专利名称：利用药用真菌长根菇生产胞外多糖的液体深层发酵工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，是利用生物体的培养、发酵而制备已知的，或新的生物体，或其代谢物的技术。具体涉及一种利用药用真菌长根菇生产胞外多糖的液体深层发酵工艺。
背景技术：
长根菇(Oudemansiella radicata)，别名长根小奥德蘑、大毛草菌、长根金钱菌等。隶属担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、白蘑科、小奥德蘑属。长根菇是食用中的上品，内质细嫩、柄脆可口，富含蛋白质、氨基酸、脂肪、碳水化合物、维生素和微量元素成份，食用价值高，为上乘的珍稀食药用真菌。日本学者大硺重逺等人1977年研究证实长根菇多糖对小白鼠肉瘤S-180有明显抑制作用，抑制率达95％以上，艾氏腹水癌达90％，并能提高肌体免疫功能，具有很高的药用价值。
长根菇是近几年在国内引进栽培的新型药用真菌，目前处于栽培试验及推广阶段，由于固体栽培存在周期长、产量低、气候影响等缺点，限制其大规模开发使用，而采用液体深层发酵培养技术是目前深度开发药用真菌活性多糖资源新的生产方法，并已成功的在灵芝、香菇、灰树花、姬松茸等珍稀药用菌实现规模化生产，国内外对长根菇液体深层发酵技术的研究起步较晚，特别是在反应器上对长根菇发酵生产活性多糖的工程学研究方面，目前还尚未见相关报道。
发明内容
本发明的目的主要是从工业化生产的角度考虑，对长根菇发酵影响的培养基和工艺条件进行了系统的研究，筛选得到能降低工业生产成本的最适培养基成分及工艺条件，提出在7L发酵罐水平长根菇液体深层发酵生产胞外多糖的发酵工艺。
以下用于实现本发明目的的具体技术解决方案菌种本发明使用的菌种是长根菇1号(Oudemansiella radicata)，购自华中农业大学菌种实验中心。
长根菇菌种鉴定孢子无色，光滑，卵圆形至宽圆形，13～18μm×10～15μm。囊体近梭形，75～175μm×10～29μm。褶缘囊体无色，近梭形，顶端稍钝，87～100μm×10～25μm，鉴定依据(卯晓岚主编中国经济真菌，1998年2月，第1版)本发明工艺的总体流程包括斜面菌种培养→摇瓶种子培养→7L发酵罐培养→多糖提取测定1、斜面菌种培养以PDA培养基加5％的麸皮汁，在试管内培养斜面菌种，培养温度25-30℃，培养时间7-10天，pH 6.5-7.0。
2、摇瓶种子培养液体种子培养基(g/L)玉米粉10-30，蛋白胨2-5，黄豆饼粉3-5，蔗糖10-30，KH2PO42-4，MgSO4·7H2O 1-3，VB10.1-0.3培养条件将以活化的斜面菌种切割成黄豆大小的菌丝块，接种2-3块于液体种子培养基，于500ml三角瓶装液量100ml，旋转式摇床培养，转速160-200rev/min，培养温度26-30℃，pH 6.3-6.8，培养时间7-10天。
3、7L发酵罐培养发酵培养基(g/L)玉米粉10-40、黄豆饼粉2-5、KH2PO42-4、MgSO4·7H2O 1-3、棕榈酸0-3、VB10.1-0.3，pH 6.0-6.5；培养条件将培养好的种子培养基按10％(v/v)的接种量接入装有5L发酵培养基的全自动7L发酵罐(上海保兴BIOTECH-7BGZ)中，搅拌转速160-300rev/min，发酵温度26-30℃，通气量3L/min，发酵过程溶解氧(DO)值由溶氧电极在线检测。发酵时间至108-115小时时，溶解氧下降至35-40％，即可终止发酵。
在上述发酵培养基中添加0-3g/L的棕榈酸有利于长根菇菌丝体生长和促进长根菇胞外多糖的合成，最佳添加浓度为1.5g/L，胞外多糖比未添加时提高30-40％。
发酵过程溶解氧消耗速率变化与胞外多糖合成速率变化趋于一致，胞外多糖合成量在110小时左右达最大值(2.80-2.87g/l)时，溶解氧下降到最低值(35％左右)，113小时之后胞外多糖合成量降低，溶解氧开始上升，因此可以在线溶解氧浓度为控制策略，快速判定发酵过程是否结束，当下降到最低值恒定时，即可终止发酵，此为最佳发酵周期，长根菇胞外多糖产量也达最大值。
4、胞外多糖提取及测定将发酵液离心得上清液，向上清液中加入95％乙醇到浓度60％，4℃冰箱过夜，离心得胞外粗多糖，洗涤后蒸馏水溶解，用苯酚-硫酸法测定多糖含量。
