专利名称：克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒，通过采用repPCR(representative sampling of multiple repetitive units PCR)技术对产前或孕前夫妇双方外周血中分子标记物的检测，为妊娠胎儿是否需要进行染色体检查提供依据，以及本发明试剂盒在判断妊娠胎儿是否需要进行基于诊断克氏综合征的染色体检查中的应用。
背景技术：
克氏综合征(Klinefelt)是一种由染色体数目异常而引起的先天性疾病。正常男子染色体核型为46，xY，女子为46，xx。如果男子染色体核型中x增多，就会引起这种病。X染色体全部着丝粒区α-卫星DNA约含1500个单拷贝串联重复序列，每个单拷贝串联重复序列的长度约为2kb，含12个171bp单体，各单体之间的核苷酸种类约有35％的差异。如果X染色体着丝粒区α-卫星DNA发生重组，会造成单拷贝串联重复序列长度的改变。α-卫星DNA的变异可能会影响着丝粒蛋白的正常附着，从而造成着丝粒丧失正常的功能，最终导致染色体不能正常分离，引起染色体非整倍体畸变。X染色体非整倍体畸变引起的染色体病在群体中的发病率高达1/300。克氏综合征是临床上最常见的X染色体非整倍体畸变类型之一，500-800个男子中可能发生1例，其典型的核型是47，XXY，临床表现为性腺功能减低和不育。得了这种病，睾丸的曲细精管发育不全、变性、纤维化，不能生成精子，无生育能力。但间质细胞受损较轻，因而能产生一定量的睾酮。病人在出生时和儿童期与正常人没有什么差别，只是到了青春期，才显露出一些病态，外观是男性，但睾丸小，阴茎可有一定程度的发育，但也较正常人小。第二性征也有不同程度的发育，有的有少许阴毛及胡须，喉结小，发音尖，身材较高，四肢相对较长。少数病人有男性乳房增生。如结婚，有的无性交能力，有的性功能差，阴茎勃起不坚，射精量极少，精液中无精子，不能生育。化验检查卵泡刺激素明显增高，黄体生成素偏高或增高，睾酮偏低。克氏综合征临床上国内外尚无有效的治疗方法。一般情况下，生育克氏综合征的双亲染色体均正常，目前主要的预防手段是通过对孕期采取胎儿绒毛或孕妇羊水脱落细胞进行胎儿染色体检查，诊断胎儿是否为克氏综合征，确诊后通过人工流产避免胎儿的出生。
无论是绒毛还是羊水细胞的采集均可造成孕妇自然流产率的增加(3％左右)。目前随着患者自我保护意识的增强，由此而造成的医患纠纷不断增加。为此，临床医生通常尽可能避免要求孕妇做此类检查，但由此而造成大部分克氏综合征胎儿出生前漏检，致使新生儿中克氏综合征的发病率无法控制。因此需要一种实验室诊断方法用以预测克氏综合征胎儿的发生风险，以此为依椐来判断妊娠胎儿是否需要进行基于诊断克氏综合征的染色体检查，使孕妇避免不必要的绒毛或羊水细胞采集而导致的自然流产的危险。
目前，国内外在临床上缺乏有效的实验室诊断手段预测克氏综合征胎儿的发生风险。如一对夫妇的亲属中已生育过克氏综合征患儿或该夫妇已生育过一个克氏综合征患儿而还想生育第二胎时，临床医生很难评价该夫妇是否会再次妊娠克氏综合征或再次妊娠克氏综合征胎儿风险的大小，因此无法作出是否需要采集产前绒毛或羊水细胞进行染色体检查的判断，特别是在得知该检查有可能造成流产而医生又无法提供需要进行该检查的依据时，大部分夫妇则选择放弃检查。
发明内容
本发明的目的是提供一种克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒，通过对产前或孕前夫妇双方外周血中分子标记物的检测，为判断妊娠胎儿是否需要进行基于诊断克氏综合征的染色体检查提供依据。
本发明的另一目的是提供克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒在判断妊娠胎儿是否需要进行基于诊断克氏综合征的染色体检查中的应用。
