具有葡糖淀粉酶活性的多肽以及编码该多肽的多核苷酸的制作方法

专利名称：：具有葡糖淀粉酶活性的多肽以及编码该多肽的多核苷酸的制作方法具有葡糖淀粉酶活性的多肽以及编码该多肽的多核苷酸相关申请的交叉引用本申请依据35U.S.C.119要求2004年12月22日和2005年2月7曰提交的临时申请60/638,614和60/650,612的权益，在此将上述申请的内容引用并入本文。序列表的交叉引用本申请包含计算机可读形式的序列表。在此将该计算机可读形式引用并入本文。
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：发明领域本发明涉及具有葡糖淀粉酶活性的多肽以及编码这些多肽的多核苷酸。本发明也涉及包含该多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所述多肽的方法，还涉及本发明的葡糖淀粉酶用于淀粉转化以产生发酵产物，例如乙醇，和糖浆(symps),例如葡萄糖的用途。本发明还涉及包含本发明的葡糖淀粉酶的组合物。相关技术描述葡糖淀粉酶(l,4-a-D-葡聚糖葡萄糖水解酶(l,4-a-D-glucanglucohydrolase),EC3.2丄3)是一种催化从淀粉或相关寡/多糖分子的非还原端释放D-葡萄糖的酶。葡糖淀粉酶由某些丝状真菌和酵母产生，其中来自曲霉的葡糖淀粉酶是产业上最重要的。产业上，葡糖淀粉酶用于转化已被a-淀粉酶部分水解为葡萄糖的淀粉质物料。随后，使用发酵生物，可将葡萄糖直接或间接转化为发酵产物。产业上的发酵产物的例子包括醇(例如，乙醇、曱醇、丁醇、1,3-丙二醇)；有机酸(如，柠檬酸、乙酸、衣康酸、乳酸、葡糖酸(gluconicacid)、葡糖酸盐或酯或根(gluconate)、乳酸、琥珀酸、2,5-二酮-葡糖酸)；S同(如丙酮)；氨基酸(如谷氨酸)；气体(如H2和C02)和更复杂的化合物，包括例如，抗生素(如，青霉素和四环素)；酶；维生素(如，核黄素、B12、(3-胡萝卜素)；激素，和其它难于合成生产的化合物。发酵方法常用于可消费醇类(如，啤酒和葡萄酒)、乳制品(如，酸乳和干酪的生产)，皮革和烟草工业。终产物也可以是糖浆。例如，终产物可以是葡萄糖，^旦也可以-故例如葡萄糖异构酶转化为果糖，或几乎由相等的葡萄糖和果糖组成的混合物。这种混合物，或更富集了果糖的混合物，是最常用的高果糖玉米糖浆(highfructosecornsymp,HFCS),已在全球范围内商品化。Boel等，(1984),EMBOJ.3(5),p.1097-1102披露了黑曲霉(A/erg/〃^m'ge。Gl或G2葡糖淀粉酶。美国专利4,727,0464皮露了源自罗耳伏革菌(Cb^"'wmra砂")的葡糖淀4分酶，该菌又称A/7e//ara诉"。WO84/029214皮露了源自泡盛曲霉04^e/^7/wmramon〕的葡糖淀4分酶。WO99/282484皮露了〉原自ra/fi(rom_ycesemerso"/《Jia/(aro附yceseme/^o"z.0的葡糖淀粉酶。WO00〃5296才皮露了源自痂状嗜热子嚢菌(777ermoocwscn^tocew力的葡糖淀粉酶。本发明的目的之一是提供具有葡糖淀粉酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸，其在发酵产物生产过程中提供高产率，例如在乙醇生产过程中，包括从未糊化的生(raw)(或未蒸煮(uncooked))淀4分开始的一步乙醇发酵过程。发明概述本发明涉及选自下列的具有葡糖淀粉酶活性的多肽(a)具有下述氨基酸序列的多肽，该序列与SEQIDNO:2第1至556位的成熟多肽氨基酸具有至少75%的氨基酸同一性；或(al)具有下述氨基酸序列的多肽，该序列与SEQIDNO:37第1至位的成熟多肽氨基酸具有至少75%的氨基酸同一性；(b)由下述核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列(i)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:l第55至2166位核苷酸杂交，或(ii)在至少中等严紧条件下与SEQIDNO:3第55至1725位核苷酸中所含的cDNA序列杂交，或(m)(i)或(ii)的互补链；或(bl)由如下核苷酸序列编码的多肽，所述多核苷酸(i)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:36的第55至2166位核苷酸杂交，或(ii)在至少中等严紧条件下与SEQIDNO:38第55至1737位核香酸中所含的cDNA序列杂交，或(iii)(i)或(ii)的互才M连；以^(c)SEQIDNO:2的第1至556位氨基酸中包含一个或多个氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的变体；(cl)SEQIDNO:37的第1至561位氨基酸中包含一个或多个氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的变体。