专利名称：菌根真菌在金线莲大面积栽培中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体地说涉及一项在金线莲大面积栽培中应用菌根真菌以缩短金线莲生产周期，提高金线莲产量和质量的技术方法。
背景技术：
金线莲是一种名贵珍稀的中草药，为兰科开唇兰属(金线莲属)(Anoectochilus Blume)多年生草本植物，在我国主要分布于浙江、福建、江西、广东、广西、海南、贵州、云南、西藏、台湾等省区。金线莲是全草入药，具有清热凉血、祛风利湿、强心、降血压、解毒、止痛、镇咳等功效，民间多用于消炎、镇痛，治疗肺结核、肺热咳嗽，风湿性关节炎、小儿惊风、跌打损伤、蛇伤等多种疾病，均有很好疗效。近年来，金线莲又被用于治疗高血压、糖尿病、肝炎及肿瘤等疑难病症，其功效日益引起医药界的重视。金线莲在民间素有“金草”、“神药”、“乌人参”等美称，在台湾更是被称为“药王”。经测定发现，金线莲中氨基酸类成分的组成和含量，以及具有抗衰老活性的微量元素的含量均高于西洋参。
金线莲生于海拔400-1200米之间的阔叶林或针阔叶混交林中，一般生长在通风良好、湿度高、光线较弱的山涧常绿阔叶林下，石壁、沟边、岩缝等阴湿地带也常有分布。金线莲的分布范围较窄，生长的生态条件独特，自然繁殖率低，生长缓慢，加上鸟类嗜食，使金线莲自然资源储量极其有限。近年来对该植物的需求量猛增，产区人们过度采挖，导致金线莲野生资源日渐枯竭。由于金线莲资源紧缺、价格昂贵，对金线莲的研究多涉及文献考证、组培及商品调查等方面。从1990年开始，福建省科委、教委和林业厅陆续设立专项基金进行金线莲的组织培养及栽培技术研究，目的是为提高金线莲繁殖速度和进行金线莲的人工栽培奠定基础。在金线莲菌根研究方面，江海燕等观察到有真菌侵染金线莲种子的现象；我们在野生金线莲的根中也观察到有真菌的存在，并从该类植物中分离出多种内生真菌。
金线莲试管苗快速繁殖已经获得了成功，但试管苗出瓶后成活率低，生长缓慢，生产周期长，有效成分含量低。到目前为止，由于这些问题的存在，使得金线莲的生产还不能实现大面积的人工栽培。利用菌根技术将金线莲与菌根真菌共生培养，筛选出能有效促进金线莲生长发育的优良菌株，对保存金线莲种质资源，提高药效，开辟金线莲大面积栽培生产的新途径具有重大理论意义和应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种应用菌根真菌大面积栽培金线莲的方法，该方法可以提高金线莲的繁殖率和栽培成活率，可以缩短栽培金线莲的生长周期，提高金线莲的产量和质量，解决金线莲资源短缺的问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术是先分别培养菌根真菌和金线莲苗，当金线莲苗移栽到大田时加入菌根真菌共生栽培。本发明采用的4种小菇属菌根真菌经培养鉴定，分别为分离自铁皮石斛的石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)，分离自天麻的紫萁小菇MO-1(Mycenaosmundicola)，分离自墨兰的兰小菇MO-2(Mycena orchidicola)和分离自福建金线莲(花叶开唇兰)的开唇兰小菇MA-1(Mycena anoectochila)。这4种真菌于2002年1月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，保藏编号分别为MD-1CGMCC No.0685；MO-1CGMCC No.0689；MO-2CGMCC No.0688；MA-1CGMCC No.0687；保藏和存活证明见附件。
具体地说，本发明所述技术的步骤方法如下(除有特殊说明外，本发明中所述的比例均为重量百分比) 1.菌根真菌的培养 将上述4种菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于PDA平皿中，于22-28℃恒温培养10-20天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基中分别进行发酵培养制成种子菌种；种子菌种可以进一步接入液体或固体培养基进行放大培养。