本发明所述克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒包含DNA提取液A、DNA提取液B、蛋白酶K、PCR反应液、PCR特异引物1、PCR特异引物2、Taq酶及标准品和对照品，其中DNA提取液A为细胞裂解液，DNA提取液B为沉淀液，PCR特异引物1为正义链5′-aag cct ttt cct tta tct tca ca-3′，反义链5′-ctgaga atg ctt ccg ttt gcc-3′，PCR特异引物2为正义链5′-att ctc agaaag ttt tct gc-3′，反义链5′-ata acg aat gtt cag ctc cc 3′，标准品分为标准品I和标准品II，标准品I包含长度分别为221bp、562bp和1411bp的病例DNA样品冻干制品，标准品II包含长度为570bp和1774bp的病例DNA样品冻干制品，对照品包括阳性对照品和阴性对照品，阴性对照品为去离子水，阳性对照品为能扩增出221bp、562bp和570bp DNA片段的病例样品。
所述PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和去离子水。
本试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。
PCR特异引物1是221bp和562bp两个异常DNA扩增片段与1411bp的正常DNA扩增片段共同的引物；PCR特异引物2是异常570bp的DNA扩增片段与1774bp的正常DNA扩增片段共同的引物。
其中PCR特异引物1扩增出的异常221bp DNA片段的序列如下5-aagccttt tcgctttatc ttcaca GAAAGACGAGAGAGAAGCATTGTCAGGAACTTCTTTGTGATGATTGCATTCAACTCACAGAGTTGAAGATTCCTTTTGAAACAGCAGTTTCGAAACACTCTTTCTGTGGGATCCGCAAGGGGATATTTGGACCTCTTTGAAGGTTTCGTTGGAAACGGGATAATCTTCACC TAAAA ggc aaacggaagc attctcag-3PCR特异引物1扩增出的异常562bp DNA片段的序列如下5-aagccttt tcgctttatc ttcaca GAAAGACGAGAGAGAAGCATTGTCAGAAACTTCTTTGTGATGATTGCATTCAACTCACAGAGTTGAACAATCCTTTTGATGGAGCAGTTTTGAAACCCTCTTTCTTTGGAATCTGCAAGGGGATATGTGGACCTCTTTGAAGATTTCACTGGAAACGGGATCATCTTCACATAAGAACTAAACAGAAGCATTCTCTGAAACTACTTTGTGATGTTTGTATTCAACTCCCAGAGTTGAACTTTCATTTTGAAAGAGCAGCTATGAAACACTCTTTTTCGAGAATCTGCAAGTGGACGTTTGGAGGGCTTTGAGGCCTGTGGTGGAAAAGGAAATATCTTCACATGAAAACTAGATAGAAGCATTCTCAGAAACGACTTTGTGAGGATGGCATTCAACTCATGGAGTTGAACAATCCTATTGATAGAGCAGATTGGAATCACTCTTTTTGTAGAATCTGCAAATGGAGATTTGGACTGCTTTGAGGCCTACGGTCGTATAGGAAGGAACTTCAGATAAAAggcaaacggaagc attctcag-3PCR特异引物2扩增出的570bp DNA片段的序列如下5-attctcagaaagttttctgcGATGACTGCATTCAACTCACAGAGTTGAACAATCCTTCTGATGGAGCAGTTTTGAAACCCTCTTTCTTTGGAATCTGCAAGGGGATATGTGGACCTCTTTGAAGATTTCACTGGAAACGGGATCATCTTCACATA
AAAACTAAACAGAAGCATTCTCGGAAACTACTTTGTGATGTTTGTATTCACCTCACAGAGTTGAACTTTCCCTTTGATAGCGCAGCTTTGACACACTTTTTCTACAATGTGCAAGTGGCTATTTAGCGGGCTTGGAGGACTGTGTTGGAAAAGGAAATATCTTCTCCTAAAAACGACATAGAAGCATTCTCAGAAACTGCTCTGTGATGATTGCATTCAACTCCCAGAGTTGAACATTCCTTTTGATAGAGCAGTTTGCAAACACTCTTTTTGTAAAATCTGCAAGTGGAGATTTGGACCGCTTTGAGGTCTGTGGTAGTGAAGGAAAGAGCTTCATATAAAAACCAGACGGTAGCACTCTCAGAAAATTCTTTGTGACGATGGAGTTTAACTCAgggagctgaacattcgttat-3本发明试剂盒主要根据克氏综合征胎儿的双亲外周血中存在一些特异性的分子标记物(即562bp、221bp和570bp DNA扩增片段)，采用repPCR方法对双亲外周血中的该类分子标记物进行检测，如果在双亲外周血中同时发现有两个或三个这些分子标记物，妊娠克氏综合征胎儿的风险率将显著高于无标记物发现的夫妇。
