专利名称：Il－21衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及白介素21(IL-21)或其类似物(包括作为IL-21拮抗剂发挥作用的IL-21变体)的衍生物的合成和纯化。
背景技术：
IL-21在例如WO 00/53761中被描述成T细胞生长和NK活性的刺激物。以前没有描述过IL-21的衍生物。其作为具有改良特征的有效制药学衍生物，在许多应用中引起关注。
发明概述本发明提供了IL-21或其变体的衍生物。
一方面，本发明提供了包含聚合分子或亲脂性衍生物的IL-21或其变体的衍生物。
在本发明的一个方面，IL-21或其变体的衍生物所包含的聚合分子是一个或多个PEG基团。
在本发明的一个方面，IL-21或其变体的衍生物在分子的N末端、C末端、或内部包含衍生化。
在本发明的一个方面，衍生化位于IL-21序列中天然存在的氨基酸和/或添加入或替代入的氨基酸。
本发明提供了特定的Ser-hIL21变体、表达该特定变体的分离DNA、以及与聚合分子进行衍生化作用的用途。本发明还提供了IL-21或其变体的衍生物用于制造治疗癌症或感染性疾病的药物的用途。
发明详述本发明提供了IL-21肽的多种衍生物，包括包含IL-21肽或其变体的经过化学修饰的肽。根据衍生用分子的特征，化学修饰可能改变分子的化学和生物学特征。修饰的后果可能是肽的生物学功能得到保持，或者肽的活性可能有所降低。例如，衍生化作用可能延长衍生化肽在体内的功能半衰期，从而补偿活性的降低。例如，可以通过将IL-21肽或其类似物与亲水性部分(moiety)偶联产生保持生物学活性的IL-21衍生物来实现IL-21衍生物的持久作用特性。衍生化作用可以提供例如半衰期延长的肽以便于持续维持治疗有效量的IL-21或其具有相同生物学作用的衍生物。由此可以减少施用有效量的持久肽所需要的数量。衍生化可以保护分子免于酶的降解和由体内清除出去。衍生化优选是非免疫原性的。在本发明的一个方面，可以修改肽的溶解性。
IL-21活性的定义见Parrish-Novak，2000，Nature 40857-63；Brady，J.、Hayakawa，Y.、Smyth，M.J.、和Nutt，S.L.，2004，IL-21induces the functional maturation of murine NK cells，Journalof immunology(巴尔的摩，马里兰)1722048-2058；Collins，M.、Whitters，M.J.、和Young，D.A.，2003，IL-21 and IL-21 receptora new cytokine pathway modulates innate and adaptive immunity，Immunol.Res.28131-140；Habib，T.、Nelson，A.、和Kaushansky，K.，2003，IL-21a novel IL-2-family lymphokine thatmodulates B，T，and natural killer cell responses，J.AllergyClin.Immunol.1121033-1045；Sivakumar，P.V.，2004，Interleukin-21 is a T-helper cytokine that regulates humoralimmunity and cell-mediated anti-tumour responses，Immunology112177；Wang，G.、Tschoi，M.、Spolski，R.、Lou，Y.、Ozaki，K.、Feng，C.、Kim，G.、Leonard，W.J.、和Hwu，P.，2003，In vivo antitumoractivity of interleukin 21 mediated by natural killer cells，Cancer Res.639016-9022；以及Wang，G.，2003，In vivo antitumoractivity of interleukin 21 mediated by natural killercells.Cancer Res 639016。认为IL-21及其衍生物可用于治疗肿瘤性疾病。肿瘤性疾病或癌应当理解为指所有形式的赘生性细胞生长，包括囊性瘤和实体瘤，骨和软组织肿瘤，包括良性和恶性两种性质的肿瘤，包括肛门组织、胆管、膀胱、血细胞、骨、骨(继发)、肠(结肠和直肠)、脑、脑(继发)、乳房、乳房(继发)、类癌瘤、子宫颈、儿童癌、眼、食道(食管)、头和颈、卡波西肉瘤、肾、喉、(急性成淋巴细胞性)白血病、(急性髓细胞样)白血病、(慢性淋巴细胞性)白血病、(慢性髓细胞样)白血病、(其它)白血病、肝、肝(继发)、肺、肺(继发)、淋巴结(继发)、(何杰金氏)淋巴瘤、(非何杰金氏)淋巴瘤、黑素瘤、间皮瘤、骨髓瘤、卵巢、胰腺、阴茎、前列腺、皮肤、软组织肉瘤、胃、睾丸、甲状腺、未知原发性肿瘤、阴道、外阴、子宫中的肿瘤。软组织肿瘤包括良性单体性许旺氏细胞瘤(Benign Schwannoma Monosomy)、硬纤维瘤、成脂细胞瘤、脂肪瘤、子宫平滑肌瘤、明细胞肉瘤、皮肤纤维肉瘤、尤因肉瘤、骨骼外粘液样软骨肉瘤、粘液样脂肪肉瘤、分化良好的脂肪肉瘤、小泡型横纹肌肉瘤、和滑膜肉瘤。具体的骨肿瘤包括非骨化性纤维瘤、单房性骨囊肿、内生软骨瘤、动脉瘤样骨囊肿、成骨细胞瘤、成软骨细胞瘤、软骨粘液纤维瘤、骨化性纤维瘤和釉质瘤、巨细胞瘤、纤维性结构不良、尤因肉瘤、嗜曙红细胞肉芽肿、骨肉瘤、软骨瘤、软骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、和转移癌。白血病指由骨髓生成的白细胞的癌，包括但不限于白血病的四种主要类型急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性成髓细胞性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、和慢性髓细胞样白血病(CML)。
在讨论本发明的详细实施方案之前，提供与本发明主要方面有关的具体术语的定义。
在本发明的内容中，“IL-21”定义为WO 00/53761中作为SEQ ID No2公布的序列或该序列的不含N端序列的序列。本申请还描述了IL-21的变体和衍生物。在本发明的内容中，术语“IL-21”由此指WO 00/53761中描述的IL-21，任选不含N端序列。本发明涵盖来自其它物种的相应蛋白质(“直向同源物(ortholog)”)。特别感兴趣的是来自其它哺乳动物物种的IL-21多肽，包括啮齿类、猪、羊、牛、狗、猫、马、和其它灵长类。
“IL-21衍生物”包括衍生化或与另一种功能分子相连接。连接可以是与其它分子实体(诸如抗体、毒素、放射性同位素、毒害细胞的或抑制细胞的试剂、或聚合分子或亲水性基团)化学偶联、基因融合、非共价相连、诸如此类。非限制性实例包括聚合基团，诸如例如PCT/DK2004/000531中公布的树状分子(dendrimer)、聚环氧烷(PAO)、聚烷撑二醇(PAG)、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯共马来酸酐、聚苯乙烯共马来酸酐、葡聚糖、羧甲基葡聚糖；血清蛋白质结合配体，诸如与清蛋白结合的化合物，像脂肪酸，C5-C24脂肪酸，脂肪族二酸，(例如C5-C24)。清蛋白结合物见丹麦专利申请PCT/DK04/000625。清蛋白结合物也可以是具有如下化学式的化合物 延长基团(protracting group)的其它实例包括所含部分(moiety)在生理条件下改变电荷特性的有机小分子，诸如羧酸或胺，或包含预防聚糖特异识别的中性取代基诸如小型烷基取代基(例如C1-C5烷基)的有机小分子。
IL-21肽的变体或类似物的特征是具有一处或多处氨基酸替代、删除、或添加。这些变化本质上通常是次要的，即保守氨基酸替代和不会显著影响肽的受体结合、受体亲和力、折叠、或生物学活性的其它替代；然而，如下所述，关键氨基酸的甚至轻微修改都会改变IL-21肽的作用；小段删除，通常1-约30个氨基酸；以及小段氨基末端或羧基末端延伸，诸如氨基末端甲硫氨酸残基、可多达约20-25个残基的小接头肽、或便于纯化的小段延伸(亲和标签)，诸如聚组氨酸片段、蛋白A(Nilsson等，1985，EMBO J.41075；Nilsson等，1991，MethodsEnzymol.1983)、谷胱甘肽S转移酶(Smith和Johnson，1988，Gene6731)、或其它抗原性表位或结合结构域。通常见Ford等，1991，Protein Expression and Purification 295-107。编码亲和标签的DNA可以由供应商处获得(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，新泽西)。
IL-21肽的变体还可以包含非天然存在氨基酸残基。非天然存在氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2，4-亚甲基脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基脯氨酸、N-甲基甘氨酸、addo-threonine、甲基苏氨酸、羟乙基半胱氨酸、羟乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、同型谷氨酰胺(homoglutamine)、哌啶酸、噻唑烷羧酸、脱氢脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔-亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸、和4-氟苯丙氨酸。本领域知道用于将非天然存在氨基酸残基掺入蛋白质的数种方法。例如，可以采用其中使用化学氨基酰化的抑制型tRNA抑制无义突变的体外系统。本领域知道用于合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法。可以依照本领域已知流程来鉴定本发明多肽中的关键氨基酸，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，1989，Science 2441081-1085；Bass等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 884498-4502。在后一种技术中，在分子的每一个残基处导入一个丙氨酸突变，并对得到的突变分子检测生物学活性(例如配体结合和信号转导)，从而鉴定对分子的活性至关重要的氨基酸残基。还可以通过分析通过诸如核磁共振、结晶学、或光亲和标记等技术测定的晶体结构来确定配体-蛋白质相互作用的位点。还可以通过分析与相关蛋白质的同源性来推断关键氨基酸。
