专利名称：RNAi转染子的改良选择方法
技术领域：
本发明涉及通过RNAi的基因失活领域。更精确地，本发明涉及选择原理的领域，所述的原理用于富集和分离由不同的RNAi介导的基因沉默作用的细胞群体。具体地，本发明可用于肿瘤学领域和程序性细胞死亡领域中的功能性基因分析，所述功能性基因分析使用RNAi用于基因表达的瞬时和长期沉默。
背景技术：
RNAi介导的基因沉默现象首先描述于秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)系统，其中报道了显微注射长的双链RNA分子，使得不同的基因失活(US 6,506,559)。之后，RNAi介导的基因沉默在脊椎动物(EP 1 114 784)、哺乳动物尤其是人类细胞(EP 1 144 623)中公开。在这些系统中，如果转染短(19-29bp)的双链RNA分子以瞬时敲减特异性的目的基因，则成功实现基因失活。
在目前已经研究的多种生物中，RNA介导的基因失活机制似乎略微不同。但是在所有系统中，RNA介导的基因沉默是基于靶标mRNA的转录后降解，所述降解是由称作RISC复合体一部分的内切酶Argonaute2诱导(WO 03/93430)。降解的序列特异性是由装入RISC复合体中的特异性反义RNA链的核苷酸序列决定的。
引入的适当可能方法包括转染双链RNA分子本身或体内表达DNA载体构建体，所述DNA载体构建体直接产生短双链RNA化合物，其具有与靶标RNA分子部分一致的序列。在许多情形中，所谓的shRNA构建体已经成功用于基因沉默。这些构建体编码茎-环RNA，其特征在于在引入细胞后，其被加工为序列对应于原始RNA分子茎区的双链RNA化合物。
已经通过共表达细胞表面标志如CD-4来进行包含shRNA构建体的稳定转导的或转染的细胞的鉴定(Barton，G.M.和Medzhitov，R.，Proc.Natl.Acad.Science美国99(2002)14943-14945)。但是，在本发明之前，细胞表面标志的共表达未被用来富集或选择表达人工引入shRNA的细胞。
可以用不同的方法实现对转染细胞(包括用RNAi表达构建体转染的细胞)的选择。更普遍地，载体包含真核抗生素抗性基因如潮霉素抗性基因或新霉素抗性基因。检测、富集并且至少部分选择转染细胞的另一方法是使用编码表面抗原的表达盒，所述表面抗原在宿主细胞中不表达或以极低程度表达。
随后，细胞的富集可以通过流式细胞方法实现。一个著名的实例是使用低亲和性形式的神经生长因子受体1-NGFR作为表面标志来鉴定转染的细胞(Machl，A.W.等人，Cytometry 29(1997)371-374)。
除了通常需要多个星期的抗生素选择方法外，迄今为止，已使用表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为体内活性荧光标记蛋白质的其他表达构建体来富集和选择用包含shRNA表达构建体的沉默载体转染的活细胞。为了允许分析瞬时转染/转导的细胞，开发了共表达shRNA和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的载体(Kojima，S.等人，Biotechniques 36(2004)74-79)。还可以通过流式细胞方法富集表达EGFP的细胞。
但是，使用EGFP作为选择性标记具有一些缺点首先，EGFP超量表达在转染的细胞中可造成细胞毒性效应，根据所使用的细胞类型而具有不同的程度。其次，由于EGFP的荧光信号极大取决于该蛋白质的构象，此构象受到多种固定技术的干扰，所以该方法限于减少细胞固定的用途中。第三，当靶标基因的沉默引起细胞死亡时，由于膜破坏的细胞不能保留溶解的EGFP，所以EGFP不是一个有用的标记(Chalfie，M.和Kain，S.，(编著)，in Green Fluorescent Proteinproperties，applications and protocols，Wiley-Liss，New York，1998和Harvey，K.J.等人，Cytometry 43(2001)273-278)。