本发明还涉及编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，其选自下列(a)编码具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列与SEQIDNO:2的第1至556位成熟多肽氨基酸具有至少75%的同一性；(al)编码具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列与SEQIDNO:37的第1至561位成熟多肽氨基酸具有至少75%的同一性；(b)与SEQIDNO:l的第55至2166位核香酸具有至少60%的同一性的多核苷酸；或(M)与SEQIDNO:36的第55至2166位核苷酸具有至少60%的同一性的多核苷酸；(c)与SEQIDNO:3的第55至1725位核苦酸具有至少60%的同一性的多核苷酸；或(cl)与SEQIDNO:38的第55至1737位核苦酸具有至少60%的同一性的多核苷酸；(d)由下述核苷酸序列编码的多肽，该核苷酸序列(i)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:l的第55至2166位核苷酸杂交，或(ii)在至少中等严紧条件下与SEQIDNO:3的第55至1725位核苦酸中所含的cDNA序列杂交，或(iii)(i)或(ii)的互补链；或(dl)由下述核脊酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列(i)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:36的第55至2166位核苷酸杂交，或(ii)在至少中等严紧条件下与SEQIDNO:38的第55至1737位核苷酸中所含的cDNA序列杂交，或(iii)，(i)或(ii)的互补链。在一个优选实施方式中，多肽源自栓菌属(rramete力的菌抹，优选rrawefesc/"gw/ato，或源自保藏于DSMZ、保藏号为17106的大肠杆菌(五.co//)菌株。保藏菌抹17106包含质粒HUda595，该质粒包含与SEQIDNO:1相同的序列。本发明的一个具体的多肽是如下所述的多肽当如实施例6所述在适当的真菌宿主细月包，例如米曲霉(j^erg〃/ws中表达质粒pHUda440时，所获得的成熟多肽。在第二个方面，本发明还涉及选自下列的具有葡糖淀粉酶活性的多肽(a)与SEQIDNO:5第1至575位的成熟多肽氨基酸具有至少70%氨基酸同一性的氨基酸序列的多肽；或(al)与SEQIDNO:40第1至位的成熟多肽氨基酸具有至少70%氨基酸同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由下述核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列(i)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:4的第55至2189位核苷酸杂交，或(ii)在至少中等严紧条件下与SEQIDNO:6第55至1725位核苷酸中所含的cDNA序列杂交，或(iii)(i)或(ii)的互才卜4连；或(bl)由如下核苷酸序列编码的多肽，该序列(i)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:39的第55至2182位核苷酸杂交，或(ii)在至少中等严紧条件下与SEQIDNO:41的第55至1749位核苷酸中所含的cDNA序列杂交，或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交；以及(c)SEQIDNO:5的第1至575位氨基酸中包含一个或多个氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的变体；(cl)SEQIDNO:40的第1至565位氨基酸中包含一个或多个氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的变体。本发明还涉及编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽的多核苷酸，其选自下列(a)编码具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列与SEQIDNO:5的第1至575位成熟多肽氨基酸具有至少75%的同一性；或(al)编码具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列与SEQIDNO:40的第1至565位成熟多肽氨基酸具有至少75%的同一性；(b)与SEQIDNO:4的第55至2189位核香酸具有至少60%的同一性的多核芬酸；或(bl)与SEQIDNO:39的第55至2182位核香酸具有至少60%的同一性的多核苷酸；(c)与SEQIDNO:6的第55至1725位核苷酸具有至少60%的同一性的多核苷酸；或(cl)与SEQIDNO:41的第55至1749位核苷酸具有至少60°/。