在一个实施方案中，变体与WO 00/53761的序列SEQ ID NO2具有70％或更多同一性。在一个实施方案中，变体与WO 00/53761的序列SEQID NO2具有80％或更多同一性。在另一个实施方案中，变体与WO00/53761的序列SEQ ID NO2具有90％或更多同一性。在另一个实施方案中，变体与WO 00/53761的序列SEQ ID NO2具有95％或更多同一性。
两种氨基酸序列之间的序列同一性百分率是通过既可用于蛋白质又可用于DNA比对的Needelman-Wunsch比对测定的。在用于蛋白质比对时，所用默认评分矩阵是BLOSUM50，而缺口中第一个残基的罚分是-12，缺口中的其余残基的罚分是-2。可以使用v20u6版FASTA软件包的比对软件进行比对(W.R.Pearson和D.J.Lipman，1988，“Improved Toolsfor Biological Sequence Analysis”，PNAS 852444-2448；以及W.R.Pearson，1990，“Rapid and Sensitive Sequence Comparisonwith FASTP and FASTA”，Methods in Enzymology 18363-98)。
相对于野生型IL-21具有实质性改良生物学活性的IL-21变体的非限制性实例见WO 03/40313，其中对IL-21序列中单个氨基酸的替代拮抗IL-21的作用。
依照本发明，IL-21化合物的拮抗剂抑制在正常情况下对IL-21观察到的活性。这些化合物还可以是与IL-21相互作用的小分子、肽、或可溶性受体。依照本发明，IL-21拮抗剂的衍生化是肽或可溶性受体。在本发明的一个方面，肽是具有拮抗作用的IL-21类似物或变体。
拮抗剂还可以是融合蛋白，包括与免疫球蛋白Fc区融合的IL-21R胞外结构域。
拮抗性融合蛋白的实例见WO 03/28630的SEQ ID NO23、SEQ IDNO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ ID NO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、或SEQ ID NO39。
可以依照本发明使用的其它IL-21拮抗剂有WO 03/40313的SEQ IDNO4和6。WO 03/87320中提到了第114和119位之一或二者具有变异的IL-21肽。
对IL-21具有拮抗作用的可溶性IL-21受体见WO 04/07682。
可用于本发明方法的拮抗性融合蛋白的实例见WO 03/28630的SEQID NO23、SEQ ID NO25、SEQ ID NO27、SEQ ID NO29、SEQ IDNO31、SEQ ID NO33、SEQ ID NO35、SEQ ID NO37、和SEQ IDNO39。
可用于本发明方法的其它IL-21拮抗剂有WO 03/40313的SEQ IDNO4和6以及WO 03/87320中描述的在人IL-21第114和119位之一或二者具有变异的IL-21肽。WO 04/07682描述了具有针对IL-21的拮抗活性的可溶性受体。
在本发明的一个方面，采用IL-21抗体作为IL-21拮抗剂。可以通过本领域已知的任何合适方法来生成这些抗体，而且WO 00/53761描述了这些抗体的实例。IL-21拮抗性抗体的特征是抑制IL-21的一种或多种生物学活性。对生物学活性的抑制可以通过例如Ba F3测定法来测量，其中将稳定转染了人IL-21R的Ba F3细胞(IL-21R-Ba F3)在添加了IL-21的培养基中进行增殖。向IL-21R-Ba F3细胞中加入IL-21拮抗剂将会如所需的部分或完全抑制IL-21R-Ba F3细胞的IL-21依赖性增殖。
术语“聚合分子”或“聚合基团”或“聚合部分(moiety)”或“聚合物分子”涵盖通过两个或多个单体的共价连接而形成的分子，其中没有一个单体是氨基酸残基。优选的聚合物是选自下组的聚合物分子PCT/DK2004/000531中公布的树状分子、聚环氧烷(PAO)(包括聚烷撑二醇(PAG)，诸如聚乙二醇(PEG)和聚丙二醇(PPG))、分支PEG、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯共马来酸酐、聚苯乙烯共马来酸酐、和葡聚糖(包括羧甲基葡聚糖)。特别优选PEG。
术语“PEG化IL-21”指在人IL-21多肽上缀合了一个或多个PEG分子的IL-21。应当理解，PEG分子可以附着在IL-21多肽的任何部分，包括IL-21多肽的任何氨基酸残基或碳水化合物部分(moiety)。术语“半胱氨酸-PEG化IL-21”指在导入IL-21中的半胱氨酸的巯基上缀合了PEG分子的IL-21。
术语“聚乙二醇”或“PEG”指聚乙二醇化合物或其衍生物，含有或不含偶联剂、偶联或活化部分(moiety)(例如含有硫醇、三氟甲基磺酸酯(盐)、三氟乙基磺酸酯(盐)(tresylate)、氮丙啶(azirdine)、环氧乙烷、或优选的马来酰亚胺部分(moiety))。本发明的活化PEG化合物的实例是诸如马来酰亚胺单甲氧基PEG等化合物。术语“PEG”意图指分子量500-150,000Da的聚乙二醇，包括其类似物，其中例如末端OH基团已用甲氧基替代(称为mPEG)。
在本文中，词语“肽”和“多肽”和“蛋白质”可以互换使用，意图指同一事物。
在本发明的内容中，“治疗”指预防、改善、控制、治愈、或减轻疾病(例如疾病的症状)、疾病下潜在的病症、或二者。
术语“功能体内半衰期”以其正常含义使用，即身体/靶器官中仍然存在50％的多肽或缀合物的生物学活性的时间，或者多肽或缀合物的活性是其初始数值的50％的时间。作为测定功能体内半衰期的替换项，可以测定“血清半衰期”，即清除前50％的多肽或缀合物分子在血浆或血流中循环的时间。血清半衰期的测定常常比功能半衰期的测定要更加简单，而且血清半衰期的量级通常是功能体内半衰期的量级的很好指标。血清半衰期的替换术语包括血浆半衰期、循环半衰期、血清清除、血浆清除、和清除半衰期。需要保持的功能性通常选自促凝、蛋白水解、辅助因子结合、受体结合活性，或者是与特定蛋白质有关的其它类型的生物学活性。
术语“延长”在关于功能体内半衰期或血浆半衰期时用于指示根据可比条件下的测定，多肽或缀合物的相关半衰期相对于参考分子(诸如未缀合糖蛋白)在统计学上显著的有所延长。例如相关半衰期可能延长了至少约25％，诸如至少约50％，例如至少约100％、150％、200％、250％、或500％。
在一个实施方案中，本发明涉及IL-21衍生物用于制备治疗对T细胞激发和NK细胞增殖有响应的疾病的药物的用途。
本发明还提供了多种其它多肽融合物(以及包含一个或多个多肽融合物的相关多聚蛋白质)。例如，可以如美国专利号5,155,027和5,567,584中所公布的将IL-21多肽制成与二聚化蛋白质的融合物，并依照本发明进行衍生化。这方面优选的二聚化蛋白质包括免疫球蛋白恒定区结构域。可以在经过基因工程改造的细胞中表达免疫球蛋白-IL-21多肽融合物。可以将辅助性结构域与IL-21多肽融合，从而将它们靶向特定细胞、组织、或大分子(例如胶原)。
可以依照常规技术在经过基因工程改造的宿主细胞中生产本发明的肽，包括全长肽、肽片段(例如配体结合片段)、和融合多肽。合适的宿主细胞是可以用外源DNA转化或转染并在培养基中生长的细胞类型，包括细菌、真菌细胞、和培养的高等真核细胞。优选真核细胞，特别是多细胞生物体的培养细胞。用于操作克隆的DNA分子和将外源DNA导入多种宿主细胞的技术见Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989；以及Ausubel等，同上。
应当认识到，依照本发明在如上所述主张cDNA时，应当理解所主张的既有有义链、反义链，又有有义链和反义链通过它们各自的氢键一起退火得到的双链DNA。还主张编码本发明多肽且由上文所述cDNA编码的信使RNA(mRNA)。信使RNA(mRNA)将使用与上文定义相同的密码子编码多肽，只是每个胸腺嘧啶核苷酸(T)用尿嘧啶核苷酸(U)取代。
为了引导IL-21多肽进入宿主细胞的分泌途径，在表达载体中提供分泌信号序列(也称为前导序列、前原序列(prepro sequence)、或前序列(pre sequence))。分泌信号序列可以是该蛋白质的，或者可以衍生自(例如)另一种分泌性蛋白质，或者是从头合成的。按正确的读码框将分泌信号序列与IL-21 DNA序列相连。分泌信号序列通常位于编码目的多肽的DNA的5′端，尽管某些信号序列可以位于目的DNA序列的其它位置(见例如Welch等，美国专利号5,037,743；Holland等，美国专利号5,143,830)。
可以如WO 04/55168中所述在大肠杆菌中表达IL-21及其变体。任选的是，可以通过重组DNA技术在其它生物体中生产IL-21变体。为此，可以如下分离编码人IL-21相关多肽或IL-21变体的DNA序列，即依照标准技术构建基因组或cDNA文库，并使用合成寡核苷酸探针通过杂交筛选编码全长或部分蛋白质的DNA序列(见Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989)。为本发明目的，编码蛋白质的DNA序列优选源自人，即衍生自人基因组DNA或cDNA文库。
还可以使用已经建立的标准方法通过人工合成制备编码IL-21变体的DNA序列，例如Beaucage和Caruthers，1981，Tetrahedron Letters221859-1869描述的磷亚酰胺法或Matthes等，1984，EMBO Journal3801-805描述的方法。依照磷亚酰胺法，(例如在自动DNA合成仪中)合成寡核苷酸，并将其纯化，退火，连接，和克隆到合适的载体中。