因此，本发明的目的是提供用于选择RNAi构建体转染/转导的细胞的改良方法。一方面，本发明的目的是提供用于快速富集和选择RNAi构建体转染的细胞的改良RNAi方法。具体地，本发明的目的是提供用于RNAi介导的基因沉默的改良方法，其允许分析在瞬时表达阶段中的程序性细胞死亡过程。
发明简述因此，本发明提供了用于改良和促进RNAi表达构建体转染的细胞的富集和选择方法、组合物和试剂盒。
第一方面，本发明涉及使真核细胞中基因表达失活的方法，其包括a)用DNA转化真核细胞，所述DNA包含表达细胞表面蛋白质的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒，所述化合物能够使所述基因表达失活，其中所述表达细胞表面蛋白质的表达盒和所述表达RNAi化合物的表达盒位于同一载体DNA上，b)富集和/或选择表达所述细胞表面蛋白质的细胞。
优选地，所述RNAi化合物是具有发夹构象的RNA。
同样优选地，表达所述细胞表面蛋白质的细胞的所述富集和选择通过细胞分选进行。
第二方面，本发明涉及组合物，其包含a)转染试剂，b)包含表达细胞表面蛋白质的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒的DNA，所述化合物能够使基因表达失活，其中所述表达细胞表面蛋白质的表达盒和所述表达RNAi化合物的表达盒位于同一载体DNA上。
优选地，所述组合物仅携带一种类型的载体DNA。因此，所述表达细胞表面蛋白质的表达盒和所述表达RNAi化合物的表达盒位于同一载体DNA上。
第三方面，本发明涉及包含表达1-NGFR的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒的载体，所述化合物能够在真核细胞中使基因表达失活。
第四方面，本发明涉及试剂盒，其包含a)包含表达细胞表面蛋白质的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒的载体，所述化合物能够使基因表达失活。
b)抗所述细胞表面蛋白质的单克隆抗体或多克隆抗血清。
在具体实施方案中，所述抗体用可检测的实体标记或与固相支持物共价连接。
在另一具体实施方案中，不与上述实施方案矛盾，根据本发明的试剂盒另外包含转染试剂。
发明详述如上所述的，本发明涉及在真核细胞中使基因表达失活的方法，其包含a)用DNA转染真核细胞，所述DNA包含表达细胞表面蛋白质的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒，所述化合物能够使所述基因表达失活，其中所述表达细胞表面蛋白质的表达盒和所述表达RNAi化合物的表达盒位于同一载体DNA上，以及b)富集和/或选择表达所述细胞表面蛋白质的细胞。
在本发明中，将术语“基因表达失活”定义为由RNAi化合物介导的特异性靶标RNA的降解。在表达RNAi化合物的表达盒或RNAi化合物的前体转染后，合成RNAi化合物本身，所述RNAi化合物的前体随后被内源细胞核酸酶加工成RNAi化合物。
在优选的实施方案中，所述基因表达失活是瞬时失活。在本发明中，将瞬时失活定义为在未施加选择性压力的细胞群体中，某一基因表达的失活。在本发明中，共表达所引入的细胞表面标志的细胞的富集提供了这种益处，在其本身转染后几天内可以进行不同的分析测定。此外，瞬时转染测定避免了产生稳定转化体的问题，该问题与进入宿主基因组的整合事件产生的生长劣势作用相关。
在另一实施方案中，为了实现永久失活，用重组表达的细胞表面标志的富集促进并且在很多情况下加快了稳定转染子的分离。
在非常短的时间内，已经证明RNAi是揭示基因功能的高特异性和强有力的工具，并且因此广泛用于学术和药物工业中靶标的确认。迄今为止，已经出现了用于体外研究的两种主要基因沉默方法小干扰RNA(siRNA)和小发夹RNA(shRNA)(Tuschl，T.，Nat.Biotechnol.20(2002)446-448)。化学合成的siRNA的使用受到对相当高转染效率的强依赖性的妨碍，这将其应用限制于易转染的细胞系。然而，由于不同的转染效率，实验间的结果仍是不同的，并且实际上仅是瞬时的。相反，在实现基因沉默作用期间中，载体来源的shRNA胜过siRNA。此外，它们提供了基于载体的表达系统的所有优势，如与报道基因或选择性标记组合，以及经由病毒载体的递送(Brummelkamp，T.R.和Bernards，R.，Nat.Rev.Cancer 3(2003)781-789)。因此，shRNA表达载体克服了基于低转染效率的限制。公开的关于这些载体的大部分工作是基于细胞系的，其中由于针对靶标基因的shRNA稳定表达而使靶标基因表达沉默(Caplen，N.J.，Gene Ther.11(2004)1241-1248)。但是，稳定细胞克隆的生长是缓慢和悠长的过程。
