专利名称：一种建立由自然杀伤细胞介导的肝炎动物模型的方法
技术领域：
本发明属肝脏免疫学和实验动物学技术领域，具体涉及建立由自然杀伤细胞(NK细胞)介导的肝炎动物模型的方法。
背景技术：
肝炎是严重危害人民生命健康且死亡率较高的一种疾病，病因主要包括病毒感染、过度酒精摄入和服入化学毒物等造成肝脏实质细胞的破坏，其致病机制复杂。其中肝脏免疫损伤备受关注，特别是肝脏淋巴细胞参与的病理损伤已经成为多种肝炎发病机制中至关重要的事件。研究淋巴细胞如何参与肝脏损伤将有助于了解肝炎的致病机制，将促进肝脏疾病的预防及治疗。由于人体肝脏标本的缺乏以及体外研究的局限性，建立系列由免疫细胞介导的肝炎模型模拟人类肝脏疾病将是首选方法。美国《临床调查杂志》(Journal of Clinical Investigation，1992；90196-203)报道了由刀豆蛋白(concanavalin A)诱导的肝炎模型，该模型是将刀豆蛋白以15微克/克体重(μg/g.wt)静脉注射BALB/c小鼠(中文简称小白鼠)，所致的肝脏损伤是T细胞依赖的。美国《美国国家科学院进展》(Proceedings of the National Academy of Sciences.U S A.2000；975498-5503)报道了自然杀伤T细胞(NKT细胞)通过Fas配体(FasL)介导的细胞毒活性参与刀豆蛋白诱导的肝炎模型；美国《美国病理学杂志》(American Journal of Pathology.2000；1571671-1683)报道了巨噬细胞[肝脏内称作枯否氏(Kupffer)细胞]通过分泌肿瘤坏死因子(TNF)参与刀豆蛋白诱导的肝炎模型。除了刀豆蛋白诱导的肝炎模型外，美国《美国国家科学院进展》(1979；765939-5943)报道的半乳糖胺/脂多糖(Galactosamine/lipopolysaccharide)联合诱导的肝脏损伤也是常用的肝炎模型，美国《美国生理学杂志-胃肠道和肝脏生理学分册》(American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology.2001；280G720-8)报道该模型是枯否氏细胞依赖的。综上所述，到目前为止，T细胞、NKT细胞和枯否氏细胞在已经报道的肝炎模型中的作用已经得到清楚地阐明，而NK细胞在这些肝炎模型中的确切作用尚未见报道。
虽然美国《免疫学杂志》(Journal of Immunology，1983；1311531-1538)和美国《白细胞生物学杂志》(Journal of Leukocyte Biology，2004；76743-59)分别报道了NK细胞在小鼠巨细胞病毒(MCMV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的肝脏实质细胞损伤中的发挥重要作用，但是由于缺乏人体肝脏标本以及MCMV和HCV感染模型建立的繁琐，安全因素等限制，特别是由于缺乏合适的由NK细胞介导的肝炎模型，NK细胞在肝脏损伤中的详细致病机制仍未获得很大进展。因此，为了更好、更方便地研究NK细胞在肝炎免疫损伤中的作用，以及筛选有价值的护肝药物、疗效观察研究，有必要建立由NK细胞介导的肝炎动物模型，但迄今未见有关于由NK细胞介导的肝炎模型的报的报道。
发明内容
本发明提出一种建立由NK细胞介导的肝炎动物模型的方法，以建立一种由NK细胞介导的肝炎模型，克服现有免疫细胞相关的肝炎模型中没有NK细胞参与的不足。可用于肝脏NK细胞在肝炎致病机制中的作用研究以及护肝药物的筛选和疗效观察。