真菌液体培养的培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物，其中葡萄糖的加入量为1.5-4％；无机盐类成分可以为硫酸镁，磷酸二氢钾，或磷酸氢二钾，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾以任意比例混合的混合物，其加入量为硫酸镁0.1-0.3％，磷酸二氢钾0.1-0.5％，或磷酸氢二钾0.1-0.5％，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以为麦麸(煮汁)，其加入量为2-5％。培养基pH 5.0-6.5。三角瓶或其他容器振荡培养或发酵罐通气培养，培养容器装量10-60％。培养基灭菌后接入上述菌根真菌，种子菌种接种量为培养容器装量的5-20％。菌根真菌液体培养的培养条件为振荡转速80-150转/分钟，18-28℃暗培养10-30天。培养结束后可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用。
菌根真菌固体培养的培养基中天然纤维性或淀粉性物质可以为阔叶树锯末、麦麸和碎玉米粒，这3种原料加入量之间的比例按重量计为阔叶树锯末∶麦麸∶碎玉米粒＝0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.2-1.5。固体培养基的加水量为以上3种原料总重量的1-4倍。培养基pH 5.0-6.5。试管、玻璃罐头瓶或塑料袋等器皿静置培养，培养容器装量50-80％。培养基灭菌后接入液体培养的小菇属真菌的种子菌种，种子菌种的接种量为培养容器装量的5-15％。固体培养的培养条件为18-28℃暗培养，待菌丝从培养基顶部长入底部或长满培养基时(2个月左右)取出备用。
2.金线莲苗的培养 金线莲带有节的茎段经过芽分化、丛芽增殖、壮苗生根等步骤的培养，培育成苗。经壮苗生根培养后的金线莲苗可以在继代培养基上继代培养。各步骤所用培养基及培养时间分别为 (1)用于芽分化的培养基是以MS培养基为基本培养基，附加6-苄基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，其加入量为每升(L)培养基加入6-BA0.5-3.0mg，NAA0.4-2.5mg。培养时间45-120天。
(2)用于丛芽增殖的培养基是以MS培养基为基本培养基，附加6-BA、吲哚丁酸(IBA)和玉米素(ZT)，其加入量为每升(L)培养基加入6-BA0.5-3.0mg，IBA0.3-1.5mg，ZT0.05-0.3mg。培养时间45-120天。
(3)用于壮苗生根的培养基使以MS培养基为基本培养基，附加NAA和IBA，其加入量为每升(L)培养基加入NAA0.5-3mg，IBA0.5-2mg。培养时间为45-120天。
(4)用于苗继代的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入马铃薯(煮汁)100-300g。培养时间45-90天。
金线莲芽分化、金线莲丛芽增殖、壮苗生根和苗的继代培养中，所用的每升(L)MS和1/2MS基本培养基中均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、琼脂6-15g。壮苗生根和苗的继代培养中，所用的每升(L)培养基中均要添加活性炭0.5-4g。培养基pH 5.0-6.5。用试管或玻璃瓶等器皿培养，培养容器装量10-50％。苗的培养条件为15-26℃光照培养，光照强度1500-5000Lux，光照时间8-12小时/天。
3.金线莲苗与菌根真菌的共生栽培、田间管理及收获 金线莲苗与菌根真菌的共生栽培基质有以下几种 (1)基质1中可以有蛭石和砂子，这2种材料加入量之间的比例按重量计为蛭石∶砂子＝4∶1-4； (2)基质2中可以有腐殖土和砂子，这2种材料加入量之间的比例按重量计为腐殖土∶砂子＝6∶1-6； (3)基质3中可以有泥炭土和砂子，这2种材料加入量之间的比例按重量计为泥炭土∶砂子＝5∶1-5； (4)基质4中可以有泥炭土、砂子和蛭石，这3种材料加入量之间的比例按重量计为泥炭土∶砂子∶蛭石＝1-4∶1∶2-4； (5)基质5可以是腐殖土。
栽培中还要用到山毛榉科Fagaceae植物栎树或其他杂木树的自然落叶，用时粉碎并浸湿，碎树叶直径0.5-2cm。
上述栽培基质中用到的腐殖土可直接使用，或高温灭菌，或提前两个月铺好使其熟化，或堆积并盖塑料布发酵1-2个月，使其熟化以消除病虫害。
4种菌根真菌的液体培养物或固体培养物，在用于与金线莲的共生栽培时，可以单独使用，或分别培养后任意选择两种或两种以上共同使用。金线莲苗和菌根真菌按以下方法共生栽培 (1)地上遮阳栽培在具有遮阳网的露天大棚，或塑料薄膜温室，或玻璃温室中进行栽培，栽培基质厚度5-20cm。栽培时以2-5株金线莲苗为一丛进行栽培，先在每丛金线莲苗根的基部放置0.5-5g湿的碎树叶，再在每丛金线莲苗的根部放置上述制备好的菌根真菌液体培养物0.4-2.5ml，或菌根真菌固体培养物0.3-2.0g，最后用栽培基质压住苗的根部。苗丛栽培的株、行距为8-18cm。