的同一性的多核香酸；(d)由下述核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列(i)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:4中第55至2189位核苷酸杂交，或(ii)在至少中等严紧条件下与SEQIDNO:6中第55至1725位核苷酸中所含的cDNA序列杂交，或(iii)(i)或(ii)的互补链；或(dl)由下述核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列(i)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:39的第55至2182位核苷酸杂交，或(ii)在至少中等严紧条件下与SEQIDNO:41的第55至1749位核苷酸中所含的cDNA序列杂交，或(iii)(i)或(ii)的互补《连。在一个优选实施方式中，所述多肽来自尸ac/^/^to^ora属菌才朱，优选Pac/^^yfas/orapa;^racea,或保藏于DSMZ、寸呆藏号为17105的大肠^干菌菌抹。保藏菌林17105包含质粒HUda594，该质粒包含SEQIDNO:4相同的序列。本发明的一个具体的多肽是这样的多肽当如实施例6所述在适当的真菌宿主细胞例如米曲霉中表达质粒pHUda450时，获得的成熟多肽。在第三个方面，本发明还涉及选自下列的具有葡糖淀粉酶活性的多肽(a)与SEQIDNO:26第1至556位的成熟多肽氨基酸具有至少60%氨基酸同一性的氨基酸序列的多肽；或(al)与SEQIDNO:24第1至548位的成熟多肽氨基酸具有至少60%氨基酸同一性的氨基酸序列的多肽；或(a2)与SEQIDNO:43第1至523位的成熟多肽氨基酸具有至少60%氨基酸同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由下述核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列(i)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:23的第117至2249位核苷酸杂交，或(ii)在至少^f氐严紧条件下与SEQIDNO:25的第52至1719位核芬酸中所含的cDNA序列杂交，或(iii)(i)或(ii)的互补链；(bl)由如下核苷酸序列编码的多肽，该序列(i)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:42的第52至1620位核苷酸中所含cDNA序列杂交，或(iii)(i)或(ii)的互补链；以及(c)SEQIDNO:26的第1至556位氨基酸中包含一个或多个氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的变体；(cl)SEQIDNO:24的第1至548位氨基酸中包含一个或多个氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的变体；(c2)SEQIDNO:43的第1至523位氨基酸中包含一个或多个氨基酸的保守取代、缺失、和/或插入的变体。本发明还涉及选自下列的编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽的多核普酸(a)编码具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列与SEQIDNO:26的第1至556位成熟多肽氨基酸具有至少60°/。的同一性；或(al)编码具有如下氨基酸序列的多肽的多核普酸，所述氨基酸序列与SEQIDNO:24的第1至548位成熟多肽氨基酸具有至少60%的同一性；或(a2)编码具有如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列与SEQIDNO:43的第1至523位成熟多肽氨基酸具有至少60%的同一性；(b)与SEQIDNO:23的第117至2249位核苷酸具有至少60%的同一性的多核苷酸；或(c)与SEQIDNO:25的第52至1719位核苷酸具有至少60%的同一性的多核香酸；或(cl)与SEQIDNO:42的第52至1W0位核苷酸具有至少60°/。的同一性的多核苷酸；(d)由下述核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列(i)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:23的第117至2249位核苷酸杂交，或(ii)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:42的第52至1620位核苷酸中所含的cDNA序列杂交，或(iii)(i)或(ii)的互补链；或(dl)由下述核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列(i)在至少低严紧条件下与SEQIDNO:25的第52至1719所含的cDNA序列杂交，或(iii)(i)或(ii)的互补链。在一个优选实施方式中，所述多肽可源自白桩菇属(丄eMCopox/〃w》菌抹，寸尤选是大白才庄菇(丄ewcop"ja'〃t^g/ga"few"，或源自3口SEQIDNO:26戶斤示的序列。