本发明建立由NK细胞介导的肝炎动物模型的方法，其特征在于包括以下步骤1、小鼠的准备从纯系BALB/c小鼠、纯系C57BL/6J小鼠(中文简称B6小鼠)、纯系严重联合免疫缺陷病(SCID)小鼠、纯系BALB/c背景的裸鼠(nude mice)或纯系BALB/c背景的分化抗原(CD)1d缺陷小鼠中选择至少一组小鼠；2、聚肌胞(Polyinosinic-Polycytidylic Acid，简称Poly IC)的准备用无菌PH7.0磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)配制终浓度为1毫克/毫升(mg/ml)的Poly IC溶液，封装备用，-20℃保存；3、对不同品系小鼠进行Poly IC腹腔或静脉注射将步骤2中所配制的1mg/ml PolyIC溶液，对每种品系小鼠分别进行腹腔注射或静脉注射Poly IC溶液，每克小鼠体重剂量范围为7.5-20μg；4、不同品系小鼠Poly IC注射后的处理摘取Poly IC注射后12-24小时小鼠的眼球，收集血液后分离血清，做血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测；同时收集小鼠肝脏标本，做苏木精/伊红(H&E)染色后，显微镜观察肝脏组织学变化若血清ALT和AST升高至60-200国际单位/升(IU/L)，肝脏组织学出现肝细胞点状坏死，局部炎性细胞浸润，则肝炎模型建立成功；若无上述现象则肝炎模型未建立成功。
本发明方法中一般采用6-8周BALB/c或C57BL/6J小鼠，因大于8周的小鼠肝脏损伤不明显。
本发明中的Poly IC注射途径可以采用腹腔注射，也可以采用静脉注射，在相同剂量下两者肝脏损伤无显著差异，但采用腹腔注射较方便。
本发明方法中常采用的两种品系BALB/c和C57BL/6J小鼠，在相同剂量Poly IC、相同注射途径时，C57BL/6J小鼠肝脏损伤程度较BALB/c小鼠损伤程度为重。
肝脏损伤的严重程度与Poly IC注射所用剂量有关，C57BL/6J小鼠接受7.5μg/g.wtPoly IC腹腔注射时，肝脏损伤较轻；C57BL/6J小鼠接受30μg/g.wt Poly IC腹腔注射时肝脏损伤较重，且死亡率增加；一般以Poly IC 20μg/g.wt注射C57BL/6J小鼠为最佳，小鼠死亡率小于5％。
在刀豆蛋白诱导的肝炎模型中，注射刀豆蛋白可以诱导BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠产生肝脏损伤，因为SCID小鼠和裸鼠缺乏T细胞，CD1d缺陷小鼠存在NKT细胞功能缺陷，所以刀豆蛋白不能诱导SCID小鼠、裸鼠和CD1d缺陷小鼠产生肝脏损伤，而本发明中注射Poly IC不但可以诱导BALB/c小鼠和C57BL/6J小鼠产生肝脏损伤，而且可以诱导SCID小鼠、裸鼠和CD1d缺陷小鼠产生肝脏损伤。
由于本发明采用的Poly IC是一种人工合成的双链核糖核酸(RNA)，能够刺激、活化NK细胞分泌干扰素。本发明的理论前提就是用大剂量Poly IC过度活化NK细胞，从而破坏肝脏实质细胞；而在刀豆蛋白诱导的肝炎模型中所使用的刀豆蛋白为T细胞刺激剂，主要是活化肝脏T细胞；在脂多糖诱导的肝炎模型中所使用的脂多糖可与枯否氏细胞表面的Toll样受体4(toll-like receptor 4，缩写TLR4)结合，活化枯否氏细胞。