(2)立体遮阳栽培在地上搭架分层立体栽培，在硬质材料的盆或盒等容器的底部平铺一层共生栽培基质，栽培基质厚度3-10cm。栽培时以2-5株金线莲苗为一丛进行栽培，先在每丛金线莲苗根的基部放置0.5-5g湿的碎树叶，再在每丛金线莲苗的根部放置上述制备好的菌根真菌液体培养物0.4-2.5ml，或菌根真菌固体培养物0.3-2.0g，最后用栽培基质压住苗的根部。苗丛栽培的株、行距为8-18cm。
金线莲苗与菌根真菌共生栽培后需要的生长条件环境温度为5-30℃，光照量为正常日光量的1/3或1/2，避免直射光，或照度为2000-10000Lux。在金线莲与菌根真菌共生的过程中每年可以补施液体培养或固体培养的菌根真菌0-5次； 与菌根真菌共生栽培的金线莲，在上述栽培条件下生长6-12个月可以收获，收获时可剪取地上部分，留幼小苗或芽，也可一次性连根取出洗净栽培基质；阴干或60℃以下烘干。
具体实施例方式 实施例一 1.开唇兰小菇MA-1(Mycena anoectochila)的培养 将MA-1自低温保藏的斜面试管菌种活化一次后，转接于PDA平皿中，25℃恒温培养10天，用φ8mm的打孔器分别在平皿中的菌落边缘打孔成菌片，分别以小碎块接入液体培养基中发酵培养。液体培养基的组成按重量百分含量计算为葡萄糖2.5％，磷酸二氢钾0.15％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.15％，麦麸3％(煮汁)。培养基pH 5.6。500ml三角瓶装培养基250ml，高压灭菌后接入MO-1真菌。培养条件为摇床震荡转速120转/分钟，23℃暗培养14天后用匀浆机打碎菌体及发酵物备用。
2.福建金线莲[Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.](即花叶开唇兰)苗的培养 福建金线莲带有节的茎段经过芽分化、丛芽增殖、壮苗生根等步骤的培养，培育成苗。
金线莲芽分化的培养基是以MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖30g，肌醇100mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.0mg，萘乙酸(NAA)0.5mg，琼脂9g。培养基pH5.6。100mL玻璃三角瓶装量25mL，121℃灭菌20分钟，接入福建金线莲带有节的茎段。培养条件为23-26℃光照培养100天，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。
金线莲丛芽增殖的培养基是以MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖20g，肌醇90mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.5mg，吲哚丁酸(IBA)0.5mg，玉米素(ZT)0.15mg，琼脂10g。培养基pH 6.0。100mL玻璃三角瓶装量35mL，121℃灭菌20分钟，接入福建金线莲芽。培养条件为23-26℃光照培养90天，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。
壮苗生根培养的培养基是以MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖35g，肌醇120mg，NAA 2mg，IBA 1mg，活性炭2g，琼脂9g。培养基pH 5.7。100mL玻璃三角瓶装量30mL，121℃灭菌20分钟，接入福建金线莲苗。培养条件为23-26℃光照培养120天，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。培养至福建金线莲苗的茎直径0.15cm以上，株高5cm以上，具有4片以上的叶，2条以上长1cm左右的根的壮苗即可进行栽培。
金线莲苗继代的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入马铃薯(煮汁)200g，蔗糖25g，肌醇100mg，活性炭2g，琼脂7.5g。培养基pH 5.8。玻璃罐头瓶装量30％，121℃灭菌20分钟，接入福建金线莲的壮苗。培养条件为23-26℃光照培养，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。暂时不能移栽的金线莲的壮苗在此培养基上培养。