本发明还包括对IL-21多肽或其变体或包含IL-21或其变体的融合蛋白的化学修饰。化学修饰包括使用能够与选定侧链或末端残基发生反应的有机试剂进行的共价修饰。
这些修饰的实例有将亲脂性取代基附着到一个或多个对应于上文所述氨基酸序列SEQ ID NO1或2中位置的氨基酸残基上。应当理解，对应于氨基酸序列SEQ ID NO2中位置的氨基酸残基可以是任何氨基酸残基，而不仅仅是该位置天然存在的氨基酸残基。在一个实施方案中，将亲脂性取代基附着到赖氨酸上。
可以如申请中所述对IL-21中的一个或多个赖氨酸进行衍生化。
在其它优选的实施方案中，将额外的赖氨酸替代入、插入序列或添加到N末端或C末端，然后任选进行衍生化。本发明的其它方面包括添加天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、或酪氨酸，它们的侧链都携带可用于进行衍生化的官能团。
优选在不会对蛋白质的总体活性产生不利影响的区域进行插入。可以同时进行N端和C端截短，以及在末端添加适当序列。
在本发明的几个方面中，选择下列任何位置(可以组合)用于进行取代Lys 22、Lys 53、Lys 57、Lys 76、Lys 78、Lys 89、Lys 102、Lys 103、Lys 106、Lys 113、或Lys 118。
在本发明的一个方面，可以对下列取代基(可以组合且任选在制备了相应位置为赖氨酸的变体后)进行衍生化Arg66、Arg86、Arg87、Arg91、Arg111、或Arg127。所有上述位置是根据WO 00/53761中所描述的不含最初28个氨基酸的N端序列的IL-21肽的位置计算的。
术语“亲脂性取代基”的特征是包含4-40个碳原子，而且20℃时在水中的溶解度是约0.1-约250mg/100ml水，诸如约0.3-约75mg/100ml水。例如，辛酸(C8)20℃时在水中的溶解度是68mg/100ml，癸酸(C10)20℃时在水中的溶解度是15mg/100ml，而十八酸(C18)20℃时在水中的溶解度是0.3mg/100ml。
为了获得令人满意的IL-21衍生物的持久作用特性，作为范例，附着到IL-21部分(moiety)上的亲脂性取代基包含4-40个碳原子，诸如8-25个碳原子。可以通过亲脂性取代基的羧基将亲脂性取代基附着到IL-21部分(moiety)的氨基上，所述羧基与它所附着的氨基酸的氨基形成酰胺键。或者，可以以这样的方式将亲脂性取代基附着到所述氨基酸上，即亲脂性取代基的氨基与氨基酸的羧基形成酰胺键。还有一种选择是，可以经由酯键将亲脂性取代基与IL-21部分(moiety)相连接。通常，可以通过IL-21部分(moiety)的羧基与将来的取代基的羟基之间的反应或者通过IL-21部分(moiety)的羟基与将来的取代基的羧基之间的反应来形成酯。作为另一种选择，亲脂性取代基可以是导入IL-21部分(moiety)的伯氨基中的烷基。
在本发明的一个实施方案中，IL-21衍生物只含有一个附着到IL-21肽上的亲脂性取代基。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基包含4-40个碳原子。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基包含8-25个碳原子。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基包含12-20个碳原子。
在本发明的一个实施方案中，以这样的方式将亲脂性取代基附着到氨基酸残基上，即亲脂性取代基的羧基与氨基酸残基的氨基形成酰胺键。
在其它优选的实施方案中，将额外的赖氨酸替代入、插入序列或添加到N末端或C末端，然后任选进行衍生化。
优选在不会对蛋白质的总体活性产生不利影响的区域进行插入。优选的区域是上文所列位置。
在本发明的一个实施方案中，以这样的方式将亲脂性取代基附着到氨基酸残基上，即亲脂性取代基的氨基与氨基酸残基的羧基形成酰胺键。
在本发明的一个实施方案中，通过间隔物将亲脂性取代基附着到IL-21肽上。
在本发明的一个实施方案中，间隔物是具有1-7个亚甲基(诸如两个亚甲基)的不分支链烷α，ω-二羧酸基团，且间隔物在IL-21肽的氨基与亲脂性取代基的氨基之间形成桥。
在本发明的一个实施方案中，间隔物是除了半胱氨酸残基以外的氨基酸残基或二肽。合适的间隔物的实例包括β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、γ-谷氨酸、琥珀酸、赖氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸，或是诸如Gly-Lys等二肽。当间隔物是琥珀酸时，它的一个羧基可以与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，而它的另一个羧基可以与亲脂性取代基的氨基形成酰胺键。当间隔物是赖氨酸、谷氨酸、或天冬氨酸时，它们的羧基可以与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，而它们的氨基可以与亲脂性取代基的羧基形成酰胺键。在使用赖氨酸作为间隔物时，在有些情况中可以在赖氨酸的ε-氨基与亲脂性取代基之间插入另一个间隔物。在一个实施方案中，所述另一个间隔物是琥珀酸，它与赖氨酸的ε-氨基和亲脂性取代基中存在的氨基形成酰胺键。在另一个实施方案中，所述另一个间隔物是谷氨酸或天冬氨酸，它与赖氨酸的ε-氨基形成酰胺键，且与亲脂性取代基中存在的羧基形成另一个酰胺键，即亲脂性取代基是Nε-酰化赖氨酸残基。
在本发明的一个实施方案中，间隔物选自下组β-丙氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、γ-谷氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、含天冬氨酸的二肽、含谷氨酸的二肽、或含赖氨酸的二肽。在本发明的一个实施方案中，间隔物是β-丙氨酸。在本发明的一个实施方案中，间隔物是γ-氨基丁酸(GABA)。在本发明的一个实施方案中，间隔物是γ-谷氨酸。
在本发明的一个实施方案中，亲本IL-21肽的羧基与间隔物的氨基形成酰胺键，而氨基酸或二肽间隔物的羧基与亲脂性取代基的氨基形成酰胺键。
在本发明的一个实施方案中，亲本IL-21肽的氨基与间隔物的羧基形成酰胺键，而间隔物的氨基与亲脂性取代基的羧基形成酰胺键。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基包含部分或完全氢化的环戊烷菲(cyclopentanophenathrene)骨架。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基是直链或分支烷基。在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基是直链或分支脂肪酸的酰基。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基的酰基选自下组CH3(CH2)nCO-，其中n是4-38，诸如CH3(CH2)6CO-、CH3(CH2)8CO-、CH3(CH2)10CO-、CH3(CH2)12CO-、CH3(CH2)14CO-、CH3(CH2)16CO-、CH3(CH2)18CO-、CH3(CH2)20CO-、和CH3(CH2)22CO-。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基是直链或分支链烷α，ω-二羧酸的酰基。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基的酰基选自下组HOOC(CH2)mCO-，其中m是4-38，诸如HOOC(CH2)14CO-、HOOC(CH2)16CO-、HOOC(CH2)18CO-、HOOC(CH2)20CO-、和HOOC(CH2)22CO-。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基是化学式为CH3(CH2)p((CH2)qCOOH)CHNH-CO(CH2)2CO-的基团，其中p和q是整数且p+q是8-40的整数，诸如12-35的整数。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基是化学式为CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-的基团，其中r是10-24的整数。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基是化学式为CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-的基团，其中s是8-24的整数。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基是化学式为COOH(CH2)tCO-的基团，其中t是8-24的整数。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基是化学式为-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)uCH3的基团，其中u是8-18的整数。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基是化学式为-NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3的基团，其中w是10-16的整数。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基是化学式为-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)xCH3的基团，其中x是10-16的整数。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基是化学式为-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NHCO(CH2)yCH3的基团，其中y是零或1-22的整数。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基是N-石胆酰基(Lithocholoyl)。
