专利名称：α－1－磷酸化2－脱氧－2－氟阿拉伯糖苷和2′－脱氧－2′－氟－β－D－阿糖核苷的制 ...的制作方法
技术领域：
本发明涉及α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷和将其作为中间体的2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖核苷的制造方法。
背景技术：
近年来，将2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖核苷(2′F-ANA)作为构成成分的反义寡核苷酸由于其生物活性而非常受到关注(专利文献1和非专利文献1、2)。
2′F-ANA是已知化合物，其化学合成法已经有报道(专利文献2，非专利文献3、4)。具体来说，由于难以从天然的核苷衍生得到2′F-ANA，因此通过1-卤代糖衍生物和核酸碱基的取代反应(缩合反应)来合成。但是，反应液中除了β体之外还混杂了α体，为了得到高纯度的2′F-ANA需要繁复的柱层析法等纯化处理。
其中，2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖嘧啶核苷可以比较容易地合成，但是对于2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖嘌呤核苷，由于反应液中混杂了复杂的异构体(α体、β体、7位体、9位体等)，因此目前还未建立高效的合成法。
作为克服上述化学合成法的缺点的方法之一，提出了酶合成法。例如，可以使2-脱氧核糖的1位磷酸化糖的异构化反应的平衡倾斜，合成α-1-磷酸化糖衍生物，接着使用核苷磷酸化酶，制造目标核苷(专利文献3)。
然而，根据本发明者所知，1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷相对稳定，不易使α体和β体的平衡向一个方向倾斜，难以将上述酶法用于2′F-ANA的制造。
另一方面，还报道有使用核苷磷酸化酶由2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖嘧啶核苷和嘌呤碱合成2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖嘌呤核苷的酶合成方法(专利文献4)。
专利文献1国际公开第99/67378号小册子专利文献2日本专利特公平7-23395号公报专利文献3日本专利特开2002-205996号公报专利文献4日本专利特开昭63-258891号公报非专利文献1Biochemistry，41，3457(2002).
非专利文献2Bioorg.Med.Chem.Lett.，12，2651，(2002).
非专利文献3J.Org.Chem.，50，3644(1985).
非专利文献4J.Org.Chem.，53，85(1988).
发明的揭示发明要解决的课题然而，上述酶法中，(i)使用化学合成的昂贵的2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖嘧啶核苷作为原料，(ii)目标产物2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖嘌呤核苷的合成效率极差(相对于碱基的收率不足15％)，(iii)必须使用两种核苷磷酸化酶，所以未必是令人满意的方法。作为上述方法的低收率的主要原因，可以认为是使用核苷磷酸化酶的2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖嘧啶核苷的磷酸分解反应效率低。
因此，本发明的目的在于提供简便且高立体选择性、高收率地制造难以高收率且立体选择性合成的2′F-ANA、特别是2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖嘌呤核苷的方法。本发明的目的特别是在于提供能够以工业规模、简便且高纯度地制造以往极难合成的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鸟嘌呤。
解决课题的方法本发明者鉴于所述情况反复认真研究后，得到以下发现，从而完成了本发明(i)1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷意外地在水溶液中稳定，其α体可以充分用作核苷磷酸化酶的底物；(ii)通过将式(III)所示的2-脱氧-2-氟阿拉伯糖衍生物水解、磷酸化，可以立体选择性地得到α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷；(iii)通过在强碱的存在下将式(III)所示的化合物磷酸化，可以得到与不成为核苷磷酸化酶的底物的β-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷相比、成为底物的α体的生成比例更高的αβ体化合物；(iv)通过不使用2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖嘧啶核苷，而使用1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷(α体或αβ体化合物)作为原料，不用两种核苷磷酸化酶，就可以高收率地得到2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖核苷。
即，本发明提供式(I)
所示的α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷或其盐。
此外，本发明还提供式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷的立体选择性的制造方法，其特征在于，将式(III) (式中，R1表示羟基的保护基，X表示离去基团。)所示的2-脱氧-2-氟-阿拉伯糖衍生物水解，立体选择性地得到式(IV) (式中，R1与前述定义相同。)所示的α-1-羟基体，将式(IV)的化合物磷酸化，制得式(V) (式中，R1与前述定义相同，R2表示氢原子或磷酸残基的保护基。)所示的α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷衍生物，接着将羟基和/或磷酸残基的保护基脱保护。
此外，本发明还提供式(V′)