从所诱导的肝炎模型的性质来看，由于本发明中所采用的Poly IC是病毒模拟物，其刺激机体产生的反应类似于病毒感染反应，结合所诱导的肝脏组织病理损伤特点，PolyIC诱导肝脏损伤类似人类病毒性肝炎，由于Poly IC诱导的肝脏损伤是由于自身过度活化的NK细胞破坏了肝脏实质细胞，所以这种损伤又具有自身免疫性肝炎的特点；刀豆蛋白诱导的肝炎模型类似人类自身免疫性肝炎，具有爆发性肝炎特征；脂多糖诱导的肝炎模型类似人类脓毒性肝炎(septic hepatitis)。从肝脏损伤严重程度来看，刀豆蛋白和脂多糖诱导的肝脏损伤病理损伤表现为大片状坏死(massive necrosis)，而Poly IC诱导的肝脏损伤病理损伤表现为点状坏死(spotty necrosis)；在刀豆蛋白和脂多糖诱导的肝炎模型中血清转氨酶峰值为3000-5000IU/L，而在Poly IC诱导的肝炎模型中血清转氨酶峰值为100-200IU/L。
在所述的不同纯系小鼠组别中，Poly IC注射后12-24小时，动物纳食差，毛发竖直、粘连；血清转氨酶升高，肝脏组织学出现肝细胞点状坏死，局部淋巴细胞浸润，肝内NK细胞比例及绝对数增加，由此可获得由NK细胞介导的肝炎小鼠模型。
本发明建立的由NK细胞介导的肝炎动物模型重复性好，临床症状明显，所用小鼠遗传背景清楚，而且操作方法方便、安全，适合大规模动物实验，可用于护肝药物的筛选及疗效观察。本发明中所述的Poly IC诱导的肝炎是由NK细胞介导的，克服了现有常见免疫细胞相关的肝炎模型没有NK细胞参与的不足，填补了国内外空白。
具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述。
实施例1本实施例建立由NK细胞介导的肝炎模型的方法，包括以下步骤1、不同纯系小鼠的准备至少选择一组BALB/c纯系小鼠，一组C57BL/6J纯系小鼠，一组纯系BALB/c背景的SCID小鼠，一组纯系BALB/c背景的裸鼠，一组纯系BALB/c背景的CD1d缺陷小鼠，一组NK细胞清除的C57BL/6J纯系小鼠。除比较Poly IC对不同年龄小鼠肝脏损伤的影响外，小鼠周龄均为6-8周，因为这个年龄建立的模型症状反应稳定，易于模拟人类疾病状况；除做性别差异比较试验外，其它所有实验均使用雌性小鼠；小鼠均为清洁级(SPF级)；饲养在专人看护的无病原体的动物饲养间内，饲料和水均要灭菌处理，防止病毒感染而产生假象；饲养温度22℃，湿度55％，12小时白/昼节律。所有实验均符合《(中国科技大学实验动物管理条例》。
2、Poly IC的准备选用购自美国Sigma公司的Polyinosinic-Polycytidylic Acid，用无菌PH7.0磷酸盐缓冲溶液配制成终浓度为1mg/ml，封装备用，-20℃保存。
3、检测C57BL/6J和BALB/c小鼠接受不同剂量Poly IC刺激后血清ALT和AST及肝脏组织病理学改变对BALB/c和C57BL/6J小鼠进行四种剂量(5.0μg/g.wt、7.5μg/g.wt、20μg/g.wt和30μg/g.wt)Poly IC腹腔注射，分别在Poly IC注射后0、12、18、24和48小时后，摘取小鼠眼球，收集血液分离血清后做血清ALT和AST检测，同时收集小鼠肝脏标本做H&E染色，每种剂量和时间点至少5只小鼠，数据以均数±标准差表示。
血清转氨酶测定方法(改良赖氏法)如下(1)、取96孔板，每个样品孔加5微升(μl)小鼠血清和25μl ALT或AST基质液，空白孔只加5μl生理盐水，充分混匀，37℃水浴30分钟。样品孔、系列浓度的标准曲线孔和空白孔均做三个平行实验孔，系列浓度的标准曲线孔按下表加样01 2 3 4 5标准液(μl)02.5 5.0 7.5 10.0 12.5生理盐水(μl) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0基质液(μl)25 22.5 20.0 17.5 15.0 12.5(2)、每孔加25μl 2，4-二硝基苯肼，充分混匀后空白孔加入25μl ALT基质液，充分混匀后，37℃水浴20分钟；(3)、每孔加入250μl 0.4摩尔/升氢氧化钠(NaOH)终止反应后，在酶标仪上490纳米波长测吸光值，按标准曲线计算血清样品转氨酶单位。
