专利名称：海岛棉受体类似蛋白激酶基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及海岛棉受体类似蛋白激酶基因的克隆，属于生物技术领域。
(二)技术背景棉花是重要的经济作物，棉纤维是主要的纺织原料。而棉花的病害比较多，我国枯、黄萎病尤其严重，给棉花生产造成很大的损失。种植抗病品种是防治病害的最经济有效的方法。陆地棉是我国棉花的主栽品种，陆地棉抗枯萎病育种非常成功，但黄萎病抗病品种的培育一直是育种家的一大难题，主要原因在陆地棉中找不到免疫或高抗的黄萎病抗源。
棉花黄萎病是Carpenter于1914年在美国弗吉尼亚州发现并报道的，它是由大丽轮枝菌引起的一种真菌性病害。半个多世纪以来，棉花黄萎病不仅蔓延至整个美国棉区，也在世界各主要产棉国相继发现。该病主要分布于秘鲁、巴西、阿根廷、澳大利亚、刚果、印度、中国、以色列、前苏联等30多个国家和地区，尤其在前苏联最为严重。我国棉花黄萎病是由于1935年引进美国斯字棉4B棉种而传入的，以后随着棉种的繁殖和调运，棉花黄萎病在我国各主要产棉区逐渐传播开来。20世纪90年代以来，我国棉花黄萎病扩展蔓延迅猛，其中1993年棉花黄萎病爆发成灾，发病面积达266.67万hm2，损失皮棉1亿公斤以上。1995年、1996年棉花黄萎病在全国范围内连续大发生，给棉花生产造成极大的损失。2000年棉花黄萎病在新疆危害严重，其中农五师2.67万hm2棉田中有0.67万hm2重病田。
本专利所克隆的基因受体类似蛋白激酶(GbRKL)，是蛋白质激酶中的一种。蛋白激酶在信号传导过程中起着重要作用，而受体蛋白激酶是蛋白激酶中的重要一类，也是信号分子的重要受体。受体激酶包含有多个基因家族。在识别与转导膜外信号方面发挥着重要的作用。蛋白激酶主要是通过催化受体蛋白的可逆磷酸化来传递各类信号的。植物受体激酶具有酪氨酸的拓扑结构，但含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因的序列特征。受体蛋白激酶参与了植物许多由激素和胞外环境信号引起的生理生化过程，如，自交不亲和、调节胚乳和花粉的发育、花的脱落、油菜素类固醇信号反应、环境胁迫及植物抗病等。在已克隆的抗病基因中水稻的Xa21、拟南芥的PBS1、大麦的RPG1、番茄的PTO都含有受体蛋白激酶保守结构域。
植物受体类似蛋白激酶依其结构特点可分为三类第一类含有受体类似激酶区与一个N端胞外S区；第二类除了受体类似激酶区外还有一个富含亮氨酸重复；第三类只含有激酶区，没有明显的配基结合区，但其功能的发挥也需要一段保守氨基酸序列。已克隆的番茄PTO、大麦的RPG1基因属于第三类激酶基因，PTO所编码的129～224位氨基酸参与了病原物的识别及与无毒基因AvrPto的相互作用。RPG1基因编码两个激酶区，具体作用机理还不清楚。分析克隆的棉花GbRLK基因含有一个保守的激酶区和一个跨膜区，它只编码一个预测的蛋白激酶区，有一段跨膜区，而N端区没有找到与已克隆的它的这些结构与番茄的PTO结构非常相似，GbRLK与PTO的功能区(129～224氨基酸)非常保守，可能它们在与病原物的相互作用中有相似的作用机理。
Genbank中已注册的与激酶有关的棉花序列有14条，其中已知功能的都是参与棉花纤维的发育，而与抗病有关的棉花激酶类基因还未见报道。
发明内容技术问题本发明的目的是克隆一个海岛棉受体类似蛋白激酶基因(GbRLK)cDNA的全长序列，以此设计出一对GbRLK的特异性引物利用RT-PCR方法，检测其在接菌黄萎病后的抗性海岛棉品种海7124中不同时期根中的表达情况，并用Northern杂交对其结果进行验证。
技术方案海岛棉受体类似蛋白激酶基因(GbRLK)，长度为1536bp，序列为SEQ IDNO.1，如下ACTATTTTTGCTGCACTTTTATGTCCTCTTTCAGGTCCATTCCAGGGACAGGTGATCATGGCGATGATCAATTCCCGGATATAAAAGAAATCACTAAGCCGTTCAACCAGGCCTTTACTATAATTATCGTAGCCACTATAGGTATAATTTCAATTGCTTTGCTTTTTGTTTGGATTCATGTAAATTCTAACTAATATTTCTTACATATTGCAGTGGCCTTACTTATTAAGGTATTTTTTATAGCATACGTATGCCGTCTATGCCGTGAAAGACTTGGAAGAGAAAGCAGCGATAGTGTTTGCCCAGAAACTCAATCTATAACACTAAACATGGATAAATTCCTGAACGAAATGGAAAAGGAGAAGCCTAGTCGGTTTACCTCCCAACAGCTACGGATTGCGACCGATAATTTCACCAATTTACTTGGTTCGGGTGGCTTTGGAACTGTTTATAAAGGAATTTTTAGTAACGGAACCATGGTAGCTGTCAAAGTCCTGCATGGAGATTCCGATAAAAGGATAGAAGAGCAGTTCATGGCGGAAGTGAGTACAATCGGAAGAGTTCACCATGTTAATCTGGTTCGACTTTACGGTTTCTGTTTTGACCTGAATCTTAGAGCTCTCGTATACGAGTACATGGTAAATGGTTCGCTTGACAAGTTTTTATTTGGTGAAGACAAGAAACTGGGATTCCAACAGCTTCAAGCAATAGCAATAGGCACTGCTAAAGGGATTGCTTACTTGCACGAAGAATGCCAACAACGGATTATCCACTACGACATAAAACCAGGAAATATTCTATTGGATGCCAACTTCTTGCCTAAAGTGGCGGATTTCGGATTAGCCAAGCTTTGTAACAGGGAAAAGACACATGTAACAATGACAAGAGGAAGGGGTACTCCTGGATATGCAGCACCAGAGCTTTGGATGCCATATCCTATTACACATAAATGTGATGTTTACAGCTTTGGGATGTTATTGTTTGAGATCATTGGTAAGAGAAGGAACCTTGATACAAATCTACCTGAAAGCCAAGAATGGTTTCCAAGATGGGTATGGAAAAATACTGAGACTGAAAATCATGTGGAGTTAATGATGGTCTGCGGAATTGAGGATATGGATAGAGATACGGCGGAGAGAATGATGAAAACAGCTTTGTGGTGCATTCAATATCGGCCTGAATCGAGGCCTTTGATGAGCATCGTGGTGAAAATGTTGGAAGGAGGAGTGGAGATTCCTGCACCTTCAAATCCTTTTGAAGCTTCTTCAATGGAGCCTAATAGTAATACCTCTACTAGCACCGATACCTCTAGTTGTTCAGAGTCGTCTTCATTACTAGCAAGCTCTGCTTCAATACATGCAACTCCTGTCATGAAAAAATATGAAATTGAAATGGTCACAATTTATTAGA
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GbRLK的RT-PCR引物为F5’-GAAGAGCAGTTCATGGCGGA-3’R5’-ACAAAGCTTGGCTAATCCGA-3’扩增Northern杂交探针所用引物F5’-GCCAAGAATGGTTTCCAAGAT-3’R5’-ACATTTTGTATTCTGGAAGCACA-3’5’RACE所用引物GSP15’-AGCAATCCCTTTAGCA-3’GSP25’-AAAACAGAAACCGTAAAGTCG-3’GSP35’-ATGGTGAACTCTTCCGATTGT-3’本发明克隆受体类似蛋白激酶基因(GbRLK)的技术路线是1.利用其它作物中已克隆的激酶类抗病基因保守域设计简并引物，从海岛棉海7124中进行PCR扩增。回收预期大小的片段，将回收的片段连入pGEM-T easy Vector(Promega)。挑取10个阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司测序。
2.测序结果经手工去除载体序列后，在NCBI的非冗余蛋白数据库中进行BLASTx分析。
3.将BLASTx分析结果与激酶类有关的7条序列用DNAstar进行连续开放阅读框(ORF)分析，发现3条具有连续的ORF。
4.用具有连续ORF的3条序列设计特异引物。分析其在接菌黄萎病病菌VD8后的海盗棉品种海7124根组织中不同时期的表达情况。其中有一条受黄萎病诱导表达的(图1)。
5.利用该序列设计三条5′RACE引物与两条3′RACE引物，以接菌黄萎病后96小时的海7124根组织为材料，获得其全长cDNA。
6.用RT-PCR产物对其表达用Northern杂交进行验证，与RT-PCR结果完全吻合(图2)。并做了生物信息学的初步分析。
有益效果本发明海岛棉受体类似蛋白激酶基因(GbRLK)是从黄萎病处理的海岛棉根组织中经侯选基因与RACE技术得到的。RT-PCR与Northern检测因其仅在黄萎病处理后96小时表达，且该基因编码蛋白与植物防卫反应有关，因此以该基因为靶基因对棉花进行转化，在一定程度上可有效的提高棉花的黄萎病抗性，因而具有一定的经济及社会效益。以此基因为靶基因，通过基因工程的方法改良目前棉花黄萎病的抗性，为棉花的抗病育种提供基因资源，尽快培育高抗黄萎病的棉花品种，并应用于棉花生产。