与1411bp序列对照(小写加粗字母为引物，小写字母为缺失序列)，重组位点为1411bp序列的小写和大写字母交汇处，即第12个单体区和第5个单体区处(见图1)。562bp片段的序列与1411bp序列的大写字母部分相同5-aagccttt tcgctttatc ttcaca GAAA GACGAGAGAG AAGCATTGTC AGAAACTTCTTTGTGATGAT TGCATTCAAC TCACAGAGTT GAAGATTCCT TTTGA aacag cagtttcgaaacactctttc tgtgg gatccgcaag ggatatttgg acctctttga aggtttcgttggaaacggga taatcttcac ---------------------- gaaacgtcta tatcttcacatcaaacctag acagaagcat tctcagaaag ttttctgcga tgactgcatt ccactcacagagttgaacaa tcctttgtga TGGAGCAGTT TTGAAACCCT CTTTCTTTGG AATCTGCAAGGGGATATGTG GACCTCTTTG AAGATTTCAC TGGAAACGGG ATCATCTTCA CATAAAAACTAAACAGAAGC ATTCTCGGAA ACTATTTTGT GATGTTTGTA TTCAACTCCC AGAGTTGAACTTTCCTTTTG AAAGAGCAGC TATGAAACAC TCTTTTTCGA GAATCTGCAA GTGGACGTTTGGAGGGCTTT GAGGCTGTGG TGGAAAAGGA AATATCTTCA CACAAAAACC AGATAGAAGCATTCTCAGAA ACGACTTTGT GAGGATGGCA TTCAACTACT GGAGTTGACA ATCCTATTGATAGAGCAGAT TGGAATCACT CTTTTTGTAG AATCTGCAAA TGGAGATTTG GACTGCTTTGAGGCCTACGG TGGTACAGGA AGGAACTTCA TATAAAA ggc aaacggaagc attctcag-3
与1411bp序列对照(小写加粗字母为引物，小写字母为缺失序列)，重组位点为1411bp序列的小写和大写字母交汇处，即第1个单体区和第8个单体区处(见图2)。221bp片段的序列与1411bp序列的大写字母部分相同5-aagccttt tcgctttatc ttcaca GAAA GACGAGAGAG AAGCATTGTC AGAAACTTCT TTGTGATGATTGCATTCAAC TCACAGAGTT GAAGATTCCT TTTGAAACAG CAGTTTCGAAACACTCTTTCTGTGGGATCCGCAAG GGATATTTGG ACCTCTTTGA AGGTTTCGTT GGAAACGGGA TAATCTTCACC taaaagctaaacggaagca ttctcagaaa cttctttggg atgtttgcat tcacctcaca ----------------------ggagttgaca atcctattga tagagcagat tggaatcact ctttttgtag aatctgcaaa tggagatttggactgctttg aggcctacgg tggtacagga aggaacttca ta TAAAA ggc aaacggaagc attctcag-3与1774bp序列对照(小写加粗字母为引物，小写字母为缺失序列)，重组位点为1774bp序列的小写和大写字母交汇处，即第1个单体区和第6个单体区处(见图3)。