本发明所具有的优点本发明提供基于7L发酵罐水平，利用药用真菌长根菇生产胞外多糖液体深层发酵工艺，为实现大规模工业化生产奠定了基础，优化筛选得到有利于降低工业生产成本的廉价原料玉米粉、黄豆饼粉为主要发酵原料，并发现、获得能显著提高长根菇胞外多糖产量达30-40％的棕榈酸为关键营养添加因子，发酵过程以在线溶解氧浓度变化为控制策略，可实现大规模发酵时工艺操作控制简单、可操作性强的特点，从而有利于进一步工业化放大及推广应用。
具体实施例方式
实施例1(添加棕榈酸，发酵控制时间110小时)菌种长根菇1号(Oudemansiella radicata)，购自华中农业大学菌种实验中心。
(1)试管斜面培养在试管内培养斜面菌种培养基PDA培养基加5％(重量百分比)的麸皮汁培养条件培养温度26℃，培养时间8天，pH 6.7。
(3)摇瓶种子培养种子培养基(g/L)玉米粉10，蛋白胨2，黄豆饼粉3，蔗糖20，KH2PO42，MgSO4·7H2O 2，VB10.1；培养条件将以活化的斜面菌种切割成黄豆大小的菌丝块，接种2-3块于液体种子培养基，500ml三角瓶装液量100ml，旋转式摇床培养，转速180rev/min，培养温度26℃，pH 6.5，培养时间7天。
(4)7L发酵罐培养发酵培养基(g/L)玉米粉20、黄豆饼粉3、KH2PO43、MgSO4·7H2O 2、棕榈酸1.5、VB10.1mg，pH 6.2；培养条件将培养好的种子培养基按10％(v/v)的接种量接入装有5L发酵培养基的全自动7L发酵罐(上海保兴BIOTECH-7BGZ)中，搅拌转速180rev/min，发酵温度26℃，通气量3L/min，发酵过程溶解氧(DO)值由溶氧电极在线检测。发酵时间至110小时左右时，溶解氧下降至35％左右，结束发酵，胞外多糖测定2.80-2.87g/L。
实施例2(不添加棕榈酸工艺，发酵控制时间110小时)菌种长根菇1号(Oudemansiella radicata)，购自华中农业大学菌种实验中心。
(1)试管斜面培养在试管内培养斜面菌种，培养基PDA培养基加5％(重量百分比)的麸皮汁培养条件培养温度28℃，培养时间10天，pH 6.7。
(2)摇瓶种子培养种子培养基(g/L)玉米粉20，蛋白胨2，黄豆饼粉3，蔗糖20，KH2PO42，MgSO4·7H2O 1，VB10.1。
培养条件将以活化的斜面菌种切割成黄豆大小的菌丝块，接种2-3块于液体种子培养基，500ml三角瓶装液量100ml，旋转式摇床培养，转速200rev/min，培养温度26℃，pH 6.5，培养时间7天。
(3)7L发酵罐培养发酵培养基(g/L)玉米粉20、黄豆饼粉4、KH2PO43、MgSO4·7H2O 2、VB10.1，pH 6.0；培养条件将培养好的种子培养基按10％(v/v)的接种量接入装有5L发酵培养基的全自动7L发酵罐(上海保兴BIOTECH-7BGZ)中，搅拌转速200rev/min，发酵温度26℃，通气量3L/min，发酵过程溶解氧(DO)值由溶氧电极在线检测。发酵时间至110小时左右时，结束发酵，此时胞外多糖含量2.1-2.2g/L。
实施例3(添加棕榈酸，发酵控制时间为113小时)菌种长根菇1号(Oudemansiella radicata)，购自华中农业大学菌种实验中心。
(1)试管斜面培养在试管内培养斜面菌种培养基PDA培养基加5％(重量百分比)的麸皮汁培养条件培养温度26℃，培养时间8天，pH 6.5。
(2)摇瓶种子培养种子培养基(g/L)玉米粉10，蛋白胨2，黄豆饼粉3，蔗糖20，KH2PO42，MgSO4·7H2O1，VB10.1；培养条件将以活化的斜面菌种切割成黄豆大小的菌丝块，接种2-3块于液体种子培养基，500ml三角瓶装液量100ml，旋转式摇床培养，转速160rev/min，培养温度26℃，pH 6.5，培养时间8天。
(3)7L发酵罐培养发酵培养基(g/L)玉米粉20、黄豆饼粉3、KH2PO43、MgSO4·7H2O 2、棕榈酸1.5、VB10.1，pH 6.0。
培养条件将培养好的种子培养基按10％(v/v)的接种量接入装有5L发酵培养基的全自动7L发酵罐(上海保兴BIOTECH-7BGZ)中，搅拌转速180rev/min，发酵温度26℃，通气量3L/min，发酵过程溶解氧(DO)值由溶氧电极在线检测。发酵时间至113小时左右时，溶解氧下降至38％左右，结束发酵，测定胞外多糖含量为2.76-2.84g/L。
实施例4菌种长根菇1号(Oudemansiella radicata)，购自华中农业大学菌种实验中心。
(1)试管斜面培养在试管内培养斜面菌种培养基PDA培养基加5％(重量百分比)的麸皮汁培养条件培养温度26℃，培养时间8天，pH 6.8。