本发明的优点表现在(1)利用已克隆的同类基因的保守域克隆与目的基因的相关片段，通过cDNA末端快速扩增(RACE)技术，克隆其全长cDNA。在克隆全长cDNA的众多方法中，该方法费用少、快速而且高效。
(2)本发明所克隆的基因编码受体类似蛋白激酶，从现有的资料可知，受体类似蛋白激酶基因是一类基因家族，它们不仅在植物正常的生理过程中发挥着重要的功能，而且是植物识别病原菌引发抗病信号传导的主要基因之一。因此本发明所克隆的基因与棉花的抗病有着直接的关系。
(3)以此基因作为靶基因，对棉花进行转化理论上可直接有效地提高其黄萎病抗性，获得高抗黄萎病的棉花品种，极大地减少因病害带来的棉花生产的损失，带来可观的经济效益。
(4)目前转基因的外源基因大部分来源于微生物，这类转基因作物对安全性评价要求严格。本专利报道的基因来源于棉花，再导入棉花不存在安全性评价问题。同时，与棉花抗病相关的基因目前国内外申请的专利很少，本专利是目前具有中国自主知识产权的为数不多的专利之一。该专利的申请可提高中国棉花科研水平在国际同行中的地位。
(5)通过该基因的功能预测，表明该基因是一个在黄萎病诱导后特异表达的基因，通过农杆菌介导的方法将该基因导入棉花，使其过量表达，获得的转基因植株将在黄萎病侵染棉花时大量表达，有望达到大大提高棉花抗黄萎病的目的。
图1 RT-PCR检测受体类似蛋白激酶基因(GbRLK)在接菌黄萎病后海7124根组织中不同时期表达特点，0h，24h，48h，96h，144h分别表示接菌黄萎病后的时间。图1中EF1α为棉花的组成性表达基因，作为内标，证明RNA模板的一致性。GbRLK表示目的基因。
图2 Northern检测受体类似蛋白激酶基因(GbRLK)在接菌黄萎病后海7124根组织中不同时期表达特点，0h，24h，48h，96h，144h分别表示接菌黄萎病后的时间。图中地rRNA表示核糖体RNA，作为Northern杂交上样量的对照。
图3 受体类似蛋白激酶基因(GbRLK)预测的氨基酸序列与已注册的棉花中的激酶类基因或序列的进化树。没有命名的序列用登录号表示。
具体实施方式
1.利用其它作物中已克隆的激酶类抗病基因保守域设计简并引物，从海岛棉海7124中进行PCR扩增。回收预期大小的片段，将回收的片段连入pGEM-T easy Vector(Promega公司)。挑取10个阳性克隆送上海英俊生物技术有限公司测序。
2.测序结果用DNAstar软件手工去除载体序列后，在NCBI的非冗余蛋白数据库中进行BLASTx分析。
3.将BLASTx分析结果中与激酶类有关的7条序列用DNAstar进行连续开放阅读框(ORF)分析，找到3条具有连续的ORF(测序编号分别为L354，L355，L361)。
4.用具有连续ORF的3条序列设计特异引物。分析其在接菌黄萎病病菌VD8(陆家云等，1983)后的海盗棉品种海7124根组织中不同时期的表达情况。其中有一条受黄萎病诱导表达(图1)。利用该序列设计三条5′RACE引物与两条3′RACE引物GbRLK的RT-PCR引物为F5’-GAAGAGCAGTTCATGGCGGA-3’R5’-ACAAAGCTTGGCTAATCCGA-3’扩增Northern杂交探针所用引物F5’-GCCAAGAATGGTTTCCAAGAT-3’R5’-ACATTTTGTATTCTGGAAGCACA-3’5’RACE所用引物GSP15’-AGCAATCCCTTTAGCA-3’GSP25’-AAAACAGAAACCGTAAAGTCG-3’GSP35’-ATGGTGAACTCTTCCGATTGT-3’以接菌黄萎病后96小时的海7124根组织为材料，获得其全长cDNA。
5.用RT-PCR产物对其表达用Northern杂交进行验证，与RT-PCR结果完全吻合(图2)。
6.对已克隆的激酶类抗病基因做了生物信息学的初步分析6.1以此基因的最大ORF推断的氨基酸序列经BLAST(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)功能比较，该基因与水稻S-受体激酶PK3前体具有56％的一致性，72％的相似性(E值1e-98)。
6.2用Expasy pI/Mw程序(http//us.expasy.org/tool s/pi_tool.html)对GbRLK预测的氨基酸序列进行了一级结构的预测，该基因理论上的等电点pI＝5.9，分子量Mw＝40.65kDa。