H&E染色具体步骤如下(1)、将石蜡包埋后肝脏组织块切成厚度为5um切片，脱蜡后，浸入PBS中水化5分钟；(2)、将该切片浸入苏木精液中染色10-30分钟后取出，用自来水冲洗，浮色2分钟；(3)、将该切片浸入0.1％盐酸酒精中分色数秒钟；再用自来水冲洗反蓝，直到切片颜色变蓝；(4)、将该切片浸入1％伊红进行复染30秒-2分钟，水洗数秒除去残余染料；(5)、按顺序将该切片经过70％、80％、90％、95％的酒精脱色和分化伊红颜色各1-2分钟；(6)、将该切片浸入100％酒精脱色15分钟，中间更换一次；(7)、将该切片浸入100％酒精+二甲苯(1∶1)中透明5-10分钟，再经过二甲苯I透明2-5分钟，二甲苯II透明5分钟；
(8)、用中性树胶进行封固后，显微镜下随机选择10个低倍视野观察点状坏死及炎性细胞浸润情况。
结果C57BL/6J和BALB/c小鼠接受5.0μg/g.wt Poly IC腹腔注射后12-48小时，血清ALT和AST均小于正常值28IU/L，H&E染色未见肝细胞坏死。
C57BL/6J和BALB/c小鼠接受7.5μg/g.wt Poly IC腹腔注射后12小时，血清ALT和AST分别轻度升高至49±5IU/L和51±6IU/L，注射后24小时ALT和AST达到高峰，分别为85±9IU/L和68±7IU/L；注射后48小时血清ALT和AST恢复正常；PolyIC腹腔注射后12-24小时，H&E染色显示可见少量肝细胞点状坏死和炎性细胞浸润。
C57BL/6J小鼠接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射后12小时血清ALT和AST分别升高至85±7IU/L和69±6IU/L；注射后24小时，血清ALT和AST达到高峰，分别升高至170±15IU/L和110±12IU/L；BALB/c小鼠接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射后18小时血清ALT达到高峰，为160±18IU/L；Poly IC腹腔注射后24小时血清AST达到高峰，为95±7IU/L；C57BL/6J和BALB/c小鼠Poly IC腹腔注射后48小时血清ALT和AST恢复正常；C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射后12-24小时，H&E染色显示有明显的肝细胞点状坏死及炎性细胞浸润，C57BL/6J小鼠病理损伤较BALB/c小鼠为重，该剂量两种小鼠死亡率均小于5％。
C57BL/6J和BALB/c小鼠接受30μg/g.wt Poly IC腹腔注射后12小时死亡率15-30％。
由于30μg/g.wt小鼠死亡率较高，所以，本发明方法中Poly IC所用剂量应该在7.5-20μg/g.wt范围；肝脏损伤呈剂量依赖性，相同剂量Poly IC腹腔注射时，C57BL/6J小鼠肝脏损伤较BALB/c小鼠为重；雌性和雄性小鼠对Poly IC所诱导的肝脏损伤无显著差别。所以，本发明中建立由NK细胞介导的肝炎模型的Poly IC最适注射剂量为20μg/g.wt，最佳观察时间为Poly IC注射后24小时。本发明中的Poly IC注射途径可以采用腹腔注射，也可以采用静脉注射，在相同剂量下两者肝脏损伤无显著差异，但采用腹腔注射较方便。