本发明的一个特定多肽是这样的多肽当如实施例11所述在适当的真菌宿主细胞例如黑曲霉中表达质粒pENI3372时，获得的成熟多肽。本发明还涉及核酸构建体、重组表达载体和重组宿主细胞，其分别包含下述序列中的多核普酸SEQIDNOS:1或3(cDNA)或36或38(cDNA);或SEQIDNO:4或6(cDNA)或39或41(cDNA);或SEQIDNO:23或25(cDNA)或42(cDNA)。根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约的要求，将发明人确信与SEQIDNO:1和4相同的克隆于2005年2月2日保藏于德国4鼓生物和培养物保藏中心(DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturenGmbH,DSMZ)(MascheroderWeglb,D-38124BraunschweigDE.)。所述克隆^L全合予4呆藏号DSM17106和DSM17105。本发明还涉及生产所述具有葡糖淀粉酶活性的多肽的方法，其包括(a)在有助于生产该多肽的条件下培养包含核酸构建体的重组宿主细胞，所述核酸构建体包含编码所述多肽的多核苷酸；并(b)回收所述多肽。本发明还涉及生产发酵产物或糖浆的方法。定义葡糖淀粉酶活性(Glucoamylaseactivity):术语"葡糖淀粉酶"(l，4-a-D-葡聚糖葡萄糖水解酶)定义为催化D-葡萄糖从淀粉的或相关寡糖和多糖的非还原端释放的酶。为了本发明的目的，葡糖淀粉酶活性根据下述"材料和方法"部分的程序测定。本发明的多肽具有分别由下列序列组成的多肽的至少20%、优选至少40%、更优选至少50%、更优选至少60%、更优选至少70%、更优选至少80%、更优选至少90%、最优选至少95%、甚至最优选至少100%的葡糖淀粉酶活性SEQIDNO:2的第1至556位氨基酸或SEQIDNO:37的第1至561位氨基酸；或SEQIDNO:5的第1至575位氨基酸或SEQIDNO:40的第1至565位氨基酸；或SEQIDNO:24的第1至548位氨基酸或SEQIDNO:26的第l至556位氨基酸或SEQIDNO:43的第1至523位氨基酸。多肽(Polypeptide):术语"多肽"在用于本文时指根据SDS-PAGE的测定，至少20%纯、优选至少40%纯、更优选至少60%纯、更优选至少80%纯、最优选至少90%纯、甚至最优选至少95%纯的分离多肽。基本上纯的多肽(substantiallypurepolypeptide):术语"基本上纯的多肽"在本文中指以重量计含有至多10%、优选至多8%、更优选至多6%、更优选至多5%、更优选至多4%、至多3%、甚至更优选至多2%、最优选至多1%、且甚至最优选至多0.5%与该多肽天然相伴随的其它多肽物质的多肽制备物。因此，优选的是，基本上纯的多肽以重量计制备物中存在的全部多肽物质是至少92%纯、优选至少94%纯、更优选至少95%纯、更优选至少96%纯、更优选至少96%的纯、更优选至少97%纯、更优选至少98%纯、甚至更优选至少99%纯、最优选至少99.5%纯、甚至最优选100%纯的。本发明的多肽优选是基本上纯的形式。具体而言，优选的是多肽是"实质上(essentially)纯的形式"，即多肽制备物实质上不含与该多肽天然相伴随的其它多肽物质。例如，这可通过采用众所周知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来实现。在本文中，术语"基本上纯的多肽"与术语"分离多肽"和"分离形式的多肽"含义相同。同一性(identity):本文用参数"同一性"来描述两种氨基酸序列之间或两种核苷酸序列之间的相关性(relatedness)。为了本发明的目的，两种氨基酸序列之间的同一性程度可使用Clustal方法(Higgins，1989,CABIOS5:151-153)来确定，使用具有同一性表(identitytable)的LASERGENETMMEGALIGNtm軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)和下述多个比对参数缺口罚分10;缺口长度罚分10。配对比对参数Ktuple=l,缺口罚分=3，窗口数(windows)=5,对角线数(diagonals)=5。为了本发明的目的，两种核苷酸序列之间的同一性程度可使用Wilbur-Lipman算法(WilburandLipman,1983,/VoceWwgso/f/zeA^"o"a/Jcac/ewy5We"ce80:726-730)来确定，使用具有同一性表的LASERGENEMEGALIGNtm軟件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)和下述多个比对参数缺口罚分10;缺口长度罚分10。配对比对(pairwisealignment)参数Ktuple=3,缺口罚分=3，窗口数=20。多肽片段(Polypeptidefragment):术语"多肽片段，，在本文中定义为从下列序列的氨基末端和/或羧基末端缺失一个或多个氨基酸的多肽SEQIDNO:2或37;或SEQIDNO:5或40;或SEQIDNO:24、26或43，或其同源序列，其中所述片段具有葡糖淀粉酶活性。