570bp片段的序列与1774bp序列的大写字母部分相同5-attctcagaaagttttctgcGATGACTGCATTCAACTCACAGAGTTGAACAATCCTTCTGATGGAGCAGTTTTGAAACCCTCTTTCTTTGGAATCTGCAAGGGGATATGTGGACCTCTTTGAAGATTTCACTGGAAACGGGATCATCTTCACATAAAAACTAAACAGAAGCATTCTCGGAAACTAttttgtgatgtttgtattcaactcccagagttgaactttccttttgaaaga-----------------------gatatttggacctctttgaaggtttcgttggaaacgggataatcttcacctaaaagctaaacggaagcattctcagaaacttCTTTGGGATGTTTGCATTCACCTCACAGAGTTGAAGTTTCCCTTTGATAGCGCAGTTTGACACACTTTTTCTACAATGTGCAAGTGGCTATTTAGCGGGCTTGGAGGACTGTGTTGGAAAAGGAAATATCTTCTCCTAAAAACGACATAGAAGCATTCTCAGAAACTGCTCTGTGATGATTGCATTCAACTCCCAGAGTTGAACATTCCTTTTGATAGAGCAGTTTGCAAACACTCTTTTTGTAGAATCTGCAAGTGGAGATTTGGACCGCTTTGAGGCCTGTGGTAGTGAAGGAAAGAACTTCATATAAAAACCAGACGGTAGCACTCTCAGAAAATTCTTTGTGACGATGGAGTTTAACTCAgggagctgaacattcgttat-3同时通过测序找到了1774bp及1411bp DNA序列内部由于片段缺失而分别产生570bp和562bp与221bp，即妊娠克氏综合征胎儿双亲外周血中的分子标记物221bp和562bpDNA扩增片段是由于1411bp DNA序列内部片段缺失产生的，而标记物570bp DNA扩增片段是由1774bp DNA序列内部片段缺失产生的。
综上所述，核型正常个体与克氏综合征患者的X染色体着丝粒区α-卫星DNA中均存在变异片段，但克氏综合征患者的双亲X染色体着丝粒区α-卫星DNA表现出较正常人更频繁的变异片段，而且有三个重组热点。在双亲外周血中任两个或三个变异片段(562bp、221bp和570bpDNA片段)同时出现与胎儿克氏综合征发生的风险性密切相关，可作为临床进一步进行绒毛或羊水细胞染色体检查的重要参考指标。
本发明的另一个方面还提供了克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒在判断妊娠胎儿是否需要进行基于诊断克氏综合征的染色体检查中的应用。本发明试剂盒的使用方法步骤为每次检测、每一个PCR反应体系均应设立阳性对照和阴性对照。
1)DNA提取从抗凝血细胞中提取基因组DNA，作为待测样本；2)PCR扩增在PCR反应体系中加入PCR反应液、PCR特异引物、Taq酶和模板，进行PCR反应；3)琼脂糖凝胶电泳、照相将标准品稀释液和每个反应管中的PCR产物在琼脂糖凝胶上电泳，然后在溴化乙锭溶液中浸泡，最后在凝胶成相仪上观察和照相；4)结果判定标准品I在琼脂糖凝胶上电泳出221bp和562bp DNA的两个条带；标准品II电泳出570bp DNA的一个条带，阳性对照出现221bp、562bp和570bpDNA三个条带，阴性对照无任何条带。根据琼脂糖凝胶电泳条带成像分析，观察双亲外周血中221bp、562bp和570bpDNA异常条带出现的情况来确定胎儿发生克氏综合征风险性的大小，为临床上进一步检查提供依据。
本发明的优点及有益效果为1、本发明试剂盒可为临床医生或优生咨询夫妇作出是否需要进行基于诊断克氏综合征的染色体检查的决定提供重要依据，既可避免由于盲目取绒毛或羊水而导致自然流产的风险，又可有效地控制克氏综合征胎儿的出生率。
2、本发明试剂盒所涉及的实验室技术和仪器目前在县级医院以及部分区级医院都已具备，并且用双亲外周血进行检查，取材安全、方便，其操作过程简单，方法稳定，易于推广。
图1为克氏综合征胎儿双亲外周血中562bp扩增片段产生示意图；图2为克氏综合征胎儿双亲外周血中221bp扩增片段产生示意图；图3为克氏综合征胎儿双亲外周血中570bp扩增片段产生示意图。
图中N表示断点。
具体实施例方式