所示的1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ体混合物的制造方法，其特征在于，在强酸盐的存在下，将式(III) (式中，R1表示羟基的保护基，X表示离去基团。)所示的2-脱氧-2-氟-阿拉伯糖衍生物磷酸化，得到式(V) (式中，R1与前述定义相同，R2表示氢原子或磷酸残基的保护基。)所示的1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷衍生物的αβ体混合物，接着将羟基和/或磷酸残基的保护基脱保护。
此外，本发明还提供式(II) (式中，B表示碱基。)所示的2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖核苷的制造方法，其特征在于，使核苷磷酸化酶与式(I)
所示的α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷或式(V′) 所示的1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ体混合物及碱基作用。
此外，本发明还提供式(VII) 所示的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鸟嘌呤的制造方法，其特征在于，使核苷磷酸化酶与式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷或式(V′)
所示的1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ体混合物及2-氨基-6-取代嘌呤作用，得到式(VI) (式中，Y表示取代基。)所示的2-氨基-6-取代-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤，将其用水解酶处理。
另外，本发明还提供式(VII) 所示的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鸟嘌呤的制造方法，其特征在于，使核苷磷酸化酶及核苷酶与式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷或式(V′)
所示的1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ体混合物及鸟嘌呤核苷5′-单磷酸作用。
发明的效果若采用本发明，则可以简便且高立体选择性、高收率地制造难以高收率且立体选择性合成的2′F-ANA、特别是2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖嘌呤核苷。特别是，若采用本发明，则能够以工业规模、简便且高立体选择性、高收率地制造以往极难合成的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鸟嘌呤。
因此，本发明的α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷或其盐、以及将其作为关键中间体的本发明的制造方法在反义药品的工业制造中是有用的。
实施发明的最佳方式作为式(I)所示的化合物、即化合物(I)的盐，没有特别限定，可以例举例如碱金属盐(例如钠盐、钾盐等)、碱土金属盐(例如钙盐、镁盐等)、有机碱盐(例如三甲胺盐、三乙胺盐、吡啶盐、甲基吡啶盐、二环己基胺盐等)、铵盐等，较好是钠盐。
以下，对化合物(I)的代表性的制造方法进行说明。
合成法1(α体)将化合物(III)的1位水解，立体选择性地得到化合物(IV)的α体，将化合物(IV)的1位羟基磷酸化制成化合物(V)，将化合物(V)的羟基和/或磷酸残基的保护基脱保护。
(式中，R1表示羟基的保护基，X表示离去基团，R2表示氢原子或磷酸残基的保护基。)式(III)～式(V)中，作为R1所表示的羟基的保护基，可以例举甲酰基、乙酰基、特戊酰基、苯甲酰基等碳原子数1～10的酰基，苄基、对甲氧基苄基等碳原子数7～20的芳烷基，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基等碳原子数1～20的烷基甲硅烷基。其中，较好是碳原子数1～10的酰基，特别好是苯甲酰基。
作为X所表示的离去基团，可以例举氯原子、溴原子、碘原子等卤素原子，甲磺酰基、甲苯磺酰基、三氟甲烷磺酰基，甲酰基、乙酰基、特戊酰基、苯甲酰基等碳原子数1～10的酰基等，较好是卤素原子，特别好是溴原子。
作为R2所表示的磷酸残基的保护基可以例举烯丙基或可具有取代基的烷基。作为烷基，可以例举例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基等碳原子数1～10的烷基。作为烷基的取代基，可以例举例如2-氰乙基、2-三甲基硅烷基乙基、苄基等。
化合物(III)可以按照公知的方法(J.Org.Chem.，50，3644(1985)、J.Org.Chem.，53，85(1988)、日本专利特公平7-23395号公报)进行合成。
化合物(III)1位的水解反应于乙腈、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇、四氢呋喃(THF)等有机溶剂中，在三丁胺、三乙胺等碱的存在下，相对于1摩尔化合物(III)使用1摩尔以上的碱和水进行即可。反应温度较好是0～100℃，反应时间较好是1～24小时左右。根据需要，可以-边搅拌-边使反应进行。
这样得到的化合物(IV)根据需要通过常规的糖的纯化方法，例如使用有机溶剂的分配、各种层析法处理来进行纯化，再供于下面的磷酸化反应即可。
化合物(IV)1位的磷酸化反应按公知的方法进行即可。可以例举例如使用五价磷酸化剂进行磷酸化的方法、使用三价磷酸化剂进行亚磷酸化后进行氧化的方法。
作为使用五价磷酸化剂的方法，具体来说，于乙腈、THF、二氯甲烷等有机溶剂中，在三丁胺、三乙胺、吡啶等碱的存在下，相对于1摩尔化合物(IV)使用1～10摩尔磷酰氯、卤化单烷基膦酰、卤化二烷基膦酰等磷酸化剂即可。反应温度较好是-78～120℃，反应时间较好是1～24小时左右。
作为使用三价磷酸化剂的方法，具体来说，于乙腈、THF、二氯甲烷、1，4-二烷等有机溶剂中，在三丁胺、三乙胺、吡啶等碱的存在下，与三氯化磷、氯磷酰肼(chlorophosphordiamidite)等亚磷酸化剂反应，接着与氰乙醇、烯丙醇等醇类反应形成亚磷酸盐，将其使用间氯过苯甲酸、叔丁基过氧化物、过氧化氢等氧化剂进行氧化即可。相对于1摩尔化合物(IV)使用1～10摩尔磷酸化剂、醇类和氧化剂即可。反应温度较好是-78～120℃，反应时间较好是1～24小时左右。