子序列(Subsequence):术语"子序列"在本文中定义为/人下述序列的5'和/或3'末端缺失了一个或多个核苷酸的核普酸序列SEQIDNO:l、36或38;或SEQIDNO:4、39或41;或分别为SEQIDNO:23、25或42,或其同源序列；其中子序列编码具有增强葡糖淀粉酶活性的多肽片段。等位变体(Allelicvariant):术语"等位变体"在本文中指占据同一染色体位的基因的两种或多种可选形式中的任一种。等位变异由突变天然引起，并可导致种群内多态性。基因突变可以是沉默的(所编码多肽没有变化)，或者可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的等位变体编码的多肽。基本上纯的多核香酸(Substantiallypurepolynucleotide):术语"基本上纯的多核芬酸，，在用于本文时指不含其它外来(extraneous)或不需要的核苷酸，并以适于在经基因工程改造的蛋白质生产系统内使用的形式存在的多核普酸制备物。因此，基本上纯的多核苷酸以重量计含有至多10%、优选至多8%、更优选至多6%、更优选至多5%、更优选至多4%、更优选至多3%、甚至更优选至多2%、最优选至多1%、且甚至最优选至多0.5%的与该多核苷酸天然相伴随的其它多核苷酸物质。然而，基本上纯的多核苷酸可包括天然存在的5'和3'非翻译区，诸如启动子和终止子。优选的是，基本上纯的多核苷酸以重量计是至少90%纯、优选至少92%纯、更优选至少94%纯、更优选至少95%纯、更优选至少96%纯、更优选至少97%纯、甚至更优选至少98%纯、最优选至少99%纯、且甚至最优选至少99.5%纯的。优选的是，本发明的多核苷酸是基本上纯的形式。具体而言，优选的是，本文公开的多核苷酸是"实质上纯的形式"，即多核苷酸制备物实质上不含与该多核苷酸天然相伴随的其它多核苷酸物质。在本文中，术语"基本上纯的多核苦酸"与术语"分离多核苷酸"和"分离形式的多核苷酸"同义。多核苷酸可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源或其任意组合。成熟的、经过剪接的mRNA分子而制备的DNA分子。cDNA缺乏在相应的基因组DNA中通常存在的内含子序列。最初的初级RNA转录本是mRNA的前体，它在成为成熟的、经过剪接的mRNA之前要经过一系列加工步骤。这些步骤包括通过称为"剪接"的过程除去内含子序列。因此，由mRNA衍生的cDNA缺乏任何内含子序列。核酸构建体(Nudeicacidconstruct):术语"核酸构建体"在用于本文时指单链或双链的核酸分子，它是由天然存在的基因分离的，或是经过修饰而以自然界中不存在的方式含有核酸区段。当核酸构建体含有表达本发明编码序列所需要的控制序列时，术语核酸构建体与术语"表达盒"含义相同。控制序列(Controlsequence):术语"控制序列，，在本文中定义为包括对表达编码本发明多肽的多核苷酸所必需的或有利的所有成分。每种控制序列对编码所述多肽的核苷酸序列来说可以是天然的或外来的。这些控制序列包括，但不限于，前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少，控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。为了引入特异的限制性位点以便于控制序列与编码多肽的核苷酸序列编码区连接，控制序列可以带有接头(linkers)。可操作连接(Operablylinked):术语"可操作连接"在本文中指这样一种构造，其中控制序列置于相对于多核苷酸序列的编码序列的适当位置，使得控制序列指导多肽编码序列的表达。编码序列(Codingsequence):在用于本文时，术语"编码序歹'J"意指直接规定其蛋白质产物的氨基酸序列的核苷酸序列。编码序列的边界一般由开放阅读框确定，它通常起始于ATG起始密码子或备选起始密码子诸如GTG和TTG。编码序列可以是DNA、cDNA或重组核苦酸序列。表达(Expression):术语"表达"包括多肽产生涉及的任一步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰，和分泌。表达载体(Expressionvector):术语"表达载体"在本文中定义为如下线状或环状DNA分子，它包含编码本发明多肽的多核苷酸，且其与有助于其表达的其它核苷酸可操作连接。宿主细胞(Hostcell):术语"宿主细胞"在用于本文时包括易于用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导、等等的任何细胞类型。修饰(Modification):术语"修饰"在本文中指分别对由下述序列组成的多肽所进行的任何化学修饰SEQIDNO:2的第1至556位氨基酸或SEQIDNO:37的第1至561位氨基酸；或SEQIDNO:5的第1至675位氨基酸或SEQIDNO:40的第1至565位氨基酸；或SEQIDNO:26的第1至556位氨基酸或SEQIDNO:24的第1至548位氨基酸或SEQIDNO:43的第1至523位氨基酸；以及对编码该多肽的DNA的基因操作。