本发明的RNAi化合物可以是shRNA，其由适当的表达盒表达并且包含长度优选为19到29个核苷酸的茎区，其序列与待失活的靶标mRNA一样/互补。可选地，RNAi化合物的正义和反义链可以用相反的启动子分别从一个DNA片段转录。仍然可选地，可以从编码适当长度和序列的RNA的两个独立DNA转录RNAi化合物的正义和反义链。
如上述公开的，本发明将通过RNAi化合物的基因沉默概念和使用细胞表面蛋白质作为选择性标记的概念组合。在细胞表面表达的报道基因克服了与EGFP使用相关的限制，如毒性和分析程序性细胞死亡的不实用性。截短形式的低亲和性神经生长因子受体(因此对于信号转导是失活的)1-NGFR在细胞表面表达并且已经被证明了是用于细胞生物学分析的非常有用的标记(Phillips，K.等人，Nat.Med.2(1996)1154-1156和Machl，A.W.等人，Cytometry 29(1997)371-374)。将此有用的报道基因1-NGFR和shRNA载体(称作pHC载体)组合，成功允许了不依赖于转染效率的瞬时和高含量多参数的沉默细胞分析。
使用任何种类的这样的基因是在本发明的范围内的，所述基因的表达产物位于细胞表面，作为富集和选择高水平表达RNAi化合物的转染子的标记，条件是它们满足下列三项要求a)各自的宿主细胞不应当高水平表达对应的内源蛋白质。
b)表面标志的表达不会导致宿主细胞正常信号转导通路的改变。
c)另外，这些细胞表面蛋白质被截去了它们的细胞内信号传导结构域。此类截短的细胞表面蛋白质的实例是1-NGFR、H-2K和CD4(MiltenyBiotecMACSelect Transfected Cell Selection UserManual)。
本发明通常可用在表达被称作双链RNA核酸酶切酶和RISC复合体的所有活细胞中，或者换句话说，可用在其中可以观察到RNA介导的基因沉默的所有细胞中。因此，本发明可以用于所有类型的来自植物、真菌、的真核细胞、无脊椎动物细胞和脊椎动物细胞。优选地，本发明可用于哺乳动物细胞，特别是人类细胞或细胞系。
在本发明的范围内，可以用本领域已知的几乎任何种类的转染方法来得到细胞转化体。例如，可以通过电穿孔或显微注射将载体DNA引入到细胞中。可选地，可以使用脂质转染试剂如FuGENE 6(RocheDiagnostics)、X-tremeGENE(Roche Diagnostics)和LipofectamineTM(Invitrogen)。还可选地，可以通过基于反转录病毒、慢病毒、腺病毒或腺伴随病毒的适当病毒载体系统，将包含细胞表面蛋白质和RNAi化合物的表达盒的载体DNA引入到细胞中(Singer，O.，Proc.Natl.Acad.Sci.美国101(2004)5313-5314)。
包含本发明的表达盒的DNA可以是环形质粒载体或线性DNA片段，如限制性片段，或优选是PCR产物。
待转染的DNA可以包含一个或两个独立的载体DNA。在一个实施方案中，表达细胞表面蛋白质和表达RNA化合物的表达盒位于不同的DNA载体上。在优选的实施方案中，表达细胞表面蛋白质的表达盒和表达RNA化合物的表达盒位于同一载体上。在此情形中，需要避免两种转录物互相干扰。但是具有位于同一载体DNA上的两种表达盒是非常优选的，因为它促进了通过基于所表达的细胞表面标志的细胞分选来随后选择表达RNAi化合物的转化体。
本发明中将术语“表达盒”定义为基因构建体，其包含启动子序列、期望在宿主细胞中表达的RNA的编码DNA序列，以及任选地可用于终止转录的终止子序列。
表达细胞表面蛋白质的表达盒包含编码细胞表面蛋白质自身的DNA，和提供了细胞表面蛋白质稳定/组成型表达的聚合酶II(Pol II)启动子。合适的强启动子实例是CMV启动子、SV40启动子和PGK启动子。优选地，表达盒还包含SV40终止子元件，其提供了Pol II转录的精确终止。