这样得到的化合物(V)根据需要通过常规的糖的纯化方法，例如使用有机溶剂的分配、各种层析法处理来进行纯化，再供于下面的脱保护反应即可。
化合物(V)的羟基和/或磷酸残基的保护基的除去根据所使用的保护基适当选择酸处理、碱处理、催化还原、氟化铵处理等通常使用的方法来进行即可。
通过上述的方法得到的化合物(I)根据需要通过常规的糖的纯化方法，例如使用有机溶剂的分配、各种层析法处理、结晶化等来进行纯化，再供于下面的酶反应。
合成法2(αβ体混合物)在强酸盐的存在下，将化合物(III)用磷酸化剂处理制成保护体αβ体混合物(V)即可。
磷酸化反应于乙腈、二氯甲烷、DMF、甲基乙基酮等有机溶剂中，在三丁胺、三乙胺等碱的存在下，相对于1摩尔化合物(III)使其与1摩尔以上的正磷酸、磷酸单酯、磷酸二酯等磷酸衍生物反应即可。反应温度较好是-78～120℃，反应时间较好是1～24小时左右。
磷酸化时，强酸盐特别好是相对于1摩尔化合物(III)添加0.1～20摩尔左右产生卤素离子或硝酸根离子的强酸盐。如表1所示，通过添加强酸盐可以优先于β体合成α体。
作为产生卤素离子或硝酸根离子的强酸盐，可以例举碘化四正丁铵、碘化四乙铵、溴化四正丁铵、溴化四乙铵、氯化四正丁铵、氯化四乙铵等卤素离子的铵盐或金属盐，硝酸四正丁铵等硝酸根离子的铵盐或金属盐。其中，较好是碘化四正丁铵、溴化四正丁铵、氯化四正丁铵、氯化四乙铵、硝酸四正丁铵。
得到的化合物(V)根据需要通过常规的糖的纯化方法，例如使用有机溶剂的分配、各种层析法处理来进行纯化，再供于下面的脱保护反应。
通过除去化合物(V)的羟基和/或磷酸残基的保护基，可以得到化合物(I)中混杂其β体的αβ体混合物(V′)。
αβ体混合物(V′)的α/β比为1.9～2.6。保护基除去的条件根据所使用的保护基适当选择酸处理、碱处理、催化还原、氟化铵处理等通常使用的方法来进行即可。
通过上述的方法得到的αβ体混合物根据需要通过常规的糖的纯化方法，例如使用有机溶剂的分配、各种层析法处理、结晶化等来进行纯化，再供于下面的酶反应。
接着，对于使核苷磷酸化酶同化合物(I)或αβ体混合物(V′)和碱基(B)作用、制造式(II)所表示的2′F-ANA的方法进行说明。
作为反应所使用的核苷磷酸化酶，只要是可以合成化合物(II)，没有特别限定，特别好是嘌呤核苷磷酸化酶。这样的核苷磷酸化酶、包括其制备方法是公知的，用该公知的方法可以容易地进行制备。具体来说，核苷磷酸化酶不局限于特定的来源，动物来源、植物来源、微生物来源等所有来源的都可以使用。从制备的简便性等角度来看，较好是微生物来源的核苷磷酸化酶。此外，所用的核苷磷酸化酶的基因被克隆了的情况下，也可以使用该克隆的核苷磷酸化酶基因，通过常规方法以大肠杆菌等作为宿主大量生产，通过该重组菌制备该酶。
这样的核苷磷酸化酶只要具有该活性可以是任何形态。具体可以例举微生物菌体、该菌体的处理物、由该处理物得到的酶制备产物等。
微生物菌体的制备可以通过使用该微生物可繁殖的培养基、以常规方法培养后用离心分离等收集菌体的方法来进行。具体来说，如果以属于芽孢杆菌属或大肠杆菌类的细菌作为例子来说明，则可以使用肉汤培养基、LB培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％食盐)、2xYT培养基(1.6％胰蛋白胨、1％酵母提取物、0.5％食盐)等作为培养基，在该培养基中接种种菌后，在约30～50℃下，根据需要一边搅拌一边培养约10～50小时左右，将得到的培养液离心分离收集微生物菌体，从而制备具有核苷磷酸化酶活性的微生物菌体。
作为微生物的菌体处理物，可以例举将上述微生物菌体根据机械破坏(通过旋转搅拌器(whirling blender)、细胞破碎仪(French press)、均化器、研钵等)、冷冻溶解、自体消化、干燥(通过冷冻干燥、风干等)、酶处理(通过溶菌酶等)、超声波处理、化学处理(通过酸、碱处理等)等一般的处理方法处理得到的菌体的破碎物或者菌体的细胞壁或细胞膜的变性物。
作为酶制备产物，可以使用由上述菌体处理物对具有核苷磷酸化酶活性的组分施以通常的酶纯化方法，例如盐析处理、等电点沉淀处理、有机溶剂沉淀处理、透析处理、各种层析法处理等，从而得到的粗酶或纯化酶。
在反应液中添加的碱基(B)根据合成的目标使用市场上销售的碱基、用公知的方法制备的碱基等即可。
作为碱基(B)，较好是嘌呤碱基或其衍生物。作为嘌呤碱基的衍生物，可以例举具有选自卤素原子、烷基、卤代烷基、链烯基、卤代链烯基、炔基、氨基、烷氨基、羟基、羟氨基、氨氧基、烷氧基、巯基、烷基巯基、芳基、芳氧基和氰基的取代基的化合物。取代基的数量和位置没有特别限定。
作为卤素原子，可以例举氯原子、氟原子、碘原子、溴原子。
作为烷基，可以例举甲基、乙基、正丙基等碳原子数1～6的烷基。
作为卤代烷基，可以例举氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、溴甲基、溴乙基等由上述卤素原子取代的上述碳原子数1～6的烷基。
作为链烯基，可以例举乙烯基、烯丙基等碳原子数2～7的链烯基。
作为卤代链烯基，可以例举溴乙烯基、氯乙烯基等由上述卤素原子取代的碳原子数2～7的链烯基。
作为炔基，可以例举乙炔基、丙炔基等碳原子数2～7的炔基。
作为烷氨基，可以例举甲氨基、乙氨基、二乙氨基、二乙氨基等由上述碳原子数1～6的烷基取代的氨基。
作为烷氧基，可以例举甲氧基、乙氧基、正丙氧基等碳原子数1～7的烷氧基。
作为烷基巯基，可以例举甲基巯基、乙基巯基等具有上述碳原子数1～6的烷基的烷基巯基。
作为芳基，可以例举苯基，甲苯基、乙苯基等由上述碳原子数1～6的烷基取代的烷基苯基，甲氧苯基、乙氧苯基等由上述碳原子数1～6的烷氧基取代的烷氧基苯基，二甲氨基苯基、二乙氨基苯基等由上述碳原子数1～6的烷氨基取代的烷氨基苯基，氯苯基、溴苯基等由卤素原子取代的卤代苯基等。
作为芳氧基，可以例举具有上述芳基的基团。可以例举例如苯氧基，甲苯氧基、乙苯氧基等由上述碳原子数1～6的烷基取代的烷基苯氧基，甲氧苯氧基、乙氧苯氧基等由上述碳原子数1～6的烷氧基取代的烷氧基苯氧基，二甲氨基苯氧基、二乙氨基苯氧基等由上述碳原子数1～6的烷氨基取代的烷氨基苯氧基，氯苯基、溴苯基等由卤素原子取代的卤代苯氧基等。