修饰可以是一个或多个氨基酸的取代、缺失和/或插入，以及一个或多个氨基酸侧链的替换。人工变体(Artificialvariant):在用于本文时，术语"人工变体，，意指具有葡糖淀粉酶活性的多肽，它是由表达下述经修饰的核苷酸序列的生物体产生的SEQIDNOS:l或3(cDNA)或SEQIDNOS:36或38(cDNA);或SEQIDNO:4或6(cDNA),或SEQIDNOS:39或41(cDNA);或SEQIDNOS:23或25(cDNA)或42(cDNA)。经修饰的核苦酸序列可经人工干预，通过对下列序列号中公开的核苷酸序列进行修饰而获得SEQIDNO:l或3，或SEQIDNO:36或38;或SEQIDNO:4或6,或SEQIDNO:39或41;或SEQIDNO:23或25或42。附图简述图1显示来自y^/ze/Zara的"、黑曲霉和7a/ara附jcesemeraom7的葡斗唐5定粉酶对rraw"esc/gw/ato分支淀粉的去分枝能力的比较。发明详述具有葡糖淀粉酶活性的多肽在第一个方面，本发明涉及具有如下氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列分别与SEQIDNO:2的第1至556位氨基酸，或SEQIDNO:37的第1至561位氨基酸；或SEQIDNO:5的第1至575位氨基酸或SEQIDNO:40的第1至565位氨基酸；或SEQIDNO:26的1-556位氨基酸或SEQIDNO:24的1-548位氨基酸或SEQIDNO:43的1_523位氨基酸(即成熟多肽)分别具有同一性。在一个实施方式中，氨基酸序列具有葡糖淀粉酶活性，且与SEQIDNO:2或SEQIDNO:37的成熟部分具有至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%、更优选至少96%、且甚至更优选至少97%、甚至更优选至少98%、且甚至更优选至少99%的同一性(以下"同源多肽，，)。在另一个实施方式中，氨基酸序列具有葡糖淀粉酶活性且与SEQIDNO:5或SEQIDNO:40的成熟部分具有至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%、更优选至少96%、且甚至更优选至少97%、且甚至更优选至少98%、且甚至更优选至少99%的同一性(以下"同源多肽")。在一个实施方式中，所述氨基酸序列具有葡糖淀粉酶活性且分别与SEQIDNO:26、24或43的成熟部分具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%、更优选至少96%、且甚至更优选至少97%、且甚至更优选至少98%、且甚至更优选至少99%的同一性(以下"同源多肽")。在一个优选的方面，同源多肽的氨基酸序列分别与SEQIDNO:2的第1至556位氨基酸，或SEQIDNO:37的第1至561位氨基酸；或SEQIDNO:5的第1至575位氨基酸或SEQIDNO:40的第1至565位氨基酸；或SEQIDNO:26的第1至556位氨基酸或SEQIDNO:24的第1至548位氨基酸或SEQIDNO:43的第1至523位氨基酸相差10个氨基酸，优选5个氨基酸、更优选4个氨基酸、甚至更优选3个氨基酸、最优选2个氨基酸、且甚至最优选1个氨基酸。本发明的多肽优选分别包含SEQIDNO:2或37;或SEQIDNO:5或40;或SEQIDNO:26、24或43的成熟氨基酸序列或其等位变体；其具有葡糖淀粉酶活性的片段，如，催化域。催化域在一个方面，本发明涉及分别包含SEQIDNO:2或37;或SEQIDNO:5或40;或SEQIDNO:26、24或43的氨基酸序列的催化区/域的多肽。7ame^c/"gw/ato葡糖淀粉酶的催化区/域位于SEQIDNO:2的第1至455位氨基酸或SEQIDNO:37中第1至460位氨基酸。在一个实施例中，可以认为该区分别包含SEQIDNO:2中第456至465位氨基酸或SEQIDNO:37中第461至470位氨基酸的接头区，或其部分。结合域分别被SEQIDNO:3中第1423至1725位的多核苷酸或SEQIDNO:36中第1774至2163位多芬酸或SEQIDNO:38中第1465至1737位的多核苷酸编码。尸ac/^&toyporapopyracea葡糖淀粉酶的催化区/域位于SEQIDNO:5的第1至475位氨基酸或SEQIDNO:40的第1至465位氨基酸。在一个实施方式中，该域被认为分别包含SEQIDNO:5中第476至484位氨基酸或SEQIDNO:40中第466至474位氨基酸的接头区，或其部分。结合域分别被SEQIDNO:6中第1420至1725位的多核苷酸或SEQIDNO:39中第1763至2182位多核苷酸或SEQIDNO:41的第1477至1749位的多核苷酸编码。大白桩菇葡糖淀粉酶的催化区/域分别位于SEQIDNO:26的第1至451位氨基酸或SEQIDNO:24的第1至455位氨基酸或SEQIDNO:43的第1至418位氨基酸。在一个实施方式中，可认为该域分别包含SEQIDNO:26的第452至461位氨基酸或SEQIDNO:24的第456至466位氨基酸或SEQIDNO:43的第419至429位氨基酸的接头区，或其部分。