3.福建金线莲苗与兰小菇MA-1的共生栽培 共生栽培基质选用基质5腐殖土。腐殖土提前1个月左右堆积，并盖塑料布，使其发酵熟化后使用。采用地上遮阳的方法，在玻璃温室中进行栽培。在温室铺一层10-12cm厚的熟化好的腐殖土，栽培时以3-4株福建金线莲苗为一丛进行栽培，先在每丛福建金线莲苗根的基部放置1.5g左右的湿的碎树叶，再在每丛福建金线莲苗的根部放置上述制备好的MA-1真菌液体培养物1.5ml左右，使福建金线莲苗的根部与MA-1真菌培养物接触，最后用腐殖土压住苗的根部。苗丛栽培的株、行距为10cm。
玻璃温室的环境温度控制在18-25℃，其空气温度夏天应控制在25℃以下，冬天应控制在18℃以上。温室内要有遮阳网，避免直射光，光照量为正常日光量的1/3左右，照度2000-500Lux，最忌夏秋中午前后的直射光，每天光照9-11h。金线莲生长需较高的空气湿度，但栽培基质中不宜积水。
福建金线莲苗与兰小菇MA-1共生栽培后，每隔3个月补施一次液体培养或固体培养的兰小菇MA-1，栽培后9个月收获，收获时一次性连根取出，洗净栽培基质，60℃以下烘干。
实施例二 1.石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)、紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)、兰小菇MO-2(Mycena orchidicola)和开唇兰小菇。开唇兰小菇MA-1(Mycena anoectochila)的培养 将MD-1，MO-1，MO-2和MA-1分别自低温保藏的斜面试管菌种活化一次后，分别转接于PDA平皿中，25℃恒温培养20天，用φ8mm的打孔器分别在平皿中的菌落边缘打孔成菌片，分别以小碎块接入液体培养基中发酵培养。液体培养基的组成按重量百分含量计算为葡萄糖3％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，麦麸3％(煮汁)。培养基pH 6.0。500ml三角瓶装培养基200ml，高压灭菌后分别接入以上4种菌根真菌。培养条件为摇床震荡转速100转/分钟，25℃暗培养25天，作为以上4种菌根真菌的种子菌种。
将液体培养的4种菌根真菌的种子菌种分别接入固体培养基中进行培养。固体培养基的组成为阔叶树锯末、麦麸和碎玉米粒，这3种原料加入量之间的比例按重量计为阔叶树锯末∶麦麸∶碎玉米粒＝1∶1∶0.5。固体培养基的加水量为以上3种原料总重量的3倍。培养基pH5.8。培养基装在玻璃罐头瓶中，培养容器装量60-70％。培养基灭菌后分别接入液体培养的4种菌根真菌的种子菌种，种子菌种的接种量为培养容器装量的10％左右。培养条件为22-23℃静置暗培养。待真菌的菌丝从培养基顶部长入底部或长满培养基时取出，将4种菌根真菌培养物等量混合，备用。
2.台湾金线莲[Anoectochilus formosanus(Wall.)Lindl.]苗的培养金线莲带有节的茎段经过芽分化、丛芽增殖、壮苗生根等步骤的培养，培育成苗。金线莲芽分化的培养基是以MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖20g，肌醇90mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)1.5mg，萘乙酸(NAA)1mg，琼脂8g。培养基pH 5.9。100mL玻璃三角瓶装量35mL，121℃灭菌20分钟，接入台湾金线莲带有节的茎段。培养条件为23-26℃光照培养80天，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。
金线莲丛芽增殖的培养基是以MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖25g，肌醇100mg，6-苄基腺嘌呤(6-BA)2mg，吲哚丁酸(IBA)1mg，玉米素(ZT)0.2mg，琼脂9g。培养基pH 6.0。100mL玻璃三角瓶装量30mL，121℃灭菌20分钟，接入台湾金线莲芽。培养条件为23-26℃光照培养70天，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。