(2)摇瓶种子培养种子培养基(g/L)玉米粉20，蛋白胨2，黄豆饼粉4，蔗糖20，KH2PO44，MgSO4·7H2O2，VB10.1；培养条件将以活化的斜面菌种切割成黄豆大小的菌丝块，接种2-3块于液体种子培养基，500ml三角瓶装液量100ml，旋转式摇床培养，转速200rev/min，培养温度28℃，pH 6.5，培养时间8天。
(3)7L发酵罐培养发酵培养基(g/L)玉米粉30、黄豆饼粉4、KH2PO43、MgSO4·7H2O 2、棕榈酸1.5、VB10.1，pH 6.5。
培养条件将培养好的种子培养基按10％(v/v)的接种量接入装有5L发酵培养基的全自动7L发酵罐(上海保兴BIOTECH-7BGZ)中，搅拌转速180rev/min，发酵温度26℃，通气量3L/min，发酵过程溶解氧(DO)值由溶氧电极在线检测。发酵时间至110小时左右时，溶解氧下降至35％左右，结束发酵，测定胞外多糖含量为2.65-2.80g/L。
实施例5菌种长根菇1号(Oudemansiella radicata)，购自华中农业大学菌种实验中心。
(1)试管斜面培养在试管内培养斜面菌种培养基PDA培养基加5％(重量百分比)的麸皮汁培养条件培养温度26℃，培养时间8天，pH 6.7。
(2)摇瓶种子培养种子培养基(g/L)玉米粉20，蛋白胨3，黄豆饼粉3，蔗糖10，KH2PO42，MgSO4·7H2O1，VB10.1；培养条件将以活化的斜面菌种切割成黄豆大小的菌丝块，接种2-3块于液体种子培养基，500ml三角瓶装液量100ml，旋转式摇床培养，转速180rev/min，培养温度28℃，pH 6.5，培养时间9天。
(3)7L发酵罐培养发酵培养基(g/L)玉米粉40、黄豆饼粉3、KH2PO42、MgSO4·7H2O 1、棕榈酸1.5、VB10.1，pH 6.5。
培养条件将培养好的种子培养基按10％(v/v)的接种量接入装有5L发酵培养基的全自动7L发酵罐(上海保兴BIOTECH-7BGZ)中，搅拌转速180rev/min，发酵温度28℃，通气量3L/min，发酵过程溶解氧(DO)值由溶氧电极在线检测。发酵时间至110小时左右时，溶解氧下降至37％左右，结束发酵，测定胞外多糖含量为2.54-2.65g/L。
权利要求
1.利用药用真菌长根菇生产胞外多糖的液体深层发酵工艺，菌种长根菇1号(Oudemansiella radicata)，购自华中农业大学菌种实验中心；按以下步骤进行(1)斜面菌种培养以PDA培养基加5％的麸皮汁，在试管内培养斜面菌种，培养温度25-30℃，培养时间7-10天，pH6.5-7.0；(2)摇瓶种子培养液体种子培养基(g/L)玉米粉10-30，蛋白胨2-5，黄豆饼粉3-5，蔗糖10-30，KH2PO42-4，MgSO4·7H2O 1-3，VB10.1-0.3；培养条件将已活化的斜面菌种切割成黄豆大小的菌丝块，接种2-3块于液体种子培养基，于500ml三角瓶装液量100ml，旋转式摇床培养，转速160-200rev/min，培养温度26-30℃，pH6.3-6.8，培养时间7-10天；(3)7L发酵罐培养发酵培养基(g/L)玉米粉10-40、黄豆饼粉2-5、KH2PO42-4、MgSO4·7H2O1-3、棕榈酸0-3、VB10.1-0.3，pH6.0-6.5；培养条件将培养好的种子培养基按10％(v/v)的接种量接入装有5L发酵培养基的全自动7L发酵罐中，搅拌转速160-300rev/min，发酵温度26-30℃，通气量3L/min，发酵过程溶解氧(DO)值由溶氧电极在线检测，发酵时间至108-115小时时，溶解氧下降至35-40％，即可终止发酵；(4)胞外多糖提取及测定。
全文摘要
本发明涉及一种利用药用真菌长根菇生产胞外多糖的液体深层发酵工艺，菌种为长根菇1号(Oudemansiella radicata)，购自华中农业大学菌种实验中心；本发明工艺的总体流程包括斜面菌种培养→摇瓶种子培养→7L发酵罐培养→多糖提取测定，本发明优化筛选得到有利于降低工业生产成本的廉价原料玉米粉、黄豆饼粉为主要发酵原料，并发现、获得能显著提高长根菇胞外多糖产量达30－40％的棕榈酸为关键营养添加因子，发酵过程以在线溶解氧浓度变化为控制策略，可实现大规模发酵时工艺操作控制简单、可操作性强的特点，有利于进一步工业化放大及推广应用。
文档编号C12P19/04GK1683547SQ20051002038
公开日2005年10月19日 申请日期2005年2月18日 优先权日2005年2月18日
发明者邹祥, 胡昌华 申请人:西南师范大学