可以从Pol II启动子如CMV启动子或从Pol III启动子如H1、U6或7SK启动子转录组成RNAi化合物的一种或多种转录物。在Pol III介导的转录情形中，必须在转录的RNA的3’端具有Pol III终止子序列TTTT，用于前体RNA产物的适当3’加工(Dykxhoorn，D.等人，Nat.Rev.Mol.CellBiol.4(2003)457-467)。
在一个优选的实施方案中，RNAi化合物是具有发夹构象的RNA，即shRNA。作为活性RNAi化合物，此类分子可以起始于在其5’端的G核苷酸，这是由于从H1和U6启动子的转录通常起始于G的事实。该分子的茎区通常长度为19到29个碱基对并且优选是19到23个碱基对。该分子的内环是4到40个核苷酸的单链，并且优选是4-9个核苷酸的单链。在3’端，可以存在突出端。在使用Pol III启动子的情形中，根据Pol III启动子的终止子信号，突出端可以是UUUU。当在细胞中表达时，这些发夹构建体被迅速加工为能够介导RNA基因沉默的活性双链分子(Dykxhoorn，D.等人，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.4(2003)457-467)。
在另一优选的实施方案中，转录RNAi化合物的启动子可以是诱导型启动子，其特征在于该启动子的活性通过外部信号刺激产生。原则上可以与任何类型的启动子组合的此类启动子系统的实例是tet阻抑物系统、激素诱导型启动子系统(Harvey，D.M.和Caskey，C.T.，Curr.Opin.Chem.Biol.2(1998)512-518)、组织特异性启动子或CRE系统(Ventura，A.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国101(2004)10380-10385)。最优选的是Pol III启动子与适当的tet阻抑物系统的组合(InvitrogenBLOCK-iT InducibleH1 RNAi Entry Vector User Manual)。
另外，本发明可能提供赋予转化细胞抗生素抗性(如潮霉素抗性或新霉素抗性)的第三种表达盒。
本发明中术语“富集”应当包括将经历了转染步骤的细胞群体分离成两个亚群的任何方法，其中第一个亚群比第二个亚群具有更高的转染细胞百分数。
本发明中术语“细胞的选择”应当意指任何方法，其中将经历了转染步骤的细胞群体随后富集成有效转染的细胞。
本领域的技术人员应当理解上述定义在一定程度上是重叠的。因此在很多情形中细胞的富集和选择可以通过本文公开的相同的方法来实现。
在本发明的范围内，可以用标记的单克隆抗体或多克隆抗血清来显微鉴定转染的细胞，所述单克隆抗体或多克隆抗血清抗表达的细胞表面蛋白质标志的胞外表位。
在本发明的范围内，转染细胞的富集和选择可以通过流式细胞工具来实现。在用荧光标记的抗细胞表面标志的单克隆抗体或多克隆抗血清标记细胞后，标记的细胞可以通过荧光激活的细胞分选仪来计数或富集。
在本发明的另一实施方案中，转染细胞的富集或选择是基于这样的原则，其中使用抗表达的细胞表面蛋白质的抗体包被的表面来只结合那些被成功转染的细胞。优选地，将包含共价结合的单克隆抗体或多克隆抗血清的适当珠子用作固相支持物。在高效实施方案中，通过称作“磁激活的细胞分选”(MACS)的技术富集和选择转染的细胞，所述技术是易于使用的并且可商业应用的方法，而不需要大量耗费人力和时间的细胞分选方法和仪器。
技术详细描述于选择MACSelect转染细胞的使用者指南(MiltenyBiotecMACSelect Transfected Cell Selection User Manual)中给出。简言之，将经历了转染步骤的细胞群体与包被了抗体的磁珠温育，所述抗体结合由于被引入的表达盒而在转染的细胞中表达的表面标志。因此，只有表达了表面标志的转染细胞能够结合到磁珠上。随后，样品包含用磁珠标记的转染细胞和未转染细胞的混合物，将其装填到磁分离器或其他分离柱中。相对于未转染的细胞，用这些顺磁珠标记的细胞选择性地结合到磁柱材料上。通过移去磁场，将标记的细胞从柱上释放。
因此在主要的方面中，本发明涉及通过使用适当的细胞表面标志富集和/或选择RNAi转化体的改良方法。使用细胞表面标志可在细胞群体中立即富集和选择转染的细胞，其表达RNAi化合物以沉默特异性的目的基因。