壮苗生根培养的培养基是以MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖30g，肌醇110mg，NAA 1.5mg，IBA 1mg，活性炭3g，琼脂9g。培养基pH 6.0。100mL玻璃三角瓶装量35mL，121℃灭菌20分钟，接入台湾金线莲苗。培养条件为23-26℃光照培养100天，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。培养至台湾金线莲苗的茎直径0.15cm以上，株高5cm以上，具有4片以上的叶，2条以上长1cm左右的根的壮苗即可进行栽培。
3.台湾金线莲苗与4种菌根真菌的共生栽培 共生栽培基质选用基质4，其中泥炭土、砂子和蛭石的加入量之间的比例按重量计为泥炭土∶砂子∶蛭石＝2∶1∶3。采用立体遮阳的方法进行栽培。在木质托盘的基部平铺一层4-6cm厚的共生栽培基质，栽培时以3株台湾金线莲苗为一丛进行栽培，先在台湾金线莲苗根的基部放置1.5g左右的湿的碎树叶，再在台湾金线莲苗根部放置以上备好的4种固体培养的菌根真菌的混合物1.5g左右，使台湾金线莲的根与菌根真菌接触，最后用栽培基质埋住石斛苗的根部。苗丛栽培的株、行距为10cm。
在露天搭架，分层放置木质托盘，并架设遮阳网，避免直射光，光照量为正常日光量的1/3左右，照度2000-5000Lux，最忌夏秋中午前后的直射光，每天光照9-11h。金线莲适宜的环境温度为18-25℃，其空气温度夏天应控制在25℃以下，冬天应控制在18℃以上。金线莲生长需较高的空气湿度，但栽培基质中不宜积水。
台湾金线莲苗与4种菌根真菌共生栽培后，每隔3个月补施一次液体培养或固体培养的菌根真菌。4种菌根真菌可任选1种单独用，也可以任意选择两种或两种以上混合使用。台湾金线莲栽培后10个月收获，收获时剪取地上部分，留幼小苗或芽，阴干。
比较例 1.菌根真菌对金线莲苗的促生长效果 将兰小菇MO-2和开唇兰小菇MA-1分别用液体培养基摇床震荡暗培养15天。液体培养基组成按重量百分含量计算为葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.25％，硫酸镁0.15％，麦麸2％(煮汁)。培养基pH 5.6。将2种菌根真菌的液体培养物分别用匀浆机打碎，备用。
由福建金线莲和台湾金线莲的茎段分化的金线莲苗，分别在壮苗生根培养基上培养90天。壮苗生根培养的培养基是以MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖30g·，肌醇100mg，NAA 2mg，IBA 1mg，活性炭2g，琼脂10g。培养基pH 6.0。100mL玻璃三角瓶装量30mL。培养条件为23-26℃光照培养90天，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。选取金线莲苗的直径在0.15-0.2cm，株高5-7cm，具有4-6片叶，2-4条根的壮苗进行实验。
在共生栽培基质1上，用福建金线莲苗和台湾金线莲苗分别与2种液体培养的菌根真菌进行共生栽培，考察菌根真菌对金线莲生长的影响。以不加菌根真菌栽培的福建金线莲苗和台湾金线莲苗的生长情况作为对照。共生栽培在玻璃温室中进行。基质1中蛭石和砂子的加入量之间的比例按重量计为蛭石∶砂子＝2∶1。
在温室铺一层10-12cm厚的共生栽培基质，栽培时均以3株金线莲苗为一丛进行栽培。先在金线莲苗根的基部放置1.5g左右的湿的碎树叶，再分别在金线莲苗根部放置以上备好的4种菌根真菌液体培养物，每种1.5ml左右，使金线莲苗的根与菌根真菌接触，最后用栽培基质埋住石斛苗的根部。对照则用栽培基质埋住金线莲苗的根部直接栽培即可。苗丛栽培的株、行距为10cm。
玻璃温室的环境温度控制在18-25℃，其空气温度夏天应控制在25℃以下，冬天应控制在18℃以上。温室内要有遮阳网，避免直射光，光照量为正常日光量的1/3左右，照度2000-500Lux，最忌夏秋中午前后的直射光，每天光照9-11h。金线莲生长需较高的空气湿度，但栽培基质中不宜积水。
金线莲苗栽培后6个月收获，收获时一次性连根取出，洗净栽培基质，测量并记录金线莲地上部分高度。将收获的金线莲于55℃干燥，称量干重。统计分析结果表明，与未接菌的对照福建金线莲苗相比，与MO-2共生栽培的福建金线莲苗的地上部分高度增加了36％，干重增加了17％；与MA-1共生栽培的福建金线莲苗的地上部分高度增加了43％，干重增加了25％。与未接菌的对照台湾金线莲苗相比，与MO-2共生栽培的台湾金线莲苗的地上部分高度增加了54％，干重增加了32％；与MA-1共生栽培的台湾金线莲苗的地上部分高度增加了63％，干重增加了42％。以上结果说明这2种菌根真菌都能促进金线莲苗的生长。