在本发明的一个实施方案中，亲脂性取代基是N-胆酰基(Choloyl)。
在本发明的一个实施方案中，IL-21衍生物具有一个亲脂性取代基。在本发明的一个实施方案中，IL-21衍生物具有两个亲脂性取代基。在本发明的一个实施方案中，IL-21衍生物具有三个亲脂性取代基。在本发明的一个实施方案中，IL-21衍生物具有四个亲脂性取代基。
本发明的方法还设想使用经过化学修饰的IL-21组合物，其中IL-21多肽与聚合分子相连。例示性的IL-21多肽是缺乏功能性跨膜结构域的可溶性多肽，诸如成熟IL-21多肽。通常，聚合物是水溶性的，因而IL-21缀合物在水性环境中不会沉淀，诸如生理环境。合适聚合物的一个实例是经过修饰具有单个反应基团的聚合物，诸如用于酰化的活性酯或用于烷化的醛。这样的话，可以控制聚合的程度。反应性醛的实例是聚乙二醇丙醛或其单(C1-C10)烷氧基或芳氧基衍生物(见例如Harris等，美国专利号5,252,714)。聚合物可以是线性的或分支的。此外，可以使用聚合物混合物来生成IL-21缀合物。
用于治疗的IL-21缀合物可以包含制药学可接受水溶性聚合物部分(moiety)。合适的水溶性聚合物包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧基-PEG、单(C1-C10)烷氧基-PEG、芳氧基-PEG、聚(N-乙烯吡咯烷酮)PEG、2，2，2-三氟乙磺酰基单甲氧基PEG、PEG丙醛、二琥珀酰亚胺基碳酸酯PEG、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇、葡聚糖、纤维素、或其它基于碳水化合物的聚合物。上文描述了不同大小的PEG。
在本发明的一个方面，用N末端PEG基团对肽进行衍生化，即用高碘酸钠将丝氨酸氧化，随后与附着了羟胺的PEG衍生物进行反应，产生肟。原则上，丝氨酸也可以是内部丝氨酸残基或如上所述外加的丝氨酸残基。
用于附着PEG基团的其它方法见G.Pasut、A.Guiotto、F.M.Veronese，2004，Expert Opin.Ther.Patents 14859-894。可以如上所述获得适于附着聚合基团的IL-21变体。
在本发明的一个方面，将IL-21附着于肽的C末端。这可以通过使用适于作为CPY(羧肽酶Y)底物的IL-21或其变体来实现，EP 243 929描述了它的部分反应。然后可以对这种中间物用包含一个或多个反应基X的化合物进行进一步取代，而后者又适于用包含反应基Y的分子进行进一步取代。反应基可以选自如下所述的组。
在一个实施方案中，官能团X和Y选自羰基，诸如酮基和醛基，以及诸如下列氨基衍生物肼衍生物 -NH-NH2、肼羧酸酯衍生物 -O-C(O)-NH-NH2、氨基脲衍生物 -NH-C(O)-NH-NH2、硫代氨基脲衍生物 -NH-C(S)-NH-NH2、碳酸二酰肼衍生物 -NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2、均二氨基脲衍生物 -NH-NH-C(O)-NH-NH2、硫代均二氨基脲衍生物 -NH-NH-C(S)-NH-NH2、芳基肼衍生物 -NH-C(O)-C6H4-NH-NH2、和酰肼衍生物 -C(O)-NH-NH2；羟胺(oxylamine)衍生物，诸如-O-NH2、-C(O)-O-NH2、-NH-C(O)-O-NH2、和-NH-C(S)-O-NH2。
应当理解，如果X中包含的官能团是羰基，那么Y中包含的官能团是胺衍生物，反之亦然。由于大多数肽中存在-NH2基团，因此认为若X包含酮-或醛-官能团就会获得更好的选择性。
适于上文所述反应的PEG衍生物的实例有 其中n是1、2、3、4、5、或6且mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中n是1、2、3、4、5、或6且mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中n是0、1、2、3、4、5、或6且m是1、2、3、4、5、或6且mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中n是1、2、3、4、5、或6且mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中mPEG的分子量是10kDa、20kDa、30kDa、或40kDa； 其中Y是-O-NH2、NH-NH2，n、m、和s是0-20的任何数值，R′和R″独立的代表例如甲基、苯基、联苯基、苯氧苯基、苯基羧基苯基。
可以在上述任何通式的烷基链中的任何合适位置以任一方向插入化学式为-SO2-、-C(O)NH-、-C(O)NHSO2-、-SO2-苯基-、C(O)NHSO2-苯基-的基团。任选的是，可以用下面的基团取代上述化学式中的C(O)NH基团 在本发明的一个实施方案中，衍生物的导入是在一个步骤中完成的。因而，R-X包含将要导入IL-21的衍生物。亲核体代表例如经过修饰而携带衍生物的氨基酸。原则上，可以使用任何氨基酸序列。在本发明的一个方面，使用的亲核体是诸如G(1-5)-PEG、G(1-5)-脂质、G(1-4)-NH-CH2-CHO、G(1-4)-NH-CH2-C-O-NH2等。
PEG是合适的聚合物分子，因为与诸如葡聚糖等多糖相比它只具有少数能够交联的反应基。具体而言，单官能的PEG，例如甲氧基聚乙二醇(mPEG)是令人感兴趣的，因为它的偶联化学相对简单(只有一个反应基能够与多肽上的附着基团缀合)。从而消除了交联的风险，由此产生的多肽缀合物更加均一，而且聚合物分子与多肽的反应更易于控制。
为了将聚合物分子共价附着到多肽上，需要以活化形式提供聚合物分子的羟基末端，即具有反应性官能团。合适的活化聚合物分子可以通过商业途径获得，例如Shearwater公司(亨茨维尔，阿拉巴马州，美国)或PolyMASC Pharmaceuticals上市公司(英国)。或者，可以通过本领域已知的常规方法活化聚合物分子，例如WO 90/13540中所公开的。本发明中所使用的活化的线性或分支聚合物分子的具体实例见Shearwater公司1997年和2000年的产品目录(FunctionalizedBiocompatible Polymers for Research and pharmaceuticals，Polyethylene Glycol and Derivatives，收入本文作为参考)。活化PEG聚合物的具体实例包括下列线性PEGNHS-PEG(例如SPA-PEG、SSPA-PEG、SBA-PEG、SS-PEG、SSA-PEG、SC-PEG、SG-PEG、和SCM-PEG)、NOR-PEG、BTC-PEG、EPOX-PEG、NCO-PEG、NPC-PEG、CDI-PEG、ALD-PEG、TRES-PEG、VS-PEG、IODO-PEG、和MAL-PEG，以及分支PEG，诸如PEG2-NHS和美国专利号5,932,462和美国专利号5,643,575(都收入本文作为参考)中公布的那些。另外，下列发表物(收入本文作为参考)公布了有用的聚合物分子和/或PEG化化学美国专利号5,824,778、美国专利号5,476,653、WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、美国专利号4,902,502、美国专利号5,281,698、美国专利号5,122,614、美国专利号5,219,564、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO 95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921 131、美国专利号5,736,625、WO 98/05363、EP 809 996、美国专利号5,629,384、WO 96/41813、WO 96/07670、美国专利号5,473,034、美国专利号5,516,673、EP 605 963、美国专利号5,382,657、EP 510 356、EP 400 472、EP 183 503、和EP 154 316。
多肽与活化聚合物分子的缀合是通过任何常规方法进行的，例如下列参考文献中所述(它们还描述了用于活化聚合物分子的合适方法)R.F.Taylor，1991，“Protein immobilisation.Fundamentaland applications”，Marcel Dekker，纽约；S.S.Wong，1992，“Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking”，CRC出版社，Boca Raton；G.T.Hermanson等，1993，“Immobilized AffinityLigand Techniques”，Academic出版社，纽约。根据多肽上的附着基团(上文进一步给出了实例)以及聚合物的官能团(例如胺、羟基、羧基、醛、巯基、琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺、乙烯砜、或卤代乙酸酯)，技术人员知道将要使用的活化方法和/或缀合化学。PEG化可以涉及多肽上所有可利用附着基团(即暴露在多肽表面的这些附着基团)的缀合，或者可以涉及一个或多个特定附着基团(例如N末端氨基)的缀合(美国专利号5,985,265)。另外，可以在一个步骤中或以逐步方式(例如WO 99/55377中所述)完成缀合。