通常，通过适当的细胞表面蛋白质的选择可以在16-48小时后，即一旦细胞表面标志表达发生就进行。因而，可以在转染后迅速进行靶标基因被沉默的细胞的生物化学研究和表型分析，这排除了当细胞在组织培养中多次传代时任何潜在的长期人为假象。另外，通过使用适当的细胞表面蛋白质标志的选择可以重复多次。
在另一方面中，本发明涉及包含表达1-NGFR的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒的载体，所述化合物能够使基因表达失活。优选地，表达RNAi化合物的所述表达盒提供了茎-环发夹RNA，其茎区可以作用为基因沉默介导化合物。编码1-NGFR报道基因的载体与shRNA表达盒一起能够进行沉默了个体靶标基因表达的细胞的第一次定量多参数分析。通过使用基于shRNA pHC载体的1-NGFR，可以不依赖于转染效率来分析多种细胞系和初级细胞的细胞周期分布、程序性细胞死亡的诱导、细胞构造以及mRNA和蛋白质的表达。
仍在另一方面中，本发明涉及组合物，其包含a)转染试剂，b)包含表达细胞表面蛋白质(其优选是1-NGFR)的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒的DNA，所述化合物能够使基因表达失活，其中所述表达细胞表面蛋白质的表达盒和所述表达RNAi化合物的表达盒位于同一载体DNA上。
优选地，所述转染试剂是脂质转染试剂如FuGENE 6、X-tremeGENE(都来自Roche Diagnostics)或LipofectamineTM(Invitrogen)。
同样优选地，所述组合物仅携带一种类型的载体DNA。
在另一实施方案中，本发明涉及试剂盒，其包含a)包含表达细胞表面蛋白质(其优选是1-NGFR)的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒的载体，所述化合物能够使基因表达失活。
b)抗所述细胞表面蛋白质的单克隆抗体或多克隆抗体。
表达RNAi化合物的表达盒包含启动子(其可以是Pol II启动子或PolIII启动子)、插入特异性序列(其最终将作为介导基因沉默的RNAi化合物)的克隆位点，以及优选的不同终止子序列。
在具体的实施方案中，所述抗体用可检测的实体如荧光实体标记，或与固相支持物共价连接。例如，所述固相支持物可以是珠子，优选是磁珠。
在另一具体实施方案中，不与如上所述的实施方案矛盾，根据本发明的试剂盒包含具有编码不同细胞表面蛋白质的不同表达盒的几种不同载体。这将允许消费者选择用于待转染的具体细胞系的适当富集和选择系统。
如果试剂盒包含转染试剂(优选是脂质转染试剂)，以及一种或几种包含表达细胞表面蛋白质的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒的载体DNA，所述化合物能够使所述基因表达失活，其同样在本发明的范围内。
另外，此类试剂盒还可以包含抗所述细胞表面蛋白质的单克隆抗体或多克隆抗血清。任选地，所述抗体用可检测的实体如荧光实体标记或与固相支持物共价连接。例如，所述固相支持物可以是珠子，优选是磁珠。
提供了下列实施例、参考文献、序列表和图来帮助理解本发明，其真正范围在所附的权利要求中说明。
图1产生编码1-NGFR和驱动shRNA表达盒的U6启动子的载体的克隆方法。
图2在细胞表面表达的HER2蛋白质的敲减效率。
图3在瞬时转染实验中通过磁性细胞分离(MACS)富集1-NGFR阳性细胞。
图4与未被分选的细胞相比，在磁性分选的细胞中的敲减效率，以及通过胞质蛋白质eg5的沉默引起的表型改变。
图5在瞬时转染测定中通过胞质蛋白质eg5沉默引起的表型改变。
图6在瞬时转染测定中通过eg5沉默引起的表型改变的多参数分析。
实施例1产生编码1-NGFR和驱动shRNA表达盒的U6启动子的载体的克隆方法。