2.菌根真菌对金线莲苗有效成分含量的影响 将石斛小菇MD-1和开唇兰小菇MA-1分别用液体培养基摇床震荡暗培养12天。液体培养基组成按重量百分含量计算为葡萄糖2％，磷酸二氢钾0.3％，硫酸镁0.15％，麦麸3％(煮汁)。培养基pH 5.9，将MD-1和MA-1真菌的液体培养物等量混合，用匀浆机打碎，备用。
由福建金线莲的茎段分化的金线莲苗，在壮苗生根培养基上培养90天。壮苗生根培养是以MS培养基为基本培养基，每升(L)培养基加入蔗糖30g，肌醇100mg，NAA 2mg，IBA1mg，活性炭2g，琼脂9g。培养基pH 5.8。100mL玻璃三角瓶装量30mL。培养条件为23-26℃光照培养90天，光照强度3000Lux，光照时间10小时/天。选取苗的直径在0.15-0.2cm，株高5-7cm，具有4-6片叶，2-4条根的福建金线莲的壮苗进行实验。
在共生栽培基质3上，用福建金线莲苗MD-1和MA-1的液体培养混合物进行共生栽培，考察菌根真菌对福建金线莲苗中有效成分含量的影响。以不加菌根真菌栽培的福建金线莲苗的生长情况作为对照。共生栽培在玻璃温室中进行。基质3中泥炭土和砂子的加入量之间的比例按重量计为泥炭土∶砂子＝5∶2。
在温室铺一层10-12cm厚的共生栽培基质，栽培时均以3株金线莲苗为一丛进行栽培。先在金线莲苗根的基部放置1.5g左右的湿的碎树叶，再在金线莲苗根部放置以上备好的2种菌根真菌的液体培养物的混合物1.5ml左右，使金线莲苗的根与菌根真菌接触，最后用栽培基质埋住石斛苗的根部。对照则用栽培基质埋住金线莲苗的根部直接栽培即可。丛苗栽培的株、行距为10cm。
玻璃温室的环境温度控制在18-25℃，其空气温度夏天应控制在25℃以下，冬天应控制在18℃以上。温室内要有遮阳网，避免直射光，光照量为正常日光量的1/3左右，照度2000-500Lux，最忌夏秋中午前后的直射光，每天光照9-11h。金线莲生长需较高的空气湿度，但栽培基质中不宜积水。
金线莲苗栽培后6个月收获，收获时一次性连根取出，洗净栽培基质，于55℃干燥。同时将野生福建金线莲也在55℃干燥。将干燥的福建金线莲(包括野生福建金线莲，加菌人工栽培的福建金线莲和不加菌人工栽培的福建金线莲)用甲醇提取，用HPLC方法分析比较了福建金线莲中黄酮类化合物的含量。实验结果表明，与不接菌根真菌栽培的福建金线莲苗(对照)相比，菌根真菌使福建金线莲苗中黄酮类活性成分的含量显著提高。与菌根真菌共生栽培的福建金线莲中9种黄酮含量之和为0.1735％，而未加菌栽培的福建金线莲中9种黄酮含量之和为0.1135％，野生福建金线莲中9种黄酮含量之和为0.1296％。此外，与不接菌根真菌栽培的福建金线莲苗(对照)相比，加菌人工栽培的福建金线莲苗中多糖类成分的含量提高了59％，硼、钴、锰、铜、铁、锌等微量元素的含量也有所提高。
从上述比较例可以看出，小菇属的4种菌根真菌对金线莲的生长发育均有明显促进作用。采用该项新技术，金线莲的生长周期可以由传统栽培的12-18个月缩短到6-10个月，产量提高20-40％。与不接菌根真菌栽培的金线莲苗(对照)相比，该技术可以提高金线莲中黄酮和多糖等有效成分的含量，提高微量元素的含量，从而保证了人工栽培金线莲的药材质量，为菌根真菌应用于金线莲规范化栽培提供了科学依据。另外，该项技术栽培方法简单、投资少、不施任何化学肥料和农药，生产出的金线莲为绿色产品。
权利要求
1.一种应用菌根真菌大面积栽培金线莲的方法，包括步骤
(1)菌根真菌的发酵培养
将4种菌根真菌MD-1，MO-1，MO-2，MA-1自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于含PDA培养基的平皿中，于22-28℃恒温培养10-20天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基中进行发酵培养；
由平皿固体菌种转接液体培养的MD-1，MO-1，MO-2和MA-1真菌可以直接使用，也可以作为种子菌种，种子菌种再进一步接入液体或固体培养基进行放大培养；
真菌液体培养的培养基含有葡萄糖、无机盐类成分和天然添加物，真菌用三角瓶或其他容器振荡或发酵罐通气暗培养，培养结束后可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用；