4、检测不同周龄C57BL/6J小鼠接受Poly IC刺激后血清ALT和AST选择6-8周和8-10周两种周龄C57BL/6J小鼠接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射，结果Poly IC注射后24小时，6-8周C57BL/6J小鼠血清ALT和AST分别为170±8IU/L和110±12IU/L，而8-10周C57BL/6J小鼠血清ALT和AST分别为50±7IU/L和70±8IU/L。6-8周C57BL/6J小鼠建立的模型症状反应稳定，易于模拟人类疾病状况，所以最佳小鼠周龄为6-8周。
5、观察C57BL/6J小鼠Poly IC刺激后肝脏NK细胞比例、绝对数变化及活化情况按Poly IC 20μg/g.wt腹腔注射C57BL/6J小鼠，注射后0，12，24和48小时，每个时间点处死5只小鼠后分别分离肝脏淋巴细胞，具体步骤如下
(1)、小鼠摘眼球放血后脱臼处死，摘取肝脏；(2)、剪碎肝脏组织，200目不锈钢筛网研磨过滤，1×PBS溶液冲洗，转至50ml离心管中；冰浴自然沉降10-20分钟，待自然沉降物界面明显后吸取上层液体，1500转/分钟离心15分钟后弃上清；(3)、用2ml40％Percoll溶液重悬沉淀，轻轻加于2ml70％Percoll溶液上，2400转/分钟离心30分钟后吸取两层Percoll溶液界面的白细胞层至20ml离心管中，加1×PBS溶液10ml后，2000转/分钟离心10分钟收集细胞，1×PBS溶液洗2次。
(4)、收集得到的细胞即肝脏淋巴细胞，3％冰醋酸稀释后显微镜下计数。
流式细胞术法检测上述分离的肝脏淋巴细胞中NK细胞比例数及NK细胞表面活化分子CD25和CD69的表达，具体步骤如下分离的淋巴细胞用正常大鼠血清封闭后，按1×106个细胞加入1μg异硫氰酸荧光素(FITC)标记的NK1.1、1μgCy5标记的CD3和藻红蛋白(PE)标记的CD25或CD69，4℃避光放置30分钟后，用冷PBS溶液洗涤3次后，上机检测，用WinMDI2.9软件分析，得出肝脏NK细胞比例数，与总数相乘即得出肝脏NK细胞绝对数，数据以均数表示。结果在正常C57BL/6J小鼠肝脏大约10.5％CD3-NK1.1+NK细胞，注射Poly IC显著提高了肝脏NK细胞比例，Poly IC注射后12小时NK细胞比例为20.8％，峰值在24小时为39.2％，48小时下降至16.9％，肝脏NK细胞绝对数也由刺激前的0.6×105个细胞/肝脏升至Poly IC注射24小时的7×105个细胞/肝脏，可见Poly IC注射后可显著增加肝脏内NK细胞绝对数。
正常肝脏NK细胞和T细胞表面只有少数细胞表达CD69分子，比例小于5％，PolyIC刺激12小时后几乎所有的NK细胞表面均表达CD69分子，在48小时仍维持较高水平，达80.71％；虽然T细胞也在24小时显示较强的活化，比例达95％以上，但是48小时活化显著下降至31％；肝脏NK细胞表面CD25分子在Poly IC刺激后也轻微升高至4.3％，而T细胞表面CD25分子则没有升高。这些结果提示Poly IC刺激后NK细胞活化较T细胞持久。
6、观察C57BL/6J小鼠清除NK细胞后注射Poly IC、刀豆蛋白或脂多糖后肝脏损伤变化情况由于目前国内外没有成功获得NK细胞基因敲除小鼠，NK细胞清除的C57BL/6J小鼠被用于阐明NK细胞在上述Poly IC诱导的肝炎模型中的作用，具体方法为每只C57BL/6J小鼠静脉注射50μgNK细胞特异性多克隆抗体抗唾液酸神经节苷脂M1(asialoganglioside M1，缩写AsGM1，日本Wako公司产)，注射后24小时，分离肝脏淋巴细胞，用流式细胞仪检测肝脏NK细胞比例，确定清除效果。结果AsGM1抗体注射后24小时肝内NK细胞比例低于1.0％，可视为NK细胞清除的小鼠。