为了高含量地产生共表达驱动shRNA盒的U6启动子的1-NGFR载体(称作pHC)，使用下列引物，通过PCR从1-NGFR表达载体中扩增具有SV40早期启动子和聚腺苷酸化序列的1-NGFR OREpHC_FW 5`-CGCCTCGAGTCCCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAG-3`(SEQ ID NO1)和pHC_RV 5`-CGCAAGCTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTC-3`(SEQ ID NO2)使用HindIII和由位点定向诱变生成的XhoI单一限制性位点(Stratagene)，将1-NGFR PCR片段亚克隆到pSilencer U6 2.1 Hygro(Ambion)中。随后，将编码shRNA序列的多种DNA寡核苷酸(由Metabion(德国)化学合成的)退火并且连接进入pHC中以生成pHC_luc、pHC_eg5和pHC_Her2luc5′-GATCCGCTTACGCTGACTTCGATTCAAGAGATCGAAGTACTCAGCGTAAGTTTTTTGGAA-3′(SEQ ID NO3)
5′-AGCTTTTCCAAAAAACTTACGCTGAGTACTTCGATCTCTTGAATCGAAGTACTCAGCGTAAGCG-3′(SEQ ID NO4)eg55′-GATCCGCTGAAGACCTGAAGACAATTTCAAGAGAATTGTCTTCAGGTCTTCAGTTTTTTGAAA-3′(SEQ ID NO5)5′-AGCTTTTCCAAAAAACTGAAGACCTGAAGACAATTCTCTTGAAATTGTTTCAGGTCTTCAGCG-3′(SEQID NO6)Her25′-GATCCGGACGAATTCTGCACAATGTTCAAGAGACATTGTGCAGAATTCGTCCCCTTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID NO7)5′-GCTTTTCCAAAAAAGGGGACGAATTCTGCACAATGTCTCTTGAACATTGTGCAGAATTCGTCCG-3′(SEQID NO8)pHC_Her2 D25′-GATCCGTATGTGAACCAGCCAGATGTTCAAGAGACATCTGGCTGGTTCACATATTTTTTGGAAA-3′(SEQID NO9)5′-AGCTTTTCCAAAAAAGTGAACCAGCCAGATGTCTCTTGAACATCTGGCTGGTTCACATACG-3′(SEO ID NO10)pHC_Her id15′-GATCCGACGAATTCTGCACAATGGTTCAAGAGACCATTGTGCAGAATTCGTCCCTTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID NO11)
5′-AGCTTTTCCAAAAAAGGGACGAATTCTGCACAATGGTCTCTTGAACCATTGTGCAGAATTCGTCG-3′(SEQ ID NO12)pHC_Her id25′-GATCCGGACGAATTCTGCACAATGTTCAAGAGACATTGTGCAGAATTCGTCCCCTTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID NO13)5′-AGCTTTTCCAAAAAAGGGGACGAATTCTGCACAATGTCTCTTGAACATTGTGCAGAATTCGTCCG-3′(SEQ ID NO14)pHC_Her id45′-GATCCAGACGAAGCATACGTGATGTTCAAGAGACATCACGTATGCTTCGTCTAATTTTTTGGAAA-3′(SEQ ID NO15)5′-AGCTTTTCCAAAAAATTAGACGAAGCATACGTGATGTCTCTTGAACATCACGTATGCTTCGTCTG-3′(SEQ ID NO16)所有的发夹包含作为环结构的9bp序列TTCAAGAGA(SEQ ID NO17)。pHC载体可用于需要瞬时转染的测定以及沉默了所需靶标基因的稳定转染子的产生。