结合域(CBM)分别被SEQIDNO:25的第1438至1719位多核苷酸或SEQIDNO:23的第1854至2249位多核苷酸或SEQIDNO:42的第1399至1620位多核苷酸编码。本发明的一个优选实施方式涉及这样的催化域，其分别与下述序列具有至少60。/。的同一性、优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%、更优选至少96%、且甚至更优选至少97%、且甚至更优选至少98%、且甚至更优选至少99%、尤其是至少100%的同一性SEQIDNO:2的第1至455位氨基酸或SEQIDNO:37的第1至460位氨基酸(栓菌属)；或SEQIDNO:5的第1至475位氨基酸或SEQIDNO:40的第1至465位氨基酸(尸flc/zyy^to^ora);或SEQIDNO:26的第1至451位氨基酸或SEQIDNO:24的第l至455位氨基酸或SEQIDNO:43的第1至418位氨基酸(白桩菇属)，且所述催化域具有葡糖淀粉酶活性(以下"同源多肽")。在一个优选的方面，同源催化区域的氨基酸序列分别与SEQIDNO:2的第1至455位氨基酸或SEQIDNO:37的第1至460位氨基酸(栓菌属)；或SEQIDNO:5的第1至475位氨基酸或SEQIDNO:40的第1至465位氨基酸CPac/73^Kay/wra)或SEQIDNO:26的第1至451位氨基酸或SEQIDNO:24的第1至455位氨基酸或SEQIDNO:43的第1至418位氨基酸(白桩菇属)相差10个氨基酸、优选5个氨基酸、更优选4个氨基酸、甚至更优选3个氨基酸、最优选2个氨基酸、且甚至最优选l个氨基酸。结合域在另一个方面，本发明涉及具有糖结合亲和性，优选淀粉结合亲和性的多肽。栓菌属葡糖淀粉酶中的结合域位于SEQIDNO:2的第466至556位氨基酸且被SEQIDNO:3的第1420至1725位的多核苷酸所编码，或位于SEQIDNO:37的第471至561位氨基酸且被SEQIDNO:38的第1465至1737位多核芬酸所编码。Pac^y&to^ora葡糖淀粉酶中的结合域位于SEQIDNO:5的第485至575位氨基酸CPac/^Ayto^ora)且被SEQIDNO:6的第1423至1725位多核苷酸所编码，或位于SEQIDNO:40的第475至565位氨基酸且^皮SEQIDNO:41的第1477至1749位多核苦酸所编码。白桩菇属葡糖淀粉酶中的结合域分别位于SEQIDNO:26的第463至556位氨基酸或SEQIDNO:24的第467至548位氨基酸或SEQIDNO:43的第430至523位氨基酸，且分别被SEQIDNO:23的第1854至2249位多核苷酸或SEQIDNO:25的第1438至1719位多核苷酸或SEQIDNO:42的第1339至1620位多核香酸所编码。因此，在这个方面，本发明涉及选自下组的具有糖结合亲和性的多肽(a)i)包含下述氨基酸序列的多肽，该序列分别与SEQIDNO:2的第466至556位氨基酸或SEQIDNO:37的第471至561位氨基酸具有至少60%的同一性;ii)包含下述氨基酸序列的多肽，该序列分别与SEQIDNO:5的第485至575位氨基酸或SEQIDNO:40的第475至565位氨基酸具有至少60%的同一性；iii)包含下述氨基酸序列的多肽，该序列分别与SEQIDNO:26的第463至556位氨基酸或SEQIDNO:24的第467至548位氨基酸或SEQIDNO:43的第430至523位氨基酸至少60%的同一性；(b)由下述核苷酸序列编码的多肽，该核苷酸序列在低严紧条件下与选自下列的多核苷酸探针杂交(i)SEQIDNO:3的第1420至1725位核香酸或SEQIDNO:38的第1465至1737位核苷酸的各自的互补链；(ii)SEQIDNO:6的第1423至1725位核香酸或SEQIDNO:41的第1477至1749位核苷酸的各自的互补链；(iii)SEQIDNO:25的第1438至1719位核香酸或SEQIDNO:23的第1854至2249位核苷S交或SEQIDNO:42的第1339至1620位核苷酸的各自的互补链；(c)(a)或(b)的具有糖结合亲和性的片段。在一个优选的实施方式中，所述糖结合亲和性是淀粉结合亲和性。在一个优选的实施方式中，本发明涉及具有糖结合亲和性的多肽，该多肽分别与SEQIDNO:2的第466至556位氨基酸或SEQIDNO:37的第471至561位氨基酸(栓菌属)；或分别与SEQIDNO:5的第485至575位氨基酸或SEQIDNO:40的第475至565位氨基酸(尸ac/zj^yto;wra);或分别与SEQIDNO:26的第463至556位氨基酸或SEQIDNO:24的第467至548位氨基酸或SEQIDNO:43的第4:30至5"位氨基酸(白桩菇属)具有至少60%的同一性、优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、甚至更优选至少90%、最优选至少95%、更优选至少96%、且甚至更优选至少97%、且甚至更优选至少98%、且甚至更优选至少99%、尤其是至少100%的同一性。