作为嘌呤碱基及其衍生物，可以例举例如嘌呤、6-氨基嘌呤(腺嘌呤)、6-羟基嘌呤(次黄嘌呤)、6-氟嘌呤、6-氯嘌呤、6-甲氨基嘌呤、6-二甲氨基嘌呤、6-三氟甲氨基嘌呤、6-苯甲酰氨基嘌呤、6-乙酰氨基嘌呤、6-羟氨基嘌呤、6-氨氧基嘌呤、6-甲氧基嘌呤、6-乙酰氧基嘌呤、6-苯甲酰氧基嘌呤、6-甲基嘌呤、6-乙基嘌呤、6-三氟甲基嘌呤、6-苯基嘌呤、6-巯基嘌呤、6-甲基巯基嘌呤、6-氨基嘌呤-1-氧化物、6-羟基嘌呤-1-氧化物、2-氨基-6-羟基嘌呤(鸟嘌呤)、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基-6-碘嘌呤、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-巯基嘌呤、2-氨基-6-甲基巯基嘌呤、2-氨基-6-羟氨基嘌呤、2-氨基-6-甲氧基嘌呤、2-氨基-6-苯甲酰氧基嘌呤、2-氨基-6-乙酰氧基嘌呤、2-氨基-6-甲基嘌呤、2-氨基-6-环丙基氨基甲基嘌呤、2-氨基-6-苯基嘌呤、2-氨基-8-溴嘌呤、6-氰基嘌呤、6-氨基-2-氯嘌呤(2-氯腺嘌呤)、6-氨基-2-氟嘌呤(2-氟腺嘌呤)、6-氨基-3-脱氮嘌呤、6-氨基-8-氮杂嘌呤、2-氨基-6-羟基-8-氮杂嘌呤、6-氨基-7-脱氮嘌呤、6-氨基-1-脱氮嘌呤、6-氨基-2-氮杂嘌呤等。
2′F-ANA可以如下进行合成在Tris盐酸缓冲液、磷酸缓冲液等缓冲液中，向化合物(I)或其αβ体混合物(V′)和上述碱基(B)添加约5单位/mL以上、较好是约50单位/mL以上的核苷磷酸化酶。化合物(I)或其αβ体混合物(V′)的使用量较好是约1～200mM，特别好是10～100mM。相对于化合物(I)的碱基(B)的使用量较好是在1当量以上，特别好是约2～5摩尔倍当量左右。反应时间较好是20～70℃，特别好是40～60℃。反应时间较好是约1～100小时左右。根据需要，可以一边搅拌一边使反应进行。
接着，对使用上述制造方法的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鸟嘌呤、即混合物(VII)的制造进行具体说明。
在化合物(I)或αβ体混合物(V′)和2-氨基-6-取代嘌呤中添加与上述同样的核苷磷酸化酶，得到化合物(VI)，将其用水解酶处理即可。
作为反应中所使用的2-氨基-6-取代嘌呤，只要是2-氨基-6-取代嘌呤的取代基Y为可水解的基团的嘌呤衍生物，没有特别限定。作为取代基Y，可以例举氯原子、溴原子、碘原子等卤素原子，氨基，羟基，巯基，甲基巯基，羟氨基，甲氧基，苯甲酰氧基，乙酰氧基等。作为2-氨基-6-取代嘌呤的具体例子，可以例举2-氨基-6-卤代嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基-6-羟基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2-氨基-6-碘嘌呤、2-氨基-6-巯基嘌呤、2-氨基-6-甲基巯基嘌呤、2-氨基-6-羟氨基嘌呤、2-氨基-6-苯甲酰基嘌呤、2-氨基-6-乙酰氧基嘌呤，特别好是2，6-二氨基嘌呤。
作为水解酶，只要具有可以通过水解2-氨基-6-取代嘌呤或具有它的核苷的6位的取代基、生成2-氨基-6-氧嘌呤(鸟嘌呤)或具有它核苷的活性，没有特别限定。作为这样的水解酶，可以例举脱氨基酶，特别好是腺苷脱氨基酶。
使用水解酶的脱氨反应，具体来说，在磷酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液等缓冲液中，添加约5单位/mL以上、较好是约30单位/mL以上的水解酶即可。反应温度较好是20～70℃，反应时间较好是约1～100小时左右。根据需要，可以-边搅拌-边使反应进行。
使用水解酶的脱氨反应可以在上述使用核苷磷酸化酶的反应之后进行，或者同时进行。
此外，化合物(VII)也可以通过在化合物(I)或αβ体混合物(V′)和5′-单磷酸中添加核苷磷酸化酶及核苷酶来制造。反应可以如下进行实施在Tris盐酸缓冲液、磷酸缓冲液等缓冲液中，各添加约5单位/mL以上的核苷磷酸化酶及核苷酶，在20～70℃下，反应约1～100小时左右，根据需要进行搅拌。
作为反应中所使用的核苷酶，只要具有可以将核苷酸水解成核酸碱基和糖磷酸的活性即可，具体可以例举次黄嘌呤核苷酸核苷酶(Bull.Agric.Chem.Soc.Japan，23，281-288(1959))。可以使用与上述同样的核苷磷酸化酶。
这样得到的化合物(VII)可以通过通常的核苷分离纯化方法，例如离子交换层析法、吸附层析法、结晶化等来进行分离纯化。
实施例以下，通过合成例对本发明更具体地进行说明，但是本发明并不限定于以下的实施例的范围内。
合成例13，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝H]将磷酸(5.0g，51mmol)、分子筛4A(3.6g)悬浮于乙腈(18mL)中，在0℃下加入三正丁基胺(24.3mL，102mmol)，于室温下搅拌1小时。在室温下加入碘化四正丁基铵(15.7g，42.5mmol)，10分钟后，再滴入3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-溴化物[式IIIR1＝Bz，X＝Br](3.59g，8.5mmol)的乙腈溶液(36mL)。在室温下搅拌2小时后，过滤除去不溶物。将滤液在减压条件下浓缩，用乙酸乙酯(150mL)对残渣进行萃取。将有机层用0.1N盐酸洗涤3次，用无水硫酸钠干燥，将溶剂蒸发除去。
对标题化合物用HPLC[UV230nm，分析柱SHISEIDO CAPCELL PAK NH2(4.6mmI.D.×250mm)，柱温度30℃，移动相60mM KH2PO4(50％)-乙腈(50％)，pH4.0(H3PO4)，流速1.0mL/min]进行分析，以面积％算出1-磷酸衍生物的生成率和α/β比。生成率为60.3％，α/β＝3.4。
将残渣溶解于甲基乙基酮(90mL)，加入磷酸(13.3g)、分子筛4A(3.6g)，在80℃下搅拌2小时。过滤除去不溶物后，将溶剂蒸发除去。用乙酸乙酯(150mL)对残渣进行萃取。将有机层用水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，将溶剂蒸发除去。HPLC分析生成率为60.5％，α/β＝4.9。
再将残渣用反相ODS层析法(600mL，5～40％乙腈-水)纯化，作为与β体的混合物得到2.91g(41％)标题化合物(其中，相对于1摩尔标题化合物含有0.6摩尔的三正丁铵和0.1摩尔的四正丁铵)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz)δppm8.07-8.02(4H，m)，7.51-7.36(6H，m)，5.99(1H，dd，J＝5.6，8.6Hz)，5.46(1H，dd，J＝4.3，22.9Hz)，5.30(1H，d，J＝49.1Hz)，4.74-4.57(3H，m).