可以理解，PEG化的设计是为了在附着的PEG分子的数目、这些分子的大小和形式(例如它们是线性的还是分支的)、以及这些分子附着在多肽中的什么地方这些方面产生最佳的分子。将要使用的聚合物的分子量的选择需要考虑所要实现的期望效果。例如，如果缀合的主要目的是为了得到较高分子量和较大尺寸的缀合物(例如为了降低肾的清除)，那么可以选择缀合一个或一些高分子量聚合物分子或许多较小分子量聚合物分子以获得期望效果。然而，优选的是，使用数个具有较小分子量的聚合物分子。如果希望获得高度的表位屏蔽，那么也是如此。在这些情况中，例如可以使用2-8个例如分子量约5,000Da的聚合物，诸如3-6个这种聚合物。正如下文实施例所例示的，在提高多肽缀合物的功能体内半衰期方面，与较小数目的较高分子量(例如1-3个分子量12,000-20,000Da)的聚合物分子相比，使用较大数目的较小分子量(例如4-6个分子量5000Da)的聚合物分子可能是有利的，即使在两种情况中所附着聚合物分子的总分子量相同或相似的时候。认为，与例如单个较大聚合物分子相比，较大数目的较小聚合物分子的存在为多肽提供了更大的直径或表观大小，至少在聚合物分子较为均匀的分布在多肽表面上的时候。
还发现，当本发明缀合物的至少主要部分的表观大小(也称为“表观分子量”或“表观质量”)是至少约50kDa，诸如至少约55kDa，诸如至少约60kDa，例如至少约66kDa时，获得了有利的结果。认为这是由于肾对表观大小足够大的缀合物的清除基本上消除的事实。在本文中，IL-21缀合物或IL-21多肽的“表观大小”是通过SDS-PAGE法测定的。
在本发明的一个实施方案中，依照本发明与肽缀合的PEG可以是任何分子量。具体而言，分子量可以是500-100,000Da，诸如500-60,000Da，诸如1000-40,000Da，诸如5,000-40,000Da。具体而言，可以在本发明中使用分子量10,000Da、20,000Da、或40,000kDa的PEG。在所有情况中，PEG可以是线性的或分支的。在本发明的一个实施方案中，PEG基团的分子量是5kDa、10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、或60kDa。
在本发明的一个实施方案中，向肽中添加了一个或多个聚合分子。
本发明提供了适于附着聚合基团的化合物。在本发明的一个实施方案中，衍生物由此提供了体内半衰期得到改进的肽。这可以通过保护化合物免于化学降解、蛋白水解、或抗体识别-或任何其它机制来实现。
在一个实施方案中，提供的化合物毒性更低。
在一个实施方案中，提供的化合物水溶性更高。
在一个实施方案中，提供的化合物具有改变的生物分布。
上文是关于非衍生化类似物或hIL-21。
药物组合物在一个具体的实施方案中，本发明提供了本发明的另一个目的是提供包含以0.1至100mg/ml浓度存在的IL-21或其类似物或衍生物的药物制剂，或者该药物制剂任选含有以0.1至100mg/ml浓度存在的本申请中提及的任何其它化合物，而且其中所述制剂的pH是2.0至10.0。制剂还可以包含缓冲系统、防腐剂、等渗剂(tonicity agent)、螯合剂、稳定剂、和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中，药物制剂是水性制剂，即含有水的制剂。这种制剂典型的是溶液或悬浮液。在本发明的另一个实施方案中，药物制剂是水性溶液。术语“水性制剂”定义为至少含有50％w/w水的制剂。同样，术语“水性溶液”定义为至少含有50％w/w水的溶液，而术语“水性悬浮液”定义为至少含有50％w/w水的悬浮液。
在另一个实施方案中，药物制剂是使用前需要医师或患者向其中加入溶剂和/或稀释剂的冻干制剂。
在另一个实施方案中，药物制剂是无需预先溶解的即用型干制剂(例如冻干或喷雾干燥的)。
另一方面，本发明涉及包含IL-21或上文所述任何其它化合物的水溶液以及缓冲剂的药物制剂，其中所述化合物以自0.1mg/ml以上或上文所述浓度存在，优选0.5至50mg/ml，而且其中所述制剂的pH是约2.0至约10.0，优选3.0至约8.0，特别优选4.0至6.0，诸如例如4.0-4.5、4.5-5.0、5.0-5.5、和5.5-6.0。
在本发明的另一个实施方案中，制剂的pH选自下组2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、和10.0。
在本发明的另一个实施方案中，缓冲剂选自下组乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠、三(羟甲基)-氨基甲烷、N-二(羟乙基)甘氨酸、两性离子缓冲剂(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸、或其混合物。这些具体缓冲剂的每一种构成本发明的一个替换实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含制药学可接受抗微生物防腐剂。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂选自下组苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯乙醇、苄醇、氯丁醇、硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪脲、氯己定(chlorohexidine)、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、苯索氯铵、氯苯甘醚(3-对氯苯氧基丙烷-1，2-二醇)、或其混合物。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂的浓度是0.1mg/ml至20mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂的浓度是0.1mg/ml至5mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂的浓度是5mg/ml至10mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，防腐剂的浓度是10mg/ml至20mg/ml。这些具体防腐剂的每一种构成本发明的一个替换实施方案。技术人员熟知防腐剂在药物组合物中的用途。有用的参考书是RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含等渗剂。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂选自下组盐(例如氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸)、醛醇(例如甘油、1，2-丙二醇、1，3-丙二醇、1，3-丁二醇)、聚乙二醇(例如PEG400)、或其混合物。可以使用任何糖，诸如单糖、二糖、或多糖，或者是水溶性聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶淀粉、羟乙基淀粉、和羧甲基纤维素钠。在一个实施方案中，糖添加剂是蔗糖。糖醇定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8碳氢化合物，包括例如甘露醇、山梨醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇、和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂是甘露醇。可以单独或联合使用上文所述糖或糖醇。对于用量没有固定的限制，只要糖或糖醇在液体制剂中可溶解，而且对使用本发明方法实现的稳定作用没有不利影响。在一个实施方案中，糖或糖醇的浓度是约1mg/ml至约150mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂的浓度是1mg/ml至50mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂的浓度是1mg/ml至7mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂的浓度是8mg/ml至24mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，等渗剂的浓度是25mg/ml至50mg/ml。这些具体等渗剂的每一种构成本发明的一个替换实施方案。技术人员熟知等渗剂在药物组合物中的用途。有用的参考书是RemingtonThe Science and Practice ofPharmacy，第19版，1995。
在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含螯合剂。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸、和天冬氨酸的盐及其混合物。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂的浓度是0.1mg/ml至5mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂的浓度是0.1mg/ml至2mg/ml。在本发明的另一个实施方案中，螯合剂的浓度是2mg/ml至5mg/ml。这些具体螯合剂的每一种构成本发明的一个替换实施方案。技术人员熟知螯合剂在药物组合物中的用途。有用的参考书是RemingtonThe Science and Practice of pharmacy，第19版，1995。
在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含稳定剂。技术人员熟知稳定剂在药物组合物中的用途。有用的参考书是RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
