稳定剂 50％(总体积)在全自动生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水腺苷三磷酸+谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸+谷氨酸5-磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
本实施例应用腺苷脱氨酶偶联谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶反应连续监测法。腺苷脱氨酶酶解腺苷产生氨，再通过偶联谷氨酸脱氢酶的作用，产生谷氨酸，通过谷氨酸激酶催化和ATP生成ADP，ADP再和磷酸烯醇式丙酮酸在丙酮酸激酶的作用下最后产生丙酮酸，再通过偶联乳酸脱氢酶的作用，将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的速度，通过测量340nm处吸光度下降的速度，可以测算腺苷脱氨酶的活性大小。
实施例二(双剂)本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂有试剂I缓冲液100mmol/l2-酮戊二酸酯 12mmol/l还原型辅酶0.25mmo/l腺苷三磷酸5mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 5mmol/l谷氨酸脱氢酶 12000U/l谷氨酸激酶12000U/l丙酮酸激酶6000U/l乳酸脱氢酶12000U/l稳定剂50％(总体积)试剂II缓冲液100mmol/l腺苷 6mmol/l稳定剂20mmol/l
测定腺苷脱氨酶活性时，温度控制在30℃，反应时间15分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。
具体测定步骤为腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水腺苷三磷酸+谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸+谷氨酸5-磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
各反应步骤的反应时间控制在15分钟。
实施例三(三剂)本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂为三剂，有试剂I缓冲液 120mmol/l2-酮戊二酸酯 20mmol/l还原型辅酶 0.3mmo/l腺苷三磷酸 8mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 8mmol/l稳定剂 20mmol/l
试剂II缓冲液 120mmol/l谷氨酸脱氢酶 20000U/l谷氨酸激酶 20000U/l丙酮酸激酶 10000U/l乳酸脱氢酶 20000U/l稳定剂 50％(总体积)试剂III缓冲液 120mmol/l腺苷 10mmol/l稳定剂 20mmol/l在全自动生化分析仪上设定温度25℃，反应时间20分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。
具体测定步骤为腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水腺苷三磷酸+谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸+谷氨酸5-磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
各反应步骤的反应时间控制在20分钟。
实施例四本实施例的腺苷脱氨酶诊断试剂有试剂I缓冲液100mmol/l谷氨酸脱氢酶 10000U/l谷氨酸激酶10000U/l丙酮酸激酶6000U/l乳酸脱氢酶20000U/l稳定剂50％(总体积)试剂II缓冲液100mmol/l腺苷 3mmol/l2-酮戊二酸酯 8mmol/l还原型辅酶0.3mmo/l腺苷三磷酸2mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 2mmol/l稳定剂50％(总体积)在生化分析仪上设定温度37℃，反应时间10分钟，测试主波长340nm，测试副波长405nm以上，被测腺苷脱氨酶样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应，延迟时间1分钟，检测时间2分钟，理论K值-4180。
加入样品和试剂后，使之混合，发生以下反应腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水腺苷三磷酸+谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸+谷氨酸5-磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+辅酶将最终反应物置于生化分析仪器下，检测主波长340nm吸光度下降的速度，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内、外源物质的污染。
权利要求
1.一种测定腺苷脱氨酶活性的方法，步骤如下1)、将样品与主要由腺苷、2-酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶组成的试剂混合，使之发生如下原理的反应腺苷+水腺苷脱氨酶肌苷+氨离子氨离子+2-酮戊二酸酯+还原型辅酶谷氨酸脱氢酶谷氨酸+辅酶+水腺苷三磷酸+谷氨酸谷氨酸激酶腺苷二磷酸+谷氨酸5-磷酸腺苷二磷酸+磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸激酶腺苷三磷酸+丙酮酸丙酮酸+还原型辅酶乳酸脱氢酶乳酸+辅酶2)、检测最终反应物在主波长340nm吸光度下降的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
2.根据权利要求1所述测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征在于所述步骤2)为，将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或者半、全自动生化分析仪下，检测主主波长340nm吸光度下降的速度，测算出腺苷脱氨酶的活性大小。
3.根据权利要求1或2所述测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征在于温度控制在20℃到50℃范围，反应时间控制在2-30分钟。
4.根据权利要求1或2所述测定腺苷脱氨酶活性的方法，其特征在于被测样品与试剂的比例控制在1/10到1/250。
5.一种腺苷脱氨酶诊断试剂盒，由以下成分组成缓冲液 40--200mmol/l腺苷 0.5--50mmol/l2-酮戊二酸酯 1--50mmol/l还原型辅酶 0.15--0.3mmo/l腺苷三磷酸 1--10mmol/l磷酸烯醇式丙酮酸 1--10mmol/l谷氨酸脱氢酶 1000--50000U/l谷氨酸激酶 1000--50000U/l丙酮酸激酶 500--20000U/l乳酸脱氢酶 1000--50000U/l稳定剂 10--80％(总体积)
6.根据权利要求5所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于所述试剂配成单剂、双剂或三剂。
7.根据权利要求5或6所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于所述稳定剂为乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸铵或盐中的至少一种。
8.根据权利要求5或6所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于所述缓冲剂的pH范围是6.0～11.0，所述缓冲剂是三(羧甲基)氨基甲烷—盐酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液、2-氨基-2-甲基-1-丙醇缓冲液、咪唑缓冲液或双甘氨肽缓冲液中的一种。
9.根据权利要求5或6所述腺苷脱氨酶诊断试剂盒，其特征在于所述还原型辅酶是NADPH、NADH或thio-NADH还原型烟酰胺辅酶或其衍生物中的一种。
全文摘要
本发明涉及一种测定腺苷脱氨酶活性的方法，同时本发明还涉及腺苷脱氨酶诊断试剂盒，属于医学检验测定技术领域。该试剂盒包括缓冲液、腺苷、2－酮戊二酸酯、还原型辅酶、腺苷三磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸激酶、丙酮酸激酶、乳酸脱氢酶、稳定剂，通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶偶联反应，再将最终反应物置于生化分析仪下，检测主波长吸光度变化的情况(速度)，从而测算出腺苷脱氨酶的活性大小。采用本发明完全可以通过生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，不受内外源物质的污染，便于推广应用。
文档编号C12Q1/48GK1769482SQ200410065300
公开日2006年5月10日 申请日期2004年11月5日 优先权日2004年11月5日
发明者王尔中 申请人:王尔中