合成例23，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝H]在1.0M的磷酸/三正丁胺的乙腈溶液(0.75mL)中加入分子筛4A(50mg)以及以下的表1中所示的强酸盐(各0.6mmol)，在室温下搅拌40分钟。向其中滴入3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-溴化物[式IIIR1＝Bz，X＝Br](50mg，0.12mmol)的乙腈溶液(0.5mL)。
HPLC分析保留时间，α体为3.8分，β体为4.4分。
其结果示于表1。由表1可知，通过添加强酸盐，α体的生成比例提高。
合成例33，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿拉伯糖[式IVR1＝Bz]将3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-溴化物[式IIIR1＝Bz，X＝Br](2.40g，5.7mmol)溶解于DMF(50mL)，加入三乙胺(4.8mL，34.2mmol)、水(3.1mL，171mmol)，在室温下搅拌30分钟。在减压条件下蒸发除去溶剂，用乙酸乙酯对残渣进行萃取，将有机层用水、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水进行洗涤。再用无水硫酸钠干燥后，将溶剂蒸发除去。将残渣用硅胶柱层析法(150g，0～5％甲醇-三氯甲烷)纯化，得到1.85g(90％)标题化合物。
1H-NMR(CDCl3，500MHz)δppm8.08-8.01(4H，m)，7.63-7.41(6H，m)，5.70(1H，dd，J＝3.6，10.2Hz)，5.50(1H，dd，J＝4.3，22.0Hz)，5.18(1H，d，J＝49.1Hz)，4.77-4.60(3H，m)，2.89(1H，t，J＝3.4Hz).
合成例43，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-(二-2-氰乙基)磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝CH2CH2CN]将3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿拉伯糖[IVR1＝Bz](1.01g，2.8mmol)用乙腈共沸脱水2次，溶解于乙腈(20mL)，加入三乙胺(1.2mL，8.4mmol)和二(二异丙氨基)氯膦(1.69g，5.6mmol)，在室温下搅拌1小时。向其中加入2-氰乙醇(1.9mL，28mmol)和1H-四唑(0.98g，14mmol)，在室温下搅拌1.5小时。再加入70％叔丁基过氧化氢溶液(2.5mL)，在室温下搅拌30分钟。用乙酸乙酯(100mL)对残渣进行萃取，将有机层用水洗涤2次，用硫代硫酸钠水溶液、饱和碳酸氢钠水溶液和饱和食盐水分别洗涤1次。用无水硫酸钠干燥后，将溶剂在减压条件下蒸发除去。将残渣用硅胶柱层析法(70g，50～100％乙酸乙酯-正己烷)纯化，得到0.78g(51％)标题化合物。
1H-NMR(CDCl3，500MHz)δppm8.07-8.05(4H，m)，7.65-7.43(6H，m)，6.14(1H，dd，J＝4.2，8.3Hz)，5.56(1H，dd，J＝3.9，20.9Hz)，5.34(1H，d，J＝48.4Hz)，4.82(1H，q，J＝3.9Hz)，4.78(1H，dd，J＝3.5，12.2Hz)，4.68(1H，dd，J＝4.6，12.2Hz)，4.37-4.27(4H，m)，2.78-2.68(4H，m).
合成例53，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝H]将3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-(二-2-氰乙基)磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝CH2CH2CN](85mg，0.16mmol)溶解于二氯甲烷(3mL)，加入DBU(0.25mL，1.6mmol)，在室温下搅拌10分钟。向其中加入氯三甲基硅烷(0.1mL，0.8mmol)，在室温下搅拌1小时。用三氯甲烷对反应液进行萃取，将有机层用0.1N盐酸洗涤后，用无水硫酸钠干燥。将残渣溶解于乙酸乙酯(0.5mL)，向其中滴加正己烷(5mL)。除去上清液，将残渣进行真空干燥，得到71mg(89％)标题化合物(其中，相对于1摩尔标题化合物，含有0.4摩尔的DBU)。
1H-NMR(CDCl3，500MHz)δppm8.07-8.02(4H，m)，7.51-7.36(6H，m)，5.99(1H，dd，J＝5.6，8.6Hz)，5.46(1H，dd，J＝4.3，22.9Hz)，5.30(1H，d，J＝49.1Hz)，4.74-4.57(3H，m).
合成例62-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯二钠盐[式I]将合成例4中合成的3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-(二-2-氰乙基)磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝CH2CH2CN](590mg，1.08mmol)溶解于甲醇-THF(1∶1，6mL)，加入28％氨水(6mL)，在室温下搅拌1小时。将溶剂蒸发除去后，加入28％氨水(10mL)，在室温下搅拌-晚。将溶剂蒸发除去，向残渣中加入水(20mL)，将其用乙酸乙酯(20mL)洗涤。回收水层，制成100mL水溶液。使其通过阳离子交换树脂(三菱化学公司制，PK216，Na型，30mL)，将水蒸发除去，得到273mg(99％)标题化合物。
1H-NMR(D2O，500MHz)δppm5.70(1H，dd，J＝6.9，9.8Hz)，5.02(1H，d，J＝50.5Hz)，4.26-4.17(2H，m)，3.87(1H，dd，J＝3.2，12.4Hz)，3.74(1H，dd，5.3，12.4Hz).
合成例72-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式I]将合成例1中合成的3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝H](2.8g，作为α体3.38mmol)溶解于甲醇(70mL)，加入28％氨水(70mL)，在室温下搅拌1.5小时。再加入28％氨水(70mL)，在室温下搅拌一晚。在减压条件下将溶剂蒸发除去，将残渣溶解于水(50mL)中。将其用乙酸乙酯(100mL)洗涤2次，回收水层。在减压条件下浓缩水，用膜滤器(PTFE，0.45μm)过滤后，将滤液浓缩。在残渣中加入丙酮(10mL，2次)，除去上清液。将残渣用乙醇共沸2次，在减压条件下于50℃干燥2小时，得到1.36g粗制标题化合物。
1H-NMR(D2O，500MHz)δppm5.71(1H，dd，J＝6.9，9.9Hz)，5.02(1H，d，J＝50.3Hz)，4.27-4.18(2H，m)，3.88-3.71(2H，m).