6.3ProtComp Version 6(http//sunl.softberry.com/berry.phtml)预测GbRLK定位于质膜，LOCtree预测其定位于细胞质，TMpred(http//www.ch.embnet.org//software/TMPRED form.html)预测它含有一段跨膜区(28～46位氨基酸)，可见该蛋白为跨膜蛋白。
6.4利用ScanProsite(http//www.expasy.org/tools/scanprosite/)程序搜索GbRLK预测的氨基酸序列的保守基元，发现其26～310位为蛋白质激酶区。
6.5同源关系树分析(MEGA3软件)(图3)，GbRLK与棉花中已注册的登录号为AAT64017和AAT64032的两条序列遗传距离最近。这两条序列属于预测的蛋白激酶，含有亮氨酸重复序列与跨膜区。
7.通过该基因的功能预测，表明该基因是一个在黄萎病诱导后特异表达的基因，通过农杆菌介导的方法将该基因导入棉花，使其过量表达，获得的转基因植株将在黄萎病侵染棉花时大量表达，有望达到大大提高棉花抗黄萎病的目的。
序列表<110>南京农业大学<120>海岛棉受体类似蛋白激酶基因及其应用<130>说明书<140>00<141>2005-12-20<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>SEQ ID NO.1<211>1536<212>DNA<213>Gossypium barbadense(海岛棉)<220>
<221>gene<222>(1)..(1536)<223>
<400>1actatttttg ctgcactttt atgtcctctt tcaggtccat tccagggaca ggtgatcatg60gcgatgatca attcccggat ataaaagaaa tcactaagcc gttcaaccag gcctttacta120taattatcgt agccactata ggtataattt caattgcttt gctttttgtt tggattcatg180taaattctaa ctaatatttc ttacatattg cagtggcctt acttattaag gtatttttta240tagcatacgt atgccgtcta tgccgtgaaa gacttggaag agaaagcagc gatagtgttt300gcccagaaac tcaatctata acactaaaca tggataaatt cctgaacgaa atggaaaagg360agaagcctag tcggtttacc tcccaacagc tacggattgc gaccgataat ttcaccaatt420tacttggttc gggtggcttt ggaactgttt ataaaggaat ttttagtaac ggaaccatgg480tagctgtcaa agtcctgcat ggagattccg ataaaaggat agaagagcag ttcatggcgg540aagtgagtac aatcggaaga gttcaccatg ttaatctggt tcgactttac ggtttctgtt600ttgacctgaa tcttagagct ctcgtatacg agtacatggt aaatggttcg cttgacaagt660ttttatttgg tgaagacaag aaactgggat tccaacagct tcaagcaata gcaataggca720
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1.海岛棉受体类似蛋白激酶基因，长度为1536bp，序列为SEQ ID NO.1，如下ACTATTTTTGCTGCACTTTTATGTCCTCTTTCAGGTCCATTCCAGGGACAGGTGATCATGGCGATGATCAATTCCCGGATATAAAAGAAATCACTAAGCCGTTCAACCAGGCCTTTACTATAATTATCGTAGCCACTATAGGTATAATTTCAATTGCTTTGCTTTTTGTTTGGATTCATGTAAATTCTAACTAATATTTCTTACATATTGCAGTGGCCTTACTTATTAAGGTATTTTTTATAGCATACGTATGCCGTCTATGCCGTGAAAGACTTGGAAGAGAAAGCAGCGATAGTGTTTGCCCAGAAACTCAATCTATAACACTAAACATGGATAAATTCCTGAACGAAATGGAAAAGGAGAAGCCTAGTCGGTTTACCTCCCAACAGCTACGGATTGCGACCGATAATTTCACCAATTTACTTGGTTCGGGTGGCTTTGGAACTGTTTATAAAGGAATTTTTAGTAACGGAACCATGGTAGCTGTCAAAGTCCTGCATGGAGATTCCGATAAAAGGATAGAAGAGCAGTTCATGGCGGAAGTGAGTACAATCGGAAGAGTTCACCATGTTAATCTGGTTCGACTTTACGGTTTCTGTTTTGACCTGAATCTTAGAGCTCTCGTATACGAGTACATGGTAAATGGTTCGCTTGACAAGTTTTTATTTGGTGAAGACAAGAAACTGGGATTCCAACAGCTTCAAGCAATAGCAATAGGCACTGCTAAAGGGATTGCTTACTTGCACGAAGAATGCCAACAACGGATTATCCACTACGACATAAAACCAGGAAATATTCTATTGGATGCCAACTTCTTGCCTAAAGTGGCGGATTTCGGATTAGCCAAGCTTTGTAACAGGGAAAAGACACATGTAACAATGACAAGAGGAAGGGGTACTCCTGGATATGCAGCACCAGAGCTTTGGATGCCATATCCTATTACACATAAATGTGATGTTTACAGCTTTGGGATGTTATTGTTTGAGATCATTGGTAAGAGAAGGAACCTTGATACAAATCTACCTGAAAGCCAAGAATGGTTTCCAAGATGGGTATGGAAAAATACTGAGACTGAAAATCATGTGGAGTTAATGATGGTCTGCGGAATTGAGGATATGGATAGAGATACGGCGGAGAGAATGATGAAAACAGCTTTGTGGTGCATTCAATATCGGCCTGAATCGAGGCCTTTGATGAGCATCGTGGTGAAAATGTTGGAAGGAGGAGTGGAGATTCCTGCACCTTCAAATCCTTTTGAAGCTTCTTCAATGGAGCCTAATAGTAATACCTCTACTAGCACCGATACCTCTAGTTGTTCAGAGTCGTCTTCATTACTAGCAAGCTCTGCTTCAATACATGCAACTCCTGTCATGAAAAAATATGAAATTGAAATGGTCACAATTTATTAGATAATGTGCTTCCAGAATACAAAATGTTAATGGCCATCTATAAATTATTCTGACGCTATAGATCATTATCCAAGAAGCTTTCTTTGTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGTACTAGTCGACGCGTGGCC注下划线为潜在加尾信号。
2.根据权利要求1所述的海岛棉受体类似蛋白激酶基因，其特征在于，该基因的RT-PCR引物为F5’-GAAGAGCAGTTCATGGCGGA-3’R5’-ACAAAGCTTGGCTAATCCGA-3’扩增Northern杂交探针所用引物F5’-GCCAAGAATGGTTTCCAAGAT-3’R5’-ACATTTTGTATTCTGGAAGCACA-3’5′RACE所用引物GSP15’-AGCAATCCCTTTAGCA-3’GSP25’-AAAACAGAAACCGTAAAGTCG-3’GSP35’-ATGGTGAACTCTTCCGATTGT-3’3′RACE所用引物GSP1CGACTTTACGGTTTCTGTTTGSP2AAGAATGCCAACAACGGATTA。
3.权利要求1或2所述海岛棉受体类似蛋白激酶基因为靶基因的应用。
全文摘要
本发明涉及海岛棉受体类似蛋白激酶基因的克隆，属于生物技术领域。克隆了一个海岛棉受体类似蛋白激酶(GbRLK)基因cDNA的全长序列，以此设计出一对GbRLK的特异性引物利用RT－PCR方法，检测其在接菌黄萎病后的抗性海岛棉品种海7124中不同时期根中的表达情况，并用Northern杂交对其结果进行验证。因RT－PCR与Northern杂交显示该基因只在黄萎病处理后96小时表达。故该基因与黄萎病抗性有直接的关系，且该基因编码蛋白产物与植物防卫反应的信号传导有关，以此基因为靶基因，通过基因工程的方法改良目前棉花黄萎病的抗性，可尽快培育高抗黄萎病的棉花品种，并应用于棉花生产。
文档编号C12N9/12GK1974772SQ20051013490
公开日2007年6月6日 申请日期2005年12月30日 优先权日2005年12月30日
发明者张天真, 高玉龙, 郭旺珍 申请人:南京农业大学