实施例2在细胞表面表达的HER2蛋白质的敲减效率用4个不同的编码针对HER2的shRNA的pHC_Her2构建体转染SKBR3细胞。转染在这些细胞中不表达的靶向荧光素酶的pHC_luc作为阴性对照。通过对细胞进行HER2和1-NGFR染色，随后通过流式细胞分析，确定在pHC_luc和pHC_Her的Fugene 6(Roche Diagnostics)转染的细胞中HER2的表达。门控1-NGFR阳性细胞使得能够进行转染的细胞群体的专有分析。结果显示在图2中。在直方图中，黑色直方代表未转染的(1-NGFR阴性)细胞的HER2表达，而灰色直方代表从同一样品中记录的转染的(1-NGFR阳性)细胞的HER2表达。在直方图中的虚线图代表同种型对照染色。在x轴上和直方图上方的数字指示了HER2表达的平均荧光强度；FL2-HeightHER2表达(间接免疫荧光染色1stABrhu MAB 2C4(Genentech)，2ndAB抗人IgG-PE缀合物(Caltag))；1-NGFR表达用FITC标记的抗1-NGFR抗体(Boehringer Mannheim)检测。pHC_Her D2、pHC_Her id1、pHC_Her id2和pHC_Her id4代表编码4个不同的针对HER2的shRNA的4种不同载体构建体。
HER2的成功沉默与通过流式细胞分析确定的1-NGFR表达密切相关。因此，在细胞表面表达的蛋白质可以适用于所发明的使用编码1-NGFR和shRNA表达盒的高含量RNAi方法。
实施例3瞬时转染实验中通过磁性法细胞分离(MACS)富集1-NGFR阳性细胞根据实施例2的转染pHC_luc96小时后，用MACSelect 1-NGFR系统(Miltenyi Biotech)来富集1-NGFR阳性细胞。在直方图(图3)中，将未转染的细胞群体的1-NGFR表达(黑色曲线)分别与pHC_luc转染的细胞群体MACS分选前(上面的图，灰色曲线)和MACS分选后(下面的图，灰色曲线)的1-NGFR表达对比。此处通过使用<抗小鼠>-Alexa488 Ab(分子探针)进行<抗1-NGFR>-小珠标记细胞的流式细胞检测。在直方图中的数字指示了磁性细胞分离前后小珠标记的细胞百分数。
因此，使用1-NGFR作为报道基因提供了通过磁性细胞分选，来富集沉默的细胞的唯一选择。
实施例4与未分选的细胞相比在磁性分选的细胞中的敲减效率以及胞质蛋白质eg5沉默引起的表型改变A驱动蛋白eg5在有丝分裂纺锤体装配中起重要作用。在活跃增殖的细胞中持续敲减eg5表达导致G2/M诱导中止，随后是程序性细胞死亡。用FITC标记的抗1-NGFR抗体和DNA染料Hoechst 33342进行细胞双染色，从而在pHC_luc(对照)和pHC_eg5的Fugene 6转染(RocheDiagnostics)96小时后进行HCT-116细胞的细胞周期分析。图4a的直方图表现出未门控1-NGFR阳性细胞和门控1-NGFR阳性细胞(分别是上图和下图)时，用pHC_luc(黑色曲线)或pHC_eg5(虚线)转染的细胞的细胞周期分布。直方图中的箭头指示了用pHC_eg5转染的细胞的G2/M期上升。MACS分选前后对HCT-116细胞中的eg5蛋白质表达进行了Western印迹分析。在用pHC_luc(阴性对照)和pHC_eg5转染96小时后得到来自细胞的总蛋白质裂解液。将样品命名如下-MACS在转染后的原始样品中pHC转染细胞富集前的eg5表达；Neg流动细胞群体(未转染的，1-NGFR阴性细胞不结合到MACS柱上)的eg5表达；+MACS富集的细胞群体(转染的，从MACS柱上洗脱的1-NGFR阳性细胞级分)的eg5表达。
B在非常易于转染的PC3细胞中进行与在实施例4A中描述的相同的分析，并且显示于图4b中。但是即使是在此细胞系中，门控1-NGFR阳性细胞极大改变了表型分析的结果。平行地，通过MACS的1-NGFR阳性细胞的富集改变了通过Western印迹进行的敲减效率的检测。
因此，基于1-NGFR表达的磁性分选使得已经能够通过多种生物化学方法(如RT-PCR、Northern印迹法、Western印迹法)在瞬时转染的细胞中检测敲减效率。
实施例5在瞬时转染测定中胞质蛋白质eg5沉默引起的表型改变如实施例4，在pHC_luc(对照)和pHC_eg5转染72小时后，通过用FITC标记的抗1-NGFR抗体和DNA染料Hoechst 33342对细胞双染色，来进行HCT-116细胞的细胞周期分析。在图5中，以1-NGFR表达的log10对Hoechst 33342荧光强度的线性刻度作图。R1未转染的(1-NGFR阴性)细胞；R2转染的(1-NGFR阳性)细胞。箭头指示了pHC_eg5转染的细胞的G2/M期上升。