真菌固体培养的培养基含有天然纤维性或淀粉性物质，真菌用试管、玻璃罐头瓶或塑料袋等器皿静置暗培养，待菌丝大部分或全部长满培养基时取出备用；
(2)金线莲苗的培养
金线莲带有节的茎段经过金线莲芽分化、金线莲丛芽增殖、壮苗生根培养等步骤的培养，用玻璃三角瓶或玻璃罐头瓶等器皿静置光照培养，培育成苗；经壮苗生根培养后的金线莲苗可以在继代培养基上继代培养；
金线莲芽增殖、金线莲丛芽增殖、壮苗生根等步骤所用的培养基是以MS培养基为基本培养基；苗的继代培养所用的培养基是以1/2MS培养基为基本培养基；以上培养基都需要在基本培养基的基础上添加蔗糖、肌醇、琼脂，或添加活性炭，添加不同种类和浓度的植物激素，或添加马铃薯提取物；
(3)金线莲苗与菌根真菌的共生栽培、田间管理和收获
金线莲苗与菌根真菌大面积共生栽培的栽培基质含有蛭石、泥炭土、腐殖土、砂子；
金线莲苗和菌根真菌按以下方法共生栽培
①地上遮阳栽培在具有遮阳网的露天大棚，或塑料薄膜温室，或玻璃温室中进行栽培，栽培时先在金线莲苗根的基部放置适量碎树叶，再在金线莲苗根部放置以上备好的液体或固体菌根真菌适量，最后用栽培基质埋住金线莲苗的根部；
②立体遮阳栽培在地上搭架分层立体栽培，在硬质材料的盆或盒等容器的底部平铺一层共生栽培基质，栽培时先在金线莲苗根的基部放置适量碎树叶，再在金线莲苗根部放置以上备好的液体或固体菌根真菌适量，最后用栽培基质埋住金线莲苗的根部；
在金线莲生长的过程中可以根据需要补施液体或固体菌根真菌；
金线莲苗出瓶后与菌根真菌共生栽培6-12个月后即可收获。
2.如权利要求1所述的培养方法，其中所述的4种小菇属真菌分别为石斛小菇MD-1(Mycena dendrobii)，保藏编号CGMCC No.0685，紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)，保藏编号CGMCC No.0689，兰小菇MO-2(Mycena orchidicola)，保藏编号CGMCC No.0688，和开唇兰小菇MA-1(Mycena anoectochila)，保藏编号CGMCC No.0687。
3.如权利要求1和2所述的方法，其特征在于小菇属4种菌根真菌液体培养的培养基中葡萄糖的加入量按重量计为1.5-4％；无机盐类成分可以为硫酸镁，磷酸二氢钾，或磷酸氢二钾，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾以任意比例混合的混合物，其加入量按重量计为硫酸镁0.1-0.5％，磷酸二氢钾0.1-0.5％，或磷酸氢二钾0.1-0.5％，或磷酸二氢钾和磷酸氢二钾的混合物0.1-0.5％；天然添加物可以为麦麸(煮汁)，其加入量按重量计为2-5％；培养基pH5.0-6.5；三角瓶或其他容器振荡培养或发酵罐通气培养，培养容器装量10-60％；培养基灭菌后接入上述4种小菇属真菌，种子菌种接种量为培养容器装量的5-20％；液体培养的培养条件为振荡转速80-150转/分钟，18-28℃暗培养10-30天；培养结束后可直接使用或用匀浆机打碎培养产物备用。
4.如权利要求1和2所述的方法，其特征在于小菇属4种菌根真菌固体培养的培养基中天然纤维性或淀粉性物质可以为阔叶树锯末、麦麸和碎玉米粒，这3种原料加入量之间的比例按重量计为阔叶树锯末∶麦麸∶碎玉米粒＝0.5-1.5∶0.5-1.5∶0.2-1.5；固体培养基的加水量为以上3种原料总重量的1-4倍；培养基pH5.0-6.5；试管、玻璃罐头瓶或塑料袋等器皿静置培养，培养容器装量50-80％；培养基灭菌后接入液体培养的小菇属真菌的种子菌种，种子菌种的接种量为培养容器装量的5-15％；固体培养的培养条件为18-28℃暗培养，待菌丝从培养基顶部长入底部或长满培养基时取出备用。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于金线莲苗的培养中，
(1)芽分化培养的培养基中添加的植物激素为6-苄基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)，其加入量为每升(L)培养基加入6-BA0.5-3.0mg，NAA0.4-2.5mg；培养时间45-120天；
(2)丛芽增殖培养的培养基中添加的植物激素为6-BA、吲哚丁酸(IBA)和玉米素(ZT)，其加入量为每升(L)培养基加入6-BA0.5-3.0mg，IBA0.3-1.5mg，ZT0.05-0.3mg；培养时间45-120天；
(3)壮苗生根培养的培养基中添加的植物激素为NAA和IBA，其加入量为每升(L)培养基加入NAA0.5-3mg，IBA0.5-2mg；培养时间为45-120天；