合成例89-(2-氟-β-D-阿糖基)腺嘌呤[式IIB＝腺嘌呤]在1.0M磷酸/三正丁胺的乙腈溶液(2.8mL，2.8mmol)中加入分子筛4A(126mg)和三正丁胺(0.67mL，2.8mmol)，在室温下搅拌1小时。在室温下加入碘化四正丁基铵(0.87g，2.4mmol)，再过10分钟后，滴入3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-溴化物[式IIIR1＝Bz，X＝Br](0.2g，0.47mmol)的乙腈溶液(2mL)。在室温下搅拌2小时后，过滤除去不溶物。在减压条件下浓缩滤液，用乙酸乙酯(20mL)对残渣进行萃取。将有机层用0.1N盐酸洗涤3次，用无水硫酸钠干燥，将溶剂蒸发除去。将残渣溶解于甲基乙基酮(5mL)中，加入磷酸(0.74g)、分子筛4A(0.2g)，在80℃下搅拌3小时。过滤除去不溶物后，将溶剂蒸发除去。用乙酸乙酯(20mL)对残渣进行萃取。将有机层用水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，将溶剂蒸发除去，得到粗制标题化合物(HPLC分析生成率为56.4％，α/β＝7.3)。
将其溶解于甲醇(4mL)，加入28％氨水(2mL)，在室温下搅拌1小时。再加入28％氨水(2mL)，在室温下搅拌一晚。在减压条件下将溶剂蒸发除去，将残渣溶解于水(20mL)。将其用乙酸乙酯(20mL)洗涤2次，回收水层。在减压条件下将水浓缩，将残渣溶解于20mM磷酸钾缓冲液(20mL，pH7.6)，加入腺嘌呤(54mg，0.4mmol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，1750单位)，在50℃下静置4天。将反应液用膜滤器(PTFE，0.45μm)过滤，将滤液调整至40mL的水溶液后，用反相ODS层析法(40mL，0～5％乙腈-水)纯化，以无色的结晶形式得到50mg标题化合物(相对腺嘌呤收率46％)。
1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm8.26(1H，d，J＝1.7Hz)，8.17(1H，s)，7.36(2H，brs)，6.41(1H，dd，J＝4.6，14.1Hz)，6.15(1H，br)，5.25(1H，br)，5.22(1H，dt，J＝4.3，52.7Hz)，4.47(1H，dt，J＝4.5，19.4Hz)，3.86-3.84(1H，m)，3.68-3.63(2H，m).
合成例99-(2-氟-β-D-阿糖基)腺嘌呤[式IIB＝腺嘌呤]
将磷酸(2.8g，28.2mmol)、分子筛4A(2.0g)悬浮于乙腈(10mL)中，在0℃下加入三正丁胺(13.4mL，56.4mmol)，在室温下搅拌1小时。在室温下加入碘化四正丁基铵(8.7g，23.5mmol)，再过10分钟后，滴入3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-溴化物[式IIIR1＝Bz，X＝Br](2.0g，4.7mmol)的乙腈溶液(20mL)。在室温下搅拌2小时后，过滤除去不溶物。在减压条件下浓缩滤液，用乙酸乙酯(150mL)对残渣进行萃取。将有机层用0.1N盐酸洗涤3次，用无水硫酸钠干燥，将溶剂蒸发除去。将残渣溶解于甲基乙基酮(50mL)中，加入磷酸(7.4g)、分子筛4A(2.0g)，在80℃下搅拌2小时。过滤除去不溶物后，将溶剂蒸发除去。用乙酸乙酯(150mL)对残渣进行萃取。将有机层用水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，将溶剂蒸发除去(HPLC分析生成率为67.4％，α/β＝3.1)。
将其溶解于甲醇(40mL)，加入28％氨水(20mL)，在室温下搅拌1小时。再加入28％氨水(20mL)，在室温下搅拌一晚。在减压条件下将溶剂蒸发除去，将残渣溶解于水(50mL)。将其用乙酸乙酯(200mL)洗涤2次，回收水层。在减压条件下将水浓缩，得到粗制的标题化合物。
将1/2量的该粗制的标题化合物溶解于20mM磷酸钾缓冲液(100mL，pH7.6)，加入腺嘌呤(270mg，2.0mmol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，2000单位)，在50℃下静置6天。将反应液用膜滤器(PTFE，0.45μm)过滤，将滤液调整至150mL的水溶液后，用反相ODS柱层析法(200mL，0～5％乙腈-水)纯化，以无色的结晶形式得到181mg标题化合物(相对腺嘌呤收率34％)。
1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm8.26(1H，d，J＝1.7Hz)，8.17(1H，s)，7.36(2H，brs)，6.41(1H，dd，J＝4.6，14.1Hz)，6.15(1H，br)，5.25(1H，br)，5.22(1H，dt，J＝4.3，52.7Hz)，4.47(1H，dt，J＝4.5，19.4Hz)，3.86-3.84(1H，m)，3.68-3.63(2H，m).
合成例102，6-二氨基-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤[式IIB＝2，6-二氨基嘌呤]将1/2量的合成例9中得到的粗制2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式I]溶解于20mM磷酸钾缓冲液(100mL，pH7.6)，加入2，6-二氨基嘌呤(300mg，2.0mmol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，2000单位)，在50℃下静置6天。将反应液用膜滤器(PTFE，0.45μm)过滤，将滤液调整至150mL的水溶液后，用反相ODS柱层析法(200mL，0～3％乙腈-水)纯化，以无色的结晶形式得到228mg标题化合物(相对2，6-二氨基嘌呤收率40％)。
1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm7.81(1H，d，J＝2.4Hz)，6.79(2H，brs)，6.18(1H，dd，J＝4.2，16.5Hz)，5.89(3H，brs)，5.20(1H，br)，5.10(1H，dt，J＝3.7，52.6Hz)，4.39(1H，ddd，J＝3.7，4.5，18.2Hz)，3.82-3.80(1H，m)，3.79-3.60(2H，m).