NK细胞清除的C57BL/6J小鼠接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射后18小时，血清ALT和AST分别为60±5IU/L和70±6IU/L，而没有清除NK细胞的C57BL/6J小鼠血清ALT和AST分别为140±14IU/L和135±18IU/L；注射后24小时，NK细胞清除的C57BL/6J小鼠血清ALT和AST显著下降至50±5IU/L和60±5IU/L，而没有清除NK细胞的C57BL/6J小鼠血清ALT和AST分别为170±8IU/L和110±12IU/L。由于清除小鼠体内NK细胞可以减轻肝脏损伤程度，说明NK细胞是Poly IC诱导的肝炎模型中的主要效应细胞。
在对照组中，NK细胞清除的C57BL/6J小鼠接受静脉注射15μg/g.wt刀豆蛋白或腹腔注射10μg/g.wt脂多糖24小时后，小鼠肝脏均出现大片状坏死，炎性细胞浸润，血清ALT和AST显著升高达3000-5000IU/L，说明NK细胞不是刀豆蛋白和脂多糖诱导的肝炎模型的效应细胞。
7、观察不同品系小鼠Poly IC刺激后血清ALT和AST变化情况为了排除其它免疫细胞在上述的肝炎模型中的作用，采用了以下几种纯系小鼠缺乏T细胞和B细胞但NK细胞正常的SCID小鼠、缺乏T细胞的裸鼠和NKT细胞缺陷的CD1d缺陷小鼠，每组至少3只。上述几种小鼠分别接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射后24小时，检测血清转氨酶ALT和AST。结果为和BALB/c小鼠一样，20μg/g.wt Poly IC同样可以诱导SCID小鼠、裸鼠和CD1d缺陷小鼠肝脏损伤，SCID小鼠接受20μg/g.wt Poly IC腹腔注射24小时后。这些结果进一步证实所建立的Poly IC诱导的肝炎模型是由NK细胞介导的。
权利要求
1.一种建立由自然杀伤细胞介导的肝炎动物模型的方法，其特征在于包括以下步骤(1)、从纯系小白鼠、纯系B6小鼠、纯系严重联合免疫缺陷病小鼠、纯系裸鼠或纯系分化抗原1d缺陷小鼠中选择至少一组小鼠；(2)、用无菌PH7.0磷酸盐缓冲溶液配制终浓度为1毫克/毫升的聚肌胞溶液，封装备用，-20℃保存；(3)、对每种品系小鼠分别腹腔注射或静脉注射上述聚肌胞溶液，每克体重剂量范围为7.5-20μg；(4)、摘取聚肌胞注射后12-24小时小鼠的眼球，收集血液后分离血清，做血清丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶检测；同时收集小鼠肝脏标本，做苏木精/伊红染色后，显微镜观察肝脏组织学变化血清丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶升高至60-200国际单位/升，肝脏组织学出现肝细胞点状坏死，局部炎性细胞浸润，则肝炎模型建立成功。
全文摘要
本发明建立由自然杀伤细胞(NK细胞)介导的肝炎模型的方法，特征是选择一种病毒模拟物聚肌胞(Poly IC)以7.5－20微克/克体重剂量，通过腹腔注射或静脉注射6－8周龄纯系BALB/c或C57BL/6J小鼠，Poly IC注射后12－24小时血清丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶显著升高，肝脏组织学出现肝细胞点状坏死，局部炎性细胞浸润，肝内NK细胞比例及绝对数升高。该模型的建立为系统研究肝炎的发病机制以及筛选有价值的护肝药物及疗效观察提供有力的工具。
文档编号C12N5/06GK1624112SQ20041006562
公开日2005年6月8日 申请日期2004年11月5日 优先权日2004年11月5日
发明者田志刚, 董忠军, 魏海明 申请人:中国科学技术大学