实施例1克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒的配制克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒包含DNA提取液A、DNA提取液B、蛋白酶K、PCR反应液、PCR特异引物1、PCR特异引物2、Taq酶及标准品I、标准品II和阳性对照品、阴性对照品，其中DNA提取液A为细胞裂解液，包含EDTA、十二烷基磺酸钠(SDS)、无DNase的RNase裂解缓冲液。
DNA提取液B为沉淀液，通常使用的是NH4Ac盐类。
PCR反应液含有10×PCR缓冲液2.5μl、MgCL 2μl、dNTP0.5μl和去离子水17.75μl。
PCR特异引物1为正义链5′-aag cct ttt cct tta tct tca ca-3′，反义链5′-ctg aga atg ctt ccg ttt gcc-3′，PCR特异引物2为正义链5′-att ctc aga aag ttt tct gc-3′，反义链5′-ata acg aat gtt cag ctc cc 3′，PCR特异引物1和PCR特异引物2的正义链和反义链交由上海生工公司合成，用去离子水最终稀释为10pmol/μl；标准品I包含长度分别为221bp、562bp和1411bp DNA链的病例DNA样品冻干制品，以上序列均经过测序鉴定为要求序列221bp DNA片段序列5-aagccttt tcgctttatc ttcaca GAAAGACGAGAGAGAAGCATTGTCAGGAACTTCTTTGTGATGATTGCATTCAACTCACAGAGTTGAAGATTCCTTTTGAAACAGCAGTTTCGAAACACTCTTTCTGTGGGATCCGCAAGGGGATATTTGGACCTCTTTGAAGGTTTCGTTGGAAACGGGATAATCTTCACC TAAAA ggc aaacggaagc attctcag-3
562bp DNA片段序列5-aagccttt tcgctttatc ttcaca GAAAGACGAGAGAGAAGCATTGTCAGAAACTTCTTTGTGATGATTGCATTCAACTCACAGAGTTGAACAATCCTTTTGATGGAGCAGTTTTGAAACCCTCTTTCTTTGGAATCTGCAAGGGGATATGTGGACCTCTTTGAAGATTTCACTGGAAACGGGATCATCTTCACATAAGAACTAAACAGAAGCATTCTCTGAAACTACTTTGTGATGTTTGTATTCAACTCCCAGAGTTGAACTTTCATTTTGAAAGAGCAGCTATGAAACACTCTTTTTCGAGAATCTGCAAGTGGACGTTTGGAGGGCTTTGAGGCCTGTGGTGGAAAAGGAAATATCTTCACATGAAAACTAGATAGAAGCATTCTCAGAAACGACTTTGTGAGGATGGCATTCAACTCATGGAGTTGAACAATCCTATTGATAGAGCAGATTGGAATCACTCTTTTTGTAGAATCTGCAAATGGAGATTTGGACTGCTTTGAGGCCTACGGTCGTATAGGAAGGAACTTCAGATAAAAggcaaacggaagc attctcag-3标准品II包含长度为570bp和1774bp的病例DNA样品冻干制品，并经测序鉴定为要求序列570bp DNA片段序列5-attctcagaaagttttctgcGATGACTGCATTCAACTCACAGAGTTGAACAATCCTTCTGATGGAGCAGTTTTGAAACCCTCTTTCTTTGGAATCTGCAAGGGGATATGTGGACCTCTTTGAAGATTTCACTGGAAACGGGATCATCTTCACATAAAAACTAAACAGAAGCATTCTCGGAAACTACTTTGTGATGTTTGTATTCACCTCACAGAGTTGAACTTTCCCTTTGATAGCGCAGCTTTGACACACTTTTTCTACAATGTGCAAGTGGCTATTTAGCGGGCTTGGAGGACTGTGTTGGAAAAGGAAATATCTTCTCCTAAAAACGACATAGAAGCATTCTCAGAAACTGCTCTGTGATGATTGCATTCAACTCCCAGAGTTGAACATTCCTTTTGATAGAGCAGTTTGCAAACACTCTTTTTGTAAAATCTGCAAGTGGAGATTTGGACCGCTTTGAGGTCTGTGGTAGTGAAGGAAAGAGCTTCATATAAAAACCAGACGGTAGCACTCTCAGAAAATTCTTTGTGACGATGGAGTTTAACTCAgggagctgaacattcgttat-3将标准品I和标准品II用去离子水稀释为30ng/μl备用；阴性对照品为去离子水，即在PCR反应体系中不加模板，阳性对照品为能扩增出221bp、562bp和570bp DNA片段的病例样品。