更具体的说，本发明的组合物是稳定的液体药物组合物，其治疗活性成分包括在以液体药物制剂的形式贮藏的过程中可能形成聚集体的多肽。“形成聚集体”意指多肽分子之间导致寡聚体(可能保持可溶性)或大型可见聚集体(由溶液中沉淀出来)形成的物理相互作用。“贮藏过程中”意指液体药物组合物或制剂在配制后没有立即施用于受试者。相反，配制后，将其包装以便贮藏，采取液体形式、冻结状态、或干燥形式(稍后重构成液体形式或适于施用于受试者的其它形式)。“干燥形式”意指通过冷冻干燥(即冻干法见例如Williams和Polli，1984，J.Parenteral Sci.Technol.3848-59)、喷雾干燥(见Masters，1991，在Spray-Drying Handbook一书中，第5版，Longman Scientific and Technical，Essez，英国，第491-676页；Broadhead等，1992，Drug Devel.Ind.Pharm.181169-1206；以及Mumenthaler等，1994，Pharm.Res.1112-20)、或空气干燥(Carpenter和Crowe，1988，Cryobiology 25459-470；以及Roser，1991，Biopharm.447-53)将液体药物组合物或制剂干燥。在液体药物组合物的贮藏过程中由多肽形成聚集体可能对该多肽的生物学活性产生不利影响，导致药物组合物的治疗功效损失。另外，聚集体的形成可能引起其它问题，诸如在使用输注系统施用含有多肽的药物组合物时阻塞管道、膜、或泵。
本发明的药物组合物还可以包含其数量足以减少组合物的贮藏过程中由多肽形成聚集体的氨基酸碱。“氨基酸碱”意指氨基酸或其组合，其中任何给定氨基酸以其游离碱的形式或以其盐的形式存在。在使用氨基酸组合时，可以是所有氨基酸都以它们游离碱的形式存在，可以是所有氨基酸都以它们盐的形式存在，或者一些以它们游离碱的形式存在而另一些以它们盐的形式存在。在一个实施方案中，制备本发明组合物时使用的氨基酸是携带带电荷侧链的氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、和谷氨酸。本发明的药物组合物中可以存在特定氨基酸(例如甘氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸、及其混合物)的任何立体异构体(即L、D、或DL异构体)或其组合，只要特定氨基酸以其游离碱的形式或其盐的形式存在。在一个实施方案中，使用L-立体异构体。还可以用这些氨基酸的类似物来配制本发明的组合物。“氨基酸类似物”意指天然存在氨基酸的衍生物，它带来了减少本发明液体药物组合物的贮藏过程中由多肽形成聚集体的期望效果。合适的精氨酸类似物包括例如氨基胍、鸟氨酸、和N-单乙基L-精氨酸，合适的甲硫氨酸类似物包括乙硫氨酸和丁硫氨酸(buthionine)，而合适的半胱氨酸类似物包括S-甲基-L-半胱氨酸。对于其它氨基酸，以其游离碱的形式或其盐的形式在所述组合物中掺入氨基酸类似物。在本发明的另一个实施方案中，以足以预防或延迟蛋白质聚集的浓度使用氨基酸或其类似物。
在本发明的另一个实施方案中，当担当治疗剂的多肽是包含至少一个易被氧化的甲硫氨酸残基的多肽时，可以添加甲硫氨酸(或其它含硫氨基酸或其类似物)来抑制甲硫氨酸残基氧化变成甲硫氨酸亚砜。“抑制”意指甲硫氨酸氧化产物随时间的最小积累。抑制甲硫氨酸氧化导致多肽更持久的保持其正确的分子形式。可以使用甲硫氨酸的任何立体异构体(L、D、或DL异构体)或其组合。添加的数量应当足以抑制甲硫氨酸残基的氧化，使得甲硫氨酸亚砜的数量是管理机构可以接受的。通常，这意味着组合物包含不超过约10％至约30％的甲硫氨酸亚砜。通常，这可以通过以约1∶1至约1000∶1诸如约10∶1至约100∶1的外加甲硫氨酸对甲硫氨酸残基的比率添加甲硫氨酸来实现。
在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含选自下组的稳定剂高分子量聚合物和低分子化合物。在本发明的另一个实施方案中，稳定剂选自聚乙二醇(例如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧基/羟基纤维素或其衍生物(例如HPC、HPC-SL、HPC-L、和HPMC)、环糊精、含硫物质(如单硫甘油、硫代乙醇酸、和2-甲基硫代乙醇)、和不同的盐(例如氯化钠)。这些具体稳定剂的每一种构成本发明的一个替换实施方案。
药物组合物还可以包含进一步增强其中治疗活性多肽的稳定性的额外稳定剂。本发明特别感兴趣的稳定剂包括但不限于保护多肽免于甲硫氨酸氧化的甲硫氨酸和EDTA，以及保护多肽免于冻融或机械剪切相关的聚集的非离子表面活性剂。
在本发明的另一个实施方案中，制剂还包含表面活性剂。在本发明的另一个实施方案中，表面活性剂选自去污剂、乙氧基化蓖麻油、聚乙二醇化(polyglycolyzed)甘油酯、乙酰化甘油单酯、山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段聚合物(例如泊洛沙姆，诸如P1uronicF68、泊洛沙姆188和407、Triton X-100)、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯、聚氧乙烯和聚乙烯衍生物诸如烷基化和烷氧基化衍生物(吐温，例如吐温-20、吐温-40、吐温-80、和Brij-35)、甘油单酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酯或其聚氧乙烯衍生物、醇、甘油、凝集素、磷脂(例如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、二磷脂酰甘油、和鞘磷脂)、磷脂的衍生物(例如二棕榈酰磷脂酸)和溶血磷脂的衍生物(例如棕榈酰溶血磷脂酰-L-丝氨酸和乙醇胺、胆碱、丝氨酸、或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)、溶血磷脂酰和磷脂酰胆碱的烷基、烷氧基(烷酯)、烷氧(烷醚)衍生物(例如溶血磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱的月桂酰和肉豆蔻酰衍生物)、极性首基(即胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇)和带正电荷的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP的修饰、溶血磷脂酰丝氨酸、溶血磷脂酰苏氨酸、甘油磷脂(例如脑磷脂)、甘油糖脂(例如吡喃型半乳糖苷)、鞘糖脂(例如神经酰胺、神经节苷脂)、十二烷基磷酸胆碱、鸡蛋溶血卵磷脂、梭链孢酸衍生物(例如牛磺-二氢梭链孢酸钠等)、长链脂肪酸及其盐C6-C12(例如油酸和辛酸)、酰基肉碱及其衍生物、赖氨酸、精氨酸、或组氨酸的Nα-酰化衍生物、赖氨酸或精氨酸的侧链酰化衍生物、包含赖氨酸、精氨酸、或组氨酸与中性或酸性氨基酸的任意组合的二肽的Nα-酰化衍生物、包含中性氨基酸与两个带电荷氨基酸的任意组合的三肽的Nα-酰化衍生物、DSS(多库酯钠，CAS注册号[577-11-7]；多库酯钙，CAS注册号[128-49-4]；多库酯钾，CAS注册号[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)、辛酸钠、胆酸或其衍生物、胆汁酸及其盐、甘氨酸或牛磺酸缀合物、乌索脱氧胆酸、胆酸钠、脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-铵-1-丙烷磺酸盐、阴离子单价表面活性剂(烷基-芳基-磺酸盐)、两性离子表面活性剂(例如N-烷基-N，N-二甲基铵-1-丙烷磺酸盐、3-胆酰胺基-1-丙基二甲基铵-1-丙烷磺酸盐)、阳离子表面活性剂(季铵碱)(例如鲸蜡基-三甲基溴化铵、鲸蜡基吡啶氯化物)、非离子表面活性剂(例如十二烷基β-D-吡喃型葡萄糖苷)、poloxamine(即通过向乙二胺顺次添加氧化丙烯和氧化乙烯衍生的四功能嵌段共聚物)(例如Tetronic)，或者表面活性剂可以选自咪唑啉衍生物、或其混合物。这些具体表面活性剂的每一种构成本发明的一个替换实施方案。
技术人员熟知表面活性剂在药物组合物中的用途。有用的参考书是RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，第19版，1995。
可能的是，本发明的肽药物制剂中还存在其它成分。这些其它成分可以包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、渗透压调节剂、螯合剂、金属离子、油质媒介、蛋白质(例如人血清清蛋白、明胶、或蛋白质)、和两性离子(例如氨基酸，诸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸、和组氨酸)。这些额外成分当然不应当对本发明药物制剂的总体稳定性产生不利影响。
可以在数个部位对需要这种治疗的患者施用依照本发明含有IL-21或上文所述任何其它化合物的药物组合物，例如局部部位(例如皮肤和粘膜部位)、不涉及吸收的部位(例如在动脉、静脉、心脏中施用)、和涉及吸收的部位(例如在皮肤中、在皮肤下面、在肌肉中、或在腹部施用)。
可以通过数种施用路径对需要这种治疗的患者施用依照本发明的药物组合物，例如舌、舌下、口腔、口中、口服、胃和肠中、鼻、肺(例如通过细支气管和肺泡或其联合)、表皮、皮、透皮、阴道、直肠、眼(例如通过结膜)、输尿管、和肠胃外。
可以以数种剂型来施用本发明的组合物，例如作为溶液、悬浮液、乳液、微乳液、复合乳液、泡沫、软膏、糊剂、膏药、油膏、片剂、包衣片、洗液、胶囊(例如硬明胶胶囊和软明胶胶囊)、栓剂、直肠胶囊、滴剂、凝胶、喷雾剂、粉剂、气雾剂、吸入剂、滴眼液、眼膏、洗眼液、阴道栓、阴道环、阴道药膏、注射液、原位转化液(例如原位胶凝、原位安装、原位沉淀、原位结晶)、输液、和植入物。
还可以将本发明的组合物复合或附着(例如通过共价、疏水、和静电相互作用)药物载体、药物投递系统、和高级药物投递系统，从而进一步提高IL-21或上文所述任何其它化合物的稳定性、提高生物利用度、提高溶解度、降低不利作用、实现本领域技术人员熟知的计时疗法、和提高患者依从性或其任何组合。载体、药物投递系统、和高级药物投递系统的实例包括但不限于聚合物(例如纤维素及其衍生物)、多糖(例如葡聚糖及其衍生物、淀粉及其衍生物)、聚乙烯醇、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、载体蛋白(例如清蛋白)、凝胶(例如热胶凝系统，例如本领域技术人员众所周知的嵌段共聚合系统)、胶束、脂质体、微球体、纳米颗粒、液晶及其分散体、L2相及其分散体(本领域技术人员熟知它在脂-水体系中的相特性)、聚合胶束、复合乳液、自身乳化、自身微乳化、环糊精及其衍生物、以及树状分子。