合成例119-(2-氟-β-D-阿糖基)鸟嘌呤[式IIB＝鸟嘌呤]将2，6-二氨基-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤(61.2mg，0.21mmol)溶解于50mMTris盐酸缓冲液(20mL，pH7.0)，加入腺嘌呤脱氨基酶(71单位)，在室温下搅拌1.5小时。将反应液用膜滤器(PTFE，0.5μm)过滤，调整至60mL的水溶液。将其用反相ODS柱层析法(80mL，0～2％乙腈-水)纯化，以无色的结晶形式得到60.4mg标题化合物(收率100％)。
1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm10.50(1H，brs)，7.80(1H，s)，6.54(2H，brs)，6.13(1H，dd，J＝4.2，16.0Hz)，5.94(1H，d，J＝4.5Hz)，5.11(1H，dt，J＝3.8，52.4Hz)，5.08(1H，t，J＝5.7Hz)，4.37(1H，dd，J＝3.9，17.8Hz)，3.82-3.79(1H，m)，3.66-3.57(2H，m).
合成例122-氨基-6-氯-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤[式IIB＝2-氨基-6-氯嘌呤]将实施例7中得到的粗制2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式I](200mg，0.5mmol)溶解于50mM磷酸钾缓冲液(150mL，pH7.5)，加入2-氨基-6-氯嘌呤(170mg，1.0mmol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，3519单位)，在50℃下静置14天。将反应液用膜滤器(PTFE，0.45μm)过滤，将滤液调整至10mL的水溶液后，用反相ODS柱层析法(20mL，0～5％乙腈-水)纯化，得到标题化合物。
1H-NMR(D2O，500MHz)δppm8.20(1H，s)，6.31(1H，dd，J＝3.9，17.4Hz)，5.24(1H，dt，J＝3.1，51.2Hz)，4.56(1H，dt，J＝2.2，18.2Hz)，4.10-4.07(1H，m)，3.92-3.82(2H，m).
合成例132-氨基-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤[式IIB＝2-氨基嘌呤]将合成例7中得到的粗制2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式I](200mg，0.5mmol)溶解于50mM磷酸钾缓冲液(150mL，pH7.5)，加入2-氨基嘌呤(135mg，1.0mmol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，1517单位)，在50℃下静置9天。将反应液用膜滤器(PTFE，0.45μm)过滤，将滤液调整至6mL的水溶液后，用反相ODS柱层析法(40mL，0～5％乙腈-水)纯化，得到87.3mg(相对于2-氨基嘌呤收率32％)标题化合物。
1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm8.63(1H，s)，8.18(1H，d，J＝2.2Hz)，6.64(2H，brs)，6.50(1H，br)，6.31(1H，dd，J＝4.4，15.2Hz)，5.19(1H，dt，J＝4.1，52.6Hz)，5.15(1H，br)，4.43(1H，ddd，J＝4.0，4.9，18.3Hz)，3.85(1H，q，J＝4.9Hz)，3.70-3.62(2H，m).
合成例142-氟-9-(2-氟-β-D-阿糖基)腺嘌呤[式IIB＝2-氟腺嘌呤]将合成例7中得到的粗制2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式I](76mg，0.2mmol)溶解于5mM Tris盐酸缓冲液(60mL，pH7.5)，加入2-氟腺嘌呤(44mg，0.3mmol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，722单位)，在50℃下静置5天。将反应液用膜滤器(PTFE，0.45μm)过滤，将滤液调整至30mL的水溶液后，用反相ODS柱层析法(40mL，0～5％乙腈-水)纯化，得到39.0mg(相对于2-氟腺嘌呤收率45％)标题化合物。
1H-NMR(DMSO-d6，500MHz)δppm8.24(1H，d，J＝1.9Hz)，8.00-7.80(2H，m)，6.29(1H，dd，J＝4.6，13.8Hz)，5.98(1H，d，J＝5.1Hz)，5.22(1H，dt，J＝4.2，52.6Hz)，5.10(1H，t，J＝5.6Hz)，4.43(1H，ddd，J＝5.0，9.4，18.9Hz)，3.85(1H，dd，J＝4.9，9.6Hz)，3.71-3.61(2H，m).
合成例159-(2-氟-β-D-阿糖基)鸟嘌呤[式IIB＝鸟嘌呤]将磷酸(48.1g，0.49mol)、分子筛4A(38g)悬浮于乙腈(160mL)中，在0℃下加入三正丁胺(233.9mL，0.98mol)，在室温下搅拌1小时。在室温下加入碘化四正丁基铵(151.0g，0.41mol)，再10分钟后，滴入3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-溴化物[式IIIR1＝Bz，X＝Br](34.62g，0.82mol)的乙腈溶液(240mL)。在室温下搅拌2小时后，过滤除去不溶物。在减压条件下浓缩滤液，在残渣中加水(200mL)，用乙酸乙酯(600mL)对残渣萃取2次。将有机层用无水硫酸钠干燥，将溶剂蒸发除去。将残渣溶解于甲基乙基酮(830mL)中，加入磷酸(110.6g)，在80℃下搅拌2小时。将溶剂蒸发除去，向残渣中加水(1L)，用乙酸乙酯(1L)对残渣萃取2次。将有机层用无水硫酸钠干燥后，将溶剂蒸发除去，得到粗制3，5-O-二苯甲酰-2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式VR1＝Bz，R2＝H]。
将其溶解于甲醇(600mL)，加入28％氨水(300mL)，在室温下搅拌1.5小时。再加入28％氨水(300mL)，在室温下搅拌一晚。在减压条件下将溶剂蒸发除去，将残渣溶解于水(500mL)。将其用乙酸乙酯(800mL)洗涤2次，回收水层。在减压条件下将水浓缩，用膜滤器(PTFE，0.45μm)过滤后，加水得到粗制2-氟-α-D-阿糖基-1-磷酸酯[式I]的水溶液(2.5L，pH7.5)。