实施例2用克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒检测双亲外周血中的分子标记物(一)样品DNA制备1、抽取外周血1ml，加入枸橼酸钠抗凝，再取出200μl于1.5ml无菌EP管中；2、在EP管中加入400μl DNA提取液A，后再加入3μl蛋白酶K混匀，置于55℃水浴5-10分钟或更久，其间上下混匀几次，根据样品降解程度调整消化时间；3、加入600μl氯仿混匀，不能太剧烈，以保证DNA的完整性；4、在台式高速离心机上，10000rpm，室温离心2分钟；5、离心后分成三层，基因组DNA在上层中，取500μl上清夜，移至1.5ml无菌EP管中，中下层废弃；6、加入500μlDNA提取液B混匀，室温放置2分钟；7、在台式高速离心机上，10000rpm，室温离心2分钟；8、吸去上清，但注意不要吸到沉淀，立即加入100μl，1.2mol/L的NaCL，轻轻振荡直至DNA样品完全溶解，加入3μlRNase A，置于37℃10分钟，以祛除RNA；9、加入300μl预冷无水乙醇，-20℃放置10分钟；10、在台式高速离心机上，10000rpm，室温离心3分钟；11、吸走或倒掉乙醇，用70％乙醇洗一次，室温干燥，注意勿让DNA干透；12、加入100μlTE溶解DNA，-20℃保存备用。
(二)(rep)PCR扩增PCR反应体系I加入2μl待测标本、0.25μl Taq酶和21.75μl PCR反应液和PCR特异引物1正义链和反义链各0.5μl反应条件94℃4分钟预变性；94℃50秒变性，60℃1分钟复性，72℃2分钟延伸，30个循环，72℃7分钟终末延伸。
PCR反应体系II加入2μl待测标本、0.25μl Taq酶和21.75μl PCR反应液和PCR特异引物2正义链和反义链各0.5μl反应条件94℃4分钟预变性；94℃50秒变性，60℃1分钟复性，72℃2分钟延伸，30个循环，72℃7分钟终末延伸。
在PCR仪上进行，总体积25μl，同时设置阳性和阴性对照，方法见前述。
(三)琼脂糖凝胶电泳、成像，以及结果分析从每个反应管中各取PCR扩增产物5μl，及标准品1和标准品2的溶液各5μl加1μl上样缓冲液，在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，4V/cm，40min，电泳缓冲液为0.5×TBE。电泳结束后在0.5μg/ml的溴化乙锭溶液中浸泡10分钟，然后在凝胶成像仪上观察、照相。
结果分析在阳性和阴性对照，标准品1和标准品2电泳成像正确的前提下，如果在双亲外周血中任两个或三个变异片段(562bp、221bp和570bpDNA片段)同时出现，预示妊娠克氏综合征胎儿的风险性很高(与正常比较P＜0.05，有显著性差异)，可作为临床进一步进行流产风险性较大的绒毛或羊水细胞染色体检查的重要参考指标。
SEQUENCE LISTING<110>翁亚光<120>克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒及应用<160>7<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>23<212>DNA<213>人工合成<400>1aagccttttc ctttatcttc aca23<210>2<211>21<212>DNA<213>人工合成<400>2ctgagaatgc ttccgtttgc c 21<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3attctcagaa agttttctgc20<210>4