本发明的组合物可用于配制用于肺部施用IL-21或上文所述任何其它化合物的固体、半固体、粉末、和溶液，例如使用计量药剂吸入器、干粉吸入器、和喷雾器，这些都是本领域技术人员众所周知的装置。
本发明的组合物具体可用于配制受控、持续、延长、延迟、和缓慢释放药物投递系统。更具体的说，而非限制，组合物可用于配制本领域技术人员众所周知的肠胃外受控释放和持续释放系统(这两种系统都导致施用次数减少许多倍)。甚至更优选的是皮下施用的受控释放和持续释放系统。并非限制本发明的范围，有用的受控释放系统和组合物的实例是水凝胶、油质凝胶、液晶、聚合胶束、微球体、纳米颗粒。
用于生产对本发明组合物有用的受控释放系统的方法包括但不限于结晶、浓缩、共结晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压匀浆、封装、喷雾干燥、微囊化、凝聚、相分离、溶剂蒸发以生成微球体、挤压、和超临界流体方法。一般参考书有Handbook of PharmaceuticalControlled Release，Wise，D.L.编，Marcel Dekker，纽约，2000；以及Drug and the Pharmaceutical Sciences，第99卷，ProteinFormulation and Delivery，MacNally，E.J.编，Marcel Dekker，纽约，2000。
可以借助注射器(任选笔样注射器)的手段通过皮下、肌肉内、腹膜内、或静脉内注射进行肠胃外施用。或者，可以通过输液泵的手段进行肠胃外施用。另一种选择是这样的组合物，它可以是以鼻或肺喷雾的形式施用IL-21或上文所述任何其它化合物的溶液或悬浮液。还有一种选择是，可以使含有IL-21或上文所述任何其它化合物的药物组合物适用于透皮施用(例如通过无针注射或贴剂，任选离子电渗贴剂)或经粘膜施用(例如口含)。
术语“稳定的制剂”指物理稳定性提高、化学稳定性提高、或物理和化学稳定性提高的制剂。
术语“物理稳定性”在本文中用于蛋白质制剂时指作为蛋白质暴露于热-机械压力和/或与去稳定的界面和表面(诸如疏水表面和界面)相互作用的结果，蛋白质形成生物学无活性和/或不溶性的蛋白质聚集体的趋势。可以通过如下手段评估水性蛋白质制剂的物理稳定性将装入合适的容器(例如药筒或药瓶)的制剂在不同温度下暴露于机械/物理压力(例如搅动)达不同时间段后进行视觉检查和/或混浊度测量。对制剂的视觉检查是在黑暗背景下在强烈聚焦灯光下进行的。制剂的混浊度表现为将混浊程度分级的视觉评分，例如由0至3的等级(不显示混浊的制剂对应于视觉评分0，而在日光中显示可见混浊的制剂对应于视觉评分3)。当制剂在日光下显示可见混浊时，将其归类为在蛋白质聚集方面是物理不稳定的。或者，可以通过本领域技术人员众所周知的简单的混浊度测量方法来评估制剂的混浊度。还可以使用蛋白质构象状态的光谱试剂或探针来评估水性蛋白质制剂的物理稳定性。探针优选优先与蛋白质的非天然构象异构体结合的小分子。蛋白质结构的小分子光谱探针的一个实例是硫磺素(Thioflavin)T。硫磺素T是广泛用于检测淀粉样纤丝的荧光染料。在存在纤丝以及可能有其它蛋白质构型时，硫磺素T在与纤丝蛋白质形式结合后在约450nm处产生新的最大激发并在约482nm处产生增强的发射。未结合的硫磺素T在这些波长基本没有荧光。
其它小分子可以用作由天然状态变成非天然状态的蛋白质结构变化的探针，例如优先与蛋白质暴露的疏水斑结合的“疏水斑”探针。疏水斑通常埋藏在处于其天然状态的蛋白质的三级结构之中，但是在蛋白质开始去折叠或变性时成为暴露的。这些小分子光谱探针的实例是芳香族、疏水性染料，诸如antrhacene、吖啶、菲咯啉、诸如此类。其它光谱探针有金属-氨基酸复合物，诸如疏水氨基酸(诸如苯丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、和缬氨酸等等)的钴金属复合物。
术语“化学稳定性”在本文中用于蛋白质制剂时指蛋白质结构中导致化学降解产物形成的化学共价变化，与天然蛋白质结构相比所述化学降解产物的生物学效力可能降低和/或免疫原性可能升高。根据天然蛋白质的类型和本质以及蛋白质所暴露的环境，可能形成多种化学降解产物。正如本领域技术人员众所周知的，几乎不可能完全避免或消除化学降解，而且在蛋白质制剂的贮藏和使用过程中常常看到化学降解产物的数量增加。大多数蛋白质倾向于脱酰胺，在这个过程中谷氨酰胺酰或天冬酰胺酰残基的侧链酰胺基团水解而形成游离的羧酸。其它降解途径涉及高分子量转化产物的形成，其中两个或多个蛋白质分子通过转酰胺基作用和/或二硫键作用彼此共价结合，导致共价结合二聚体、寡聚体、和多聚体降解产物的形成(Stability of ProteinPharmaceuticals，Ahern T.J.和Manning M.C.，Plenum出版社，纽约，1992)。(例如甲硫氨酸残基的)氧化是化学降解的另一种变型。可以通过在暴露于不同环境条件后的多个时间点测量化学降解产物的数量来评估蛋白质制剂的化学稳定性(常常可以通过例如提高温度来加速降解产物的形成)。常常通过根据分子量和/或电荷使用多种层析技术(例如SEC-HPLC和/或RP-HPLC)分离降解产物来测定每一种降解产物的数量。
因此，如上所述，“稳定的制剂”指物理稳定性提高、化学稳定性提高、或物理和化学稳定性提高的制剂。一般而言，制剂在使用和贮藏过程中必需是稳定的(依照推荐的使用和贮藏条件)，直至有效期满。
实施例如WO 04/55168中所述，在大肠杆菌中以包涵体的形式表达具有N端延伸的重组白介素21(IL21)(Met-Ser-hIL21)。通过大肠杆菌中存在的蛋白酶系统切除N末端Met残基，剩下Ser-hIL21。可以含有或不含Glu-Ala-Glu氨基酸序列。
使蛋白质重折叠，并使用传统层析法将其纯化至90-95％纯度。
然后将纯的蛋白质N端PEG化，即通过与高碘酸钠反应将N末端丝氨酸氧化，随后与附着了羟胺的PEG衍生物反应产生肟。
使用凝胶过滤或大小排阻层析(SEC)进行后续纯化。
在增殖测定法中，例如下文所述BAF3测定法，PEG化IL21与未PEG化标准物是等效的，指示PEG化并未干扰受体的结合，而且反应流程对蛋白质无害。
预备性实施例可以与上文所述将化学部分(moiety)附着到其它肽或蛋白质上的方法类似的执行将PEG部分(moiety)附着到IL-21衍生物C末端的方法。
可以通过两步法将PEG部分(moiety)附着到IL-21或其衍生物(诸如例如hIL-21)的C末端。
第一步，在合适缓冲液(诸如HEPES/TMEDA缓冲液)中，在合适的pH(诸如例如pH7.5或pH8)，在合适的温度(诸如例如室温、30℃、或35℃)，在存在合适亲核体(例如(S)-2-氨基-3-(4-(炔丙基氧)苯基)丙酸)的条件下，对合适的IL-21类似物(诸如例如(hIL-21基)丙氨酸)进行由羧肽酶Y(CPY)催化的转肽反应。
第二步，可以将合适的衍生化PEG试剂与(S)-2-((hIL-21基)氨基)-3-(4-(炔丙基氧)苯基)丙酰胺反应。例如，可以在氧化条件(诸如例如次氯酸钠溶液)下将过量的4-(mPEG20000基)-N-(3-(羟基亚氨基)苄基)丁酰胺反应成为4-(mPEG20000基)-N-(3-(氧氰基)苄基丁酰胺。可以将4-(mPEG20000基)-N-(3-(氧氰基)苄基丁酰胺溶液加到(S)-2-((hIL-21基)氨基)-3-(4-(炔丙基氧)苯基)丙酰胺溶液中以产生(S)-2-((hIL-21基)氨基)-3-(4-((3-(3-((4-(mPEG20000基)丁酰基氨基)甲基)苯基)异噁唑-5-基)甲氧基)苯基)丙酰胺。
4-(mPEG20000基)-N-(3-(羟基亚氨基)苄基)丁酰胺可以由商品化的3-((叔丁氧基羰基氨基)甲基)苯甲酸制备，可以例如在两步流程中用本领域技术人员知道的合适的试剂或试剂组合将其还原，第一步包括在存在碱(诸如例如三乙胺)的条件下加入氯甲酸乙酯，通过过滤除去形成的氯化三乙基铵，并加入硼氢化锂以产生叔丁基N-(3-(羟基甲基)苄基)氨基甲酸酯。可以用本领域技术人员知道的合适的试剂或试剂组合(例如使用Swern氧化)将叔丁基N-(3-(羟基甲基)苄基)氨基甲酸酯氧化，包括将醇在例如二氯甲烷中的-78℃溶液加到草酰氯与二甲亚砜在二氯甲烷中的-78℃混合液中，随后加入合适的氨基碱(诸如例如三乙胺)并升温至室温。可以将形成的叔丁基N-(3-甲酰基苄基)氨基甲酸酯与羟胺的游离碱或其合适的盐在例如氢氧化钠的水溶液中反应以产生叔丁基N-(3-((羟基亚氨基)甲基)苄基)。可以通过文献(例如T.W.Green、P.G.M.Wuts，Protective groups in organicsynthesis，第2版，Wiley，纽约，1991)中描述的方法由叔丁基N-(3-((羟基亚氨基)甲基)苄基)除去BOC保护基团，例如用三氟乙酸在二氯甲烷中的50％溶液进行处理以产生3-(氨基甲基)苯甲醛肟。最后，可以通过酰胺形成反应来制备4-(mPEG20000基)-N-(3-(羟基亚氨基)苄基)丁酰胺，包括在存在过量的合适的碱(诸如例如乙基二异丙胺)的条件下将3-(氨基甲基)苯甲醛肟的游离碱或其合适的盐与商业性2，5-二氧吡咯烷基4-(mPEG20000基)丁酸酯(Nektar，2M450P01)进行反应。
在可供选择的第二步中，可以在用2，6-卢剔啶缓冲的水中制备适当量的五水合硫酸铜(例如5％或10％或相对于(S)-2-((hIL-21基)氨基)-3-(4-(炔丙基氧)苯基)丙酰胺的1个当量或10个当量)和适当量的L-抗坏血酸(诸如相对于(S)-2-((hIL-21基)氨基)-3-(4-(炔丙基氧)苯基)丙酰胺的50当量)的混合物。适当时间(诸如5分钟)后，可以将此溶液加到用2，6-卢剔啶缓冲的(S)-2-((hIL-21基)氨基)-3-(4-(炔丙基氧)苯基)丙酰胺和N-(2-(mPEG20000基)乙基)11-叠氮十一酰胺的溶液中。可以将反应混合液保持在适当的温度(诸如例如室温)直至可能形成了选自(S)-((hIL-21)氨基)-3-(4-((1-(10-(N-(2-(mPEG20000基)乙基)氨基甲酰基)癸基)-1，2，3-三唑-4-基)甲氧基)苯基)和(S)-((hIL-21)氨基)-3-(4-((1-(10-(N-(2-(mPEG20000基)乙基)氨基甲酰基)癸基)-1，2，3-三唑-5-基)甲氧基)苯基)的单一化合物与？的混合物。