(4)苗继代培养的培养基中添加马铃薯(煮汁)的量为每升(L)培养基加入100-300g；培养时间45-90天。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于金线莲芽分化、金线莲丛芽增殖、壮苗生根和苗的继代培养中，所用的每升(L)MS和1/2MS基本培养基中均要添加蔗糖15-35g、肌醇50-150mg、琼脂6-15g；壮苗生根和苗的继代培养中，所用的每升(L)培养基中均要添加0.5-4g的活性炭；培养基pH5.0-6.5；用试管或玻璃瓶等器皿培养，培养容器装量10-50％；苗的培养条件为15-26℃光照培养，光照强度1500-5000Lux，光照时间8-12小时/天。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于金线莲苗与菌根真菌的共生栽培基质有以下几种
(1)基质1中可以有蛭石和砂子，这2种材料加入量之间的比例按重量计为蛭石∶砂子＝4∶1-4；
(2)基质2中可以有腐殖土和砂子，这2种材料加入量之间的比例按重量计为腐殖土∶砂子＝6∶1-6；
(3)基质3中可以有泥炭土和砂子，这2种材料加入量之间的比例按重量计为泥炭土∶砂子＝5∶1-5；
(4)基质4中可以有泥炭土、砂子和蛭石，这3种材料加入量之间的比例按重量计为泥炭土∶砂子∶蛭石＝1-4∶1∶2-4；
(5)基质5可以是腐殖土；
栽培中还要用到山毛榉科Fagaceae植物栎树或其他杂木树的自然落叶，用时粉碎并浸湿，碎树叶直径0.5-2cm；
上述栽培基质中用到的腐殖土可以直接使用，或高温灭菌，或提前两个月铺好使其熟化，或堆积并盖塑料布发酵1-2个月，使其熟化以消除病虫害。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于金线莲苗与菌根真菌共生栽培时，以2-5株金线莲苗为一丛进行栽培，先在每丛金线莲苗根的基部放置0.5-5g湿的碎树叶，再在每丛金线莲苗的根部放置上述制备好的菌根真菌液体培养物0.4-2.5ml，或菌根真菌固体培养物0.3-2.0g，最后用栽培基质压住苗的根部；丛苗栽培的株、行距为8-18cm；
采用地上遮阳栽培的方法进行金线莲苗与菌根真菌共生栽培时，栽培基质厚度5-20cm，
采用立体遮阳栽培的方法进行金线莲苗与菌根真菌共生栽培时，栽培基质厚度3-10cm；
金线莲苗与菌根真菌共生栽培后需要的生长条件环境温度为5-30℃，光照量为正常日光量的1/3或1/2，或照度为2000-10000Lux；在金线莲与菌根真菌共生的过程中每年可以补施液体培养或固体培养的菌根真菌0-5次；
与菌根真菌共生栽培的金线莲，在上述栽培条件下生长6-12个月可以收获，收获时可剪取地上部分，留幼小苗或芽，也可一次性连根取出洗净栽培基质；阴干或60℃以下烘干。
9.如权利要求1-8所述的方法，其特征在于4种菌根真菌的液体培养物或固体培养物，在用于与金线莲的共生栽培时，可以单独使用，或分别培养后任意选择两种或两种以上共同使用。
10.用于任一权利要求1-9所述方法的菌根真菌为小菇属真菌石斛小菇MD-1(Mycenadendrobii)，保藏编号CGMCC No.0685，紫萁小菇MO-1(Mycena osmundicola)，保藏编号CGMCC No.0689，兰小菇MO-2(Mycena orchidicola)，保藏编号CGMCC No.0688，和开唇兰小菇MA-1(Mycena anoectochila)，保藏编号CGMCC No.0687。
全文摘要
一种菌根真菌在金线莲大面积栽培中的应用技术，所用的4种菌根真菌为小菇属真菌石斛小菇(Mycena dendrobii)，紫萁小菇(Mycena osmundicola)，兰小菇(Mycena orchidicola)，开唇兰小菇(Mycena anoectochila)；先分别培养菌根真菌和金线莲苗，当金线莲苗移栽到大田时，加入菌根真菌与金线莲苗共同栽培。采用该项新技术，可大大缩短金线莲的生长周期，提高金线莲产量和有效成分含量。该项技术栽培方法简单、易于大面积推广、投资少、不施任何化学肥料、激素和农药，生产出的金线莲为绿色产品。
文档编号C12N1/14GK1961651SQ20051011770
公开日2007年5月16日 申请日期2005年11月7日 优先权日2005年11月7日
发明者郭顺星, 于雪梅, 高微微, 陈晓梅, 王春兰, 孟志霞, 肖培根 申请人:中国医学科学院药用植物研究所