向其中加入2，6-二氨基嘌呤(15.4g，0.1mol)和嘌呤核苷磷酸化酶(粗酶，108300单位)，在50℃下静置10天。将反应液用稀盐酸调整至pH4，用硅藻土过滤除去沉淀物。将滤液用吸附树脂柱(三菱化学公司制，SP206，1.4L，0～20％乙醇-水)纯化，浓缩得到2，6-二氨基-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤[式IIB＝2，6-二氨基嘌呤]的水溶液(3.1L)。
向其中加入磷酸二氢钾(8.4g)，用1N氢氧化钾调整至pH7.3后，加入腺嘌呤脱氨基酶(2000单位)，在40℃下静置3小时。将反应液用稀盐酸调整至pH4，用吸附树脂柱(三菱化学公司制，SP206，1.9L，0～15％乙醇-水)纯化，以无色结晶形式得到7.8g标题化合物(HPLC纯度99％，相对于2，6-二氨基嘌呤收率27％)。
参考例1(1)嘌呤核苷磷酸化酶的制备在含有20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L氯化钠、1g/L葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素的100mL营养培养基中，接种带有按照日本专利特开平9-117298号公报所记载的方法制备的重组载体pTrc-B56的大肠杆菌JM109“pTrc-B56”，在37℃下振荡培养。
在达到4×108个/mL时，在培养液中添加IPTG，使最终浓度为1mmol/L，再于37℃下继续振荡培养5小时。培养结束后，通过离心分离(9000×g，10分钟)回收培养菌体，悬浮于20mL的缓冲液(含有50mmol/L Tris盐酸缓冲液(pH7.8)、5mmol/L EDTA、0.1％Triton X100)。通过在菌体悬浮液中加入溶菌酶，使最终浓度达到1mg/mL，在37℃下保温1小时，将性状转化体溶菌，再通过离心分离(12000×g，10分钟)除去菌体残渣。将这样得到的上清部分作为酶液。
(2)腺苷脱氨基酶的制备在含有20g/L蛋白胨、10g/L酵母提取物、5g/L氯化钠、1g/L葡萄糖、100μg/mL氨苄青霉素的100mL营养培养基中，接种带有按照日本专利特开平5-219978号公报所记载的方法制备的重组载体pDR-add的大肠杆菌性状转化体JM105“pDR-add”，在37℃下振荡培养。
在达到4×108个/mL时，在培养液中添加IPTG，使最终浓度为0.1mmol/L，再于37℃下继续振荡培养3小时。培养结束后，通过离心分离(9000×g，10分钟)回收培养菌体，悬浮于10mL的缓冲液(20mmol/L Tris盐酸缓冲液(pH8.2)、10％乙二醇)。将菌体悬浮液用超声波破碎机进行处理，再通过离心分离(2000×g，10分钟)除去菌体残渣。将这样得到的上清部分作为酶液。
权利要求
1.式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷或其盐。
2.式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷的立体选择性的制造方法，其特征在于，将式(III) 所示的2-脱氧-2-氟-阿拉伯糖衍生物水解，立体选择性地得到式(IV) 所示的α-1-羟基体，将式(IV)的化合物磷酸化，制得式(V) 所示的α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷衍生物，接着将羟基和/或磷酸残基的保护基脱保护；式中，R1表示羟基的保护基，X表示离去基团，R2表示氢原子或磷酸残基的保护基。
3.式(V′) 所示的1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ体混合物的制造方法，其特征在于，在强酸盐的存在下，将式(III) 所示的2-脱氧-2-氟-阿拉伯糖衍生物磷酸化，得到式(V) 所示的1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷衍生物的αβ体混合物，接着将羟基和/或磷酸残基的保护基脱保护；式中，R1表示羟基的保护基，X表示离去基团，R2表示氢原子或磷酸残基的保护基。
4.如权利要求3所述的制造方法，其特征还在于，使用产生卤素离子或硝酸根离子的强酸盐。
5.式(II) 所示的2′-脱氧-2′-氟-β-D-阿糖核苷的制造方法，其特征在于，使核苷磷酸化酶与式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷或式(V′) 所示的1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ体混合物及碱基作用；式中，B表示碱基。
6.如权利要求5所述的制造方法，其特征还在于，碱基是嘌呤碱基，或者具有选自卤素原子、烷基、卤代烷基、链烯基、卤代链烯基、炔基、氨基、烷氨基、羟基、羟氨基、氨氧基、烷氧基、巯基、烷基巯基、芳基、芳氧基和氰基的取代基的嘌呤碱基。
7.如权利要求5或6所述的制造方法，其特征还在于，核苷磷酸化酶是嘌呤核苷磷酸化酶。
8.式(VII) 所示的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鸟嘌呤的制造方法，其特征在于，使核苷磷酸化酶与式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷或式(V′) 所示的1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ体混合物及2-氨基-6-取代嘌呤作用，得到式(VI) 所示的2-氨基-6-取代-9-(2-氟-β-D-阿糖基)嘌呤，将其用水解酶处理；式中，Y表示取代基。
9.如权利要求8所述的制造方法，其特征还在于，2-氨基-6-取代嘌呤为2，6-二氨基嘌呤。
10.如权利要求8或9所述的制造方法，其特征还在于，水解酶为脱氨基酶。
11.式(VII) 所示的9-(2-氟-β-D-阿糖基)鸟嘌呤的制造方法，其特征在于，使核苷磷酸化酶及核苷酶与式(I) 所示的α-1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷或式(V′) 所示的1-磷酸化2-脱氧-2-氟阿拉伯糖苷的αβ体混合物及鸟嘌呤核苷5′-单磷酸作用。
12.如权利要求11所述的制造方法，其特征还在于，核苷磷酸化酶为嘌呤核苷磷酸化酶。
13.如权利要求11或12所述的制造方法，其特征还在于，核苷酶为次黄嘌呤核苷酸核苷酶。
全文摘要
可以简便且高立体选择性、高收率地制造式(II)所示的2′－脱氧－2′－氟－β－D－阿糖核苷、特别是2′－脱氧－2′－氟－β－D－阿糖嘌呤核苷，其特征在于，使核苷磷酸化酶与式(I)所示的α－1－磷酸化2－脱氧－2－氟阿拉伯糖苷或式(V′)所示的1－磷酸化2－脱氧－2－氟阿拉伯糖苷的αβ体混合物及碱基作用；式中，B表示碱基。
文档编号C12P19/40GK1867576SQ200480030618
公开日2006年11月22日 申请日期2004年10月22日 优先权日2003年10月24日
发明者山田浩平, 松本倫毅, 早川弘之 申请人:雅玛山酱油株式会社