N-(2-(mPEG20000基)乙基)11-叠氮十一酰胺的合成可以通过商业性甲基11-溴十一酸酯与叠氮化钠在适当溶剂(诸如例如N，N-二甲基甲酰胺)中在适当温度(例如60℃)的反应来进行。可以通过本领域技术人员知道的和文献(例如T.W.Green、P.G.M.Wuts，Protectivegroups in organic synthesis，第2版，Wiley，纽约，1991)中描述的方法将形成的甲基11-叠氮十一酸酯皂化，诸如例如甲醇中的氢氧化钾或四氢呋喃中的三乙基硅烷醇钾。可以通过本领域技术人员知道的方法将由此产生的酸活化，例如与2-琥珀酰亚胺基-1，1，3，3-四甲基脲四氟硼酸盐(TSTu)在合适的溶剂(诸如例如N，N-二甲基甲酰胺)中在合适的温度(诸如例如室温)反应以产生11-叠氮-N-2，5-二氧吡咯烷-1-基十一酰胺。可以将11-叠氮-N-2，5-二氧吡咯烷-1-基十一酰胺与商业性(2-(mPEG20000基)乙基)胺(Nektar，2M2U0P01)在合适的溶剂(诸如例如二氯甲烷)中在存在合适的碱(诸如例如三乙胺或乙基二异丙胺)的条件下反应以产生N-(2-(mPEG20000基)乙基)11-叠氮十一酰胺。
实施例1-(((((4-((4-(mPEG-20000基)丁酰基)氨基)丁氧亚氨基乙酰基)丝氨酰)谷氨酰)丙氨酰)谷氨酰)hIL-21第一步2-(4-(叔丁氧基羰基氨氧基)丁基)异吲哚-1，3-二酮
向商业性N-(4-溴丁基)苯邻二甲酰亚胺(2.82g，10mmol)和N-Boc-羟胺(2.08g，15.6mmol)的混合物中加入乙腈(2ml)，接着加入1，8-二氮二环[5.4.0]十一-7-烯(2.25ml，15mmol)。将反应混合物于室温搅动30分钟，然后于50℃搅动2天。用水(30ml)和1N盐酸(20ml)的混合液进行稀释。用乙酸乙酯(2×100ml)进行萃取。用盐水(50ml)清洗有机相，并用硫酸镁干燥。通过层析用二氧化硅(60g)纯化粗制的产品，使用庚烷/乙酸乙酯1∶0至0∶1梯度作为洗脱液，得到2.08g2-(4-(叔丁氧基羰基氨氧基)丁基)异吲哚-1，3-二酮。
第二步N-(4-氨基丁氧基)氨基甲酸叔丁酯 将水合肼(1.0ml，20mmol)加到2-(4-(叔丁氧基羰基氨氧基)丁基)异吲哚-1，3-二酮(2.08g，6.22mmol)在乙醇(8.0ml)中的溶液中。将反应混合物于80℃搅动65小时。真空除去溶剂。将残余物溶于甲苯(10ml)，并真空除去溶剂。将残余物悬浮于1N盐酸(10ml)。通过过滤除去沉淀，并用水(2ml)清洗。将滤出液和清洗液合并，并用碳酸钾调至碱性。用二氯甲烷(4×20ml)萃取该溶液。用硫酸镁干燥有机相。真空除去溶剂，得到0.39g N-(4-氨基丁氧基)氨基甲酸叔丁酯。将碳酸钾(3g)加到水相中，并用二氯甲烷(3×20ml)进行萃取。将有机层合并，并用硫酸镁干燥。真空除去溶剂，又得到0.39gN-(4-氨基丁氧基)氨基甲酸叔丁酯。
第三步N-(4-(4-(mPEG20000基)丁酰基氨基)丁氧基)氨基甲酸叔丁酯
将商业性mPEG2000基丁酸的N-羟基琥珀酰亚胺酯(Nektar，“mPEG-SBA”，#2M450P01，3g，0.15mmol)溶于二氯甲烷(25ml)。添加N-(4-氨基丁氧基)氨基甲酸叔丁酯(0.12g，0.59mmol)。将反应混合物于室温摇动。添加乙醚直至得到沉淀。通过过滤分离沉淀。将该材料真空干燥，得到2.39g N-(4-(4-(mPEG20000基)丁酰基氨基)丁氧基)氨基甲酸叔丁酯。
第四步N-(4-氨氧基丁基)-4-(mPEG20000基)丁酰胺 将三氟乙酸(20ml)加到N-(4-(4-(mPEG20000基)丁酰基氨基)丁氧基)氨基甲酸叔丁酯(2.39g，0.12mmol)在二氯甲烷(20ml)中的溶液中。将反应混合物摇动30分钟。添加乙醚(100ml)。通过过滤分离形成的沉淀。用乙醚(2×100ml)进行清洗，并真空干燥，得到1.96gN-(4-氨氧基丁基)-4-(mPEG20000基)丁酰胺。
第五步将1-((((丝氨酰)谷氨酰)丙氨酰)谷氨酰)hIL-21(4mg，在磷酸盐缓冲液中冻干，252nmol)溶于0.400ml缓冲液，该缓冲液由三乙醇胺(0.008ml)和水(4ml)构成。连续添加甲硫氨酸(3.15mg，21420nmol)的水溶液(0.12ml)和高碘酸钠溶液(0.38mg，1890nmol)。将反应混合物于室温静置30分钟。添加N-(4-氨氧基丁基)-4-(mPEG20000基)丁酰胺(77mg，3780nmol)的水溶液(0.240ml)。用冰乙酸(0.004ml)将pH调至pH4-5。将反应混合物于室温静置16小时。将反应混合液用三乙醇胺(12mg)的水溶液(3.2ml)进行稀释，并保存于-18℃直至纯化。
蛋白质化学在大肠杆菌中以包涵体的形式表达具有N端延伸的重组白介素21(IL21)(Met-Ser-Glu-Ala-Glu-hIL21)。通过大肠杆菌中存在的蛋白酶系统切除N末端Met残基，剩下Ser-Glu-Ala-Glu-hIL21。可以含有或不含Glu-Ala-Glu氨基酸序列(我们用Met-Ser-hIL21开始实验)。
使蛋白质重折叠，并使用常规的层析法将其纯化至90-95％纯度。
然后通过步骤1-5中描述的反应将纯的蛋白质N端PEG化。
使用凝胶过滤或大小排阻层析(SEC)进行后续纯化。
在增殖测定法中，PEG化IL21显示与未PEG化标准物相似的效力，指示PEG化并未干扰受体的结合，而且反应流程对蛋白质无害。
药理学方法使用Baf-3(IL21R)细胞的增殖测定法在含IL-3的培养基中培养经鼠源或人源IL21R转染的IL-3依赖性Baf-3细胞，直至进行增殖测定法(优选3天)。
用不含IL-3的培养基清洗用于实验的细胞，并在测定培养基(不含IL-3)中以50.000c/w分到96孔板中。以10-7M至10-13M的系列稀释度添加IL-21，并将细胞于37℃、5％CO2进行孵育。培养66小时后向所有孔中加入alamarBlue(Biosource)，并将细胞继续培养6小时。若细胞生长，则alamarBlue减少，培养基的颜色由蓝变红。然后在Fluostar(bmg)上读取550nm(激发)和590nm(发射)的值，并用Prism(GrafPad software)进行分析。
Baf-3细胞的参考文献Palacios，R.和Steinmetz，M.，1985，Cell 41727-734。
在小鼠中进行的PEG-hIL-21 PK研究的描述这项实验是对小鼠静脉内和皮下施用单个剂量的PEG20K-hIL-21、PEG40K-hIL-21、和hIL-21，以获得PEG-hIL-21的生物利用度和药动学特征。
材料和方法实验中包括48只体重大约25g的雌性C57BL/6Jbom(来自Bomholtgrd，Ry，丹麦)。
研究过程中将依照动物单位中的标准程序(标准操作流程编号010364)饲养和操作动物，而且允许其自由获取饲料和饮水。
测试制剂hIL-21、PEG20k-hIL-21、和PEG40k-hIL-21的浓度是200μg/ml。将测试物溶于pH7.4的PBS缓冲液。
给药如下给药测试物20μg/25g小鼠，对应于0.8μg/g小鼠体重。
静脉内注射在尾静脉进行，体积0.1ml。
皮下注射在颈后进行，体积0.1ml。
血样如下采集血样静脉内注射后服药前以及服药后5、10、20、30、45分钟，1、1.5、2、4、和6小时。
皮下注射后服药前以及服药后10、30分钟、1、1.5、2、3、4、6、8、和24小时。
由眼眶静脉丛采集血样。每个采样时间采集大约0.1-0.2ml血液。每只动物采集三次血样。每个时间点由两只动物采集血样。
将血样收集在Micronic试管中，而且在离心(1200mxg，4℃，10分钟)前在冰上保存最多20分钟。
离心后立即将25μl血浆样品转移到Micronic管中，并保存于-20℃直至分析。
测定通过特定的免疫测定法(Immunochemistry，Novo Nordisk A/S)对血浆样品分析hIL-21含量。
通过非房室和房室药动学方法分析血浆浓度-时间曲线。
权利要求
1.包含聚合分子或亲脂性衍生物的IL-21或其变体的衍生物。
2.权利要求1的衍生物，其中聚合分子是一个或多个PEG基团。
3.权利要求2的衍生物，其中聚合分子是一个或多个PEG基团，它们的分子量为5kDa、10kDa、20kDa、30kDa、40kDa、或60kDa且可以是线性的或分支的。
4.依照任一上述权利要求的IL-21或其变体的衍生物，其在N末端包含衍生化。
5.依照权利要求1-3任一项的IL-21或其变体的衍生物，其在C末端包含衍生化。
6.依照权利要求1-3任一项的IL-21或其变体的衍生物，其在肽的内部包含衍生化。
7.依照任一上述权利要求的IL-21的衍生物，其中衍生化位于天然存在的氨基酸。
8.依照权利要求1-6任一项的IL-21变体的衍生物，其中衍生化位于添加入或替代入天然IL-21序列中的氨基酸。
9.在N末端添加了含Ser、Tyr、Lys、或Cys且具有1-10个氨基酸的序列的IL-21变体。
10.变体Ser-hIL21。
11.表达变体Ser-hIL-21的分离的DNA。
12.变体Ser-hIL-21用于与聚合分子进行衍生化作用的用途。
13.IL-21或其变体的衍生物用于制造治疗癌症或感染的药物的用途。
14.通过施用有效量的依照权利要求1-8任一项的IL-21或其变体的衍生物来治疗癌症或感染性疾病的方法。
全文摘要
本发明提供了IL－21或其变体的衍生物。
文档编号C12P21/02GK1867581SQ200480029663
公开日2006年11月22日 申请日期2004年10月8日 优先权日2003年10月10日
发明者B·派施克, C·B·肖德特, H·沃尔迪克, F·Z·多沃尔德, A·沃索 申请人:诺沃挪第克公司