得出结论是位于胞质的蛋白质适用于使用本发明pHC载体的高含量RNAi，所述pHC_载体编码1-NGFR和shRNA表达盒。
实施例6在瞬时转染测定中eg5沉默引起的表型改变的多参数分析通过如实施例4的AnnexinV(Roche)和DAPI(Roche)双染色，并结合确定转染72小时后eg5沉默的细胞中程序性细胞死亡百分数的1-NGFR检测，来测定转染的程序性细胞死亡的细胞。Annexin V阳性细胞记为程序性细胞死亡的，AnnexinV/DAPI双染色的细胞记为程序性细胞死亡-坏死的，且DAPI阳性细胞记为坏死的。结果显示在图6中。箭头指示了程序性细胞死亡的诱导，接着是在eg5表达沉默的1-NGFR阳性(＝转染的)细胞中坏死。R1未转染的(1-NGFR阴性)细胞；R2转染的(1-NGFR阳性)细胞。
在膜完整性损坏的染色的细胞中，与结合在细胞膜上的1-NGFR相比，胞质蛋白质如EGFP容易丢失。这说明了对于1-NGFR表达，程序性细胞死亡和程序性细胞死亡-坏死的细胞都是染色阳性。因此，使用包含pHC载体的1-NGFR促进了沉默引起的程序性细胞死亡的靶标分析。
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序列表序列表<110>弗·哈夫曼-拉罗切有限公司<120>RNAi转染子的改良选择方法<130>22881 WO<150>EP 04029505<151>2004-12-14<160>17<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>34<212>DNA<213>人工的<220>
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权利要求
1.在真核细胞中使基因表达失活的方法，其包括a)用DNA转化真核细胞，所述DNA包含表达细胞表面蛋白质的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒，所述化合物能够使所述基因表达失活，其中所述表达细胞表面蛋白质的表达盒和所述表达RNAi化合物的表达盒位于同一载体DNA上，b)富集和/或选择表达所述细胞表面蛋白质的细胞。
2.根据权利要求1的方法，其中所述RNAi化合物是具有发夹构象的RNA。
3.根据权利要求1或2的方法，其中表达所述细胞表面蛋白质的细胞的所述富集和/或选择通过细胞分选进行。
4.包含表达1-NGFR的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒的载体，所述化合物能够在真核细胞中使基因表达失活。
5.组合物，其包含a)转染试剂，b)包含表达细胞表面蛋白质的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒的DNA，其中所述表达细胞表面蛋白质的表达盒和所述表达RNAi化合物的表达盒位于同一载体DNA上。
6.试剂盒，其包含a)包含表达细胞表面蛋白质的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒的载体，b)抗所述细胞表面蛋白质的单克隆抗体或多克隆抗血清。
7.根据权利要求6的试剂盒，其中所述抗体用可检测的实体标记或与固相支持物共价连接。
8.根据权利要求6或7的试剂盒，其进一步包含a)转染试剂。
全文摘要
本发明涉及在真核细胞中使基因表达失活的方法，其包括(I)用DNA转化真核细胞，所述DNA包含表达细胞表面蛋白质的表达盒和表达RNAi化合物的表达盒，所述化合物能够使所述基因表达失活，其中所述表达细胞表面蛋白质的表达盒和所述表达RNAi化合物的表达盒位于同一载体DNA上，以及(II)富集和/或选择表达所述细胞表面蛋白质的细胞。
文档编号C12N15/64GK101068928SQ200580041275
公开日2007年11月7日 申请日期2005年12月13日 优先权日2004年12月14日
发明者M·库比斯, R·马瑟克, C·里斯 申请人:弗·哈夫曼-拉罗切有限公司