<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>4ataacgaatg ttcagctccc20<210>5<211>221<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>5aagccttttc gctttatctt cacagaaaga cgagagagaa gcattgtcag gaacttcttt 60gtgatgattg cattcaactc acagagttga agattccttt tgaaacagca gtttcgaaac 120actctttctg tgggatccgc aaggggatat ttggacctct ttgaaggttt cgttggaaac 180gggataatct tcacctaaaa ggcaaacgga agcattctca g 221<210>6<211>562<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>6aagccttttc gctttatctt cacagaaaga cgagagagaa gcattgtcag aaacttcttt 60gtgatgattg cattcaactc acagagttga acaatccttt tgatggagca gttttgaaac 120cctctttctt tggaatctgc aaggggatat gtggacctct ttgaagattt cactggaaac 180gggatcatct tcacataaga actaaacaga agcattctct gaaactactt tgtgatgttt 240gtattcaact cccagagttg aactttcatt ttgaaagagc agctatgaaa cactcttttt 300cgagaatctg caagtggacg tttggagggc tttgaggcct gtggtggaaa aggaaatatc 360
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权利要求
1.克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒，其特征在于包含DNA提取液A、DNA提取液B、蛋白酶K、PCR反应液、PCR特异引物1、PCR特异引物2、Taq酶及标准品和对照品，其中DNA提取液A为细胞裂解液，DNA提取液B为沉淀液，PCR特异引物1为正义链5′-aag cct ttt cct tta tct tca ca-3′，反义链5′-ctg aga atg ctt ccg ttt gcc-3′，PCR特异引物2为正义链5′-att ctcaga aag ttt tct gc-3′，反义链5′-ata acg aat gtt cag ctc cc 3′，标准品分为标准品I和标准品II，标准品I包含长度分别为221bp、562bp和1411bp的病例DNA样品冻干制品，标准品II包含长度为570bp和1774bp的病例DNA样品冻干制品，对照品包括阳性对照品和阴性对照品，阴性对照品为去离子水，阳性对照品为能扩增出221bp、562bp和570bp DNA片段的病例样品。
2.根据权利要求1所述的克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒，其特征在于所述PCR反应液含有PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs和去离子水。
3.权利要求1所述的克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒在判断妊娠胎儿是否需要进行基于诊断克氏综合征的染色体检查中的应用。
全文摘要
本发明涉及克氏综合征胎儿分子诊断试剂盒及应用，该试剂盒包含DNA提取液A、DNA提取液B、蛋白酶K、PCR反应液、PCR特异引物1、PCR特异引物2、Taq酶及标准品和对照品，通过采用repPCR技术对产前或孕前夫妇双方外周血中分子标记物的检测，为妊娠胎儿是否需要进行基于诊断克氏综合征的染色体检查提供依据。
文档编号C12Q1/68GK1724691SQ20051005718
公开日2006年1月25日 申请日期2005年7月22日 优先权日2005年7月22日
发明者翁亚光, 李恬, 施琼, 涂植光, 王应雄, 何俊琳, 刘学庆, 陈雪梅, 杨戎, 魏莎莉 申请人:翁亚光