在一个优选的方面，同源结合域的氨基酸序列具有这样的氨基酸序列，其分别与SEQIDNO:2的第466至556位氨基酸或SEQIDNO:37的第471至561位氨基酸(rram&esc/"gw/ato);或分别与SEQIDNO:5的第485至575位氨基酸或SEQIDNO:40的第475至565位氨基酸CP"c/^^to^ora);或分别与SEQIDNO:26的第463至556位氨基酸或SEQIDNO:24的第467至548位氨基酸或SEQIDNO:43的第430至523位氨基酸(白桩菇属)相差10个氨基酸、优选5个氨基酸、更优选4个氨基酸、甚至更优选3个氨基酸、最优选2个氨基酸、且甚至最优选1个氨基酸。在另一个实施例中，本发明涉及选自下列的具有糖结合亲和性的多肽(a)由下述核苷酸序列所编码的多肽，该核苷酸序列在低严紧条件下、优选中等严紧条件、更优选高严紧条件下与选自下列的多核苷酸探针杂交(i)SEQIDNO:3的第1420至1725位核苷酸或SEQIDNO:38的第1465至1737位核苷酸的各自的互补链；(ii)SEQIDNO:6的第1423至1725位核苷酸或SEQIDNO:41的第1477至1749位核苷酸的各自的互补^T连；(iii)SEQIDNO:25的第1438至1719位核苦酸或SEQIDNO:23的第1854至2249位核苷酸或SEQIDNO:42的第1339至1620位核苷酸的各自的互补链；(b)(a)的具有糖结合亲和性的片段。本发明还涉及具有糖结合亲和性的多肽，其中该多肽是人工变体，包含下述氨基酸序列，该序列分别与SEQIDNO:2的第466至556位氨基酸或SEQIDNO:37的第471至561位氨基酸(栓菌属)；或分别与SEQIDNO:5的第485至575位氨基酸或SEQIDNO:40的第475至565位氨基酸(尸flc/^&towora);或分别与SEQIDNO:26的第463至556位氨基酸或SEQIDNO:24的第467至548位氨基酸或SEQIDNO:43的第430至523位氨基酸(白桩菇属)相比，至少有一个氨基酸的取代、缺失和/或插入。本发明还涉及具有糖结合亲和性的多肽，其中该多肽是包含下述氨基酸序列的人工变体，该序列分别与下列多核苷酸序列的糖结合域编码部分编码的氨基酸序列相比，至少有一个氨基酸的取代、缺失和/或插入SEQIDNO:3中第1420至1725位或SEQIDNO:38中第1465至1737位的多核苦酸序列、或SEQIDNO:6的第1423至1725位或SEQIDNO:41的第1477至1749位的多核苷酸序歹'J、或SEQIDNO:25的第1438至1719位或SEQIDNO:23的第1854至2249位或SEQIDNO:42的第1339至1620位的多核苷酸序列。杂合体(hybrids)本发明的葡糖淀粉酶或催化区域可通过接头序列或直接与一个或多个外源结合域(也被称为结合模块(bindingmodules,CBM))相连接。"外源"(foreign)结合域是非来自本发明所述的野生型葡糖淀粉酶的结合域。结合域优选是糖结合域(即具有结合糖的亲和性)，尤其是淀粉结合域或纤維素结合域。结合域优选来自真菌或细菌。特别考虑的淀粉结合域的例子由WO2005/003311所4皮露，这里并入所述文献作为参考。在一个优选实施方式中，本发明的葡糖淀粉酶中的接头被替换为更稳定的接头，也就是说，比该亲本(parent)接头更不易于剪切的接头。这是为了避免了结合域被剪切掉。特别考虑的稳定接头包含川地曲霉04^e/^7/^TTTTTTAAATSTSKATTSSSSSSAAATTSSS(SEQIDNO:22)因此，在本发明一个优选的实施方式中，本发明涉及一种杂合葡糖淀粉酶，其具有分别由SEQIDNO:2或37所示的氨基酸序列，其中分别位于SEQIDNO:2中第456至465位氨基酸或SEQIDNO:37中461至470位氨基酸的天然接头或其部分被替换为SEQIDNO:22所示的川地曲霉接头。因此，在另一个优选的实施方式中，本发明涉及一种杂合葡糖淀粉酶，其具有分别由SEQIDNO:5或40所示的氨基酸序列，其中分别位于SEQIDNO:5中第476至484位氨基酸或SEQIDNO:40中466至474位氨基酸的天然接头或其部分被替换为SEQIDNO:22所示的川地曲霉接头。因此，在另一个优选的实施方式中，本发明涉及一种杂合葡糖淀粉酶，其具有分別由SEQIDNO:26或24所示的氨基酸序列，其中分别位于SEQIDNO:26中第452至462位氨基酸或SEQIDNO:24中456至466位氨基酸或SEQIDNO:24中419至429位氨基酸的天然接头或其部分^皮替换为SEQIDNO:22所示的川地曲霉4妄头。因此，本发明还涉及这样的杂交体，其由下列组分组成本发明的葡糖淀粉酶或具有葡糖淀粉酶活性的本发明的催化域，与合适的接头(例如川地曲霉4妻头)；以及一个或多个糖结合域融合；所述糖结合域例如由WO2005/003311的第5页、第8页的第30、12行所披露的糖结合模块(CBM),这里并入所述文献作为参考。杂交在另一个方面，本发明涉及被下述多核苷酸所编码的具有葡糖淀粉酶活性的多肽，所述多核苷酸(i)在至少低严紧条件下，优选中等严紧条件、更优选中等-高严紧条件、甚至更优选高严紧条件、且最优选很高严紧条件下，与分别具有SEQIDNO:l的第55至2166位核苷酸或SEQIDNO:36的第55至2166位核苷酸(栓菌属基因组DNA)的核苷酸序列杂交；或(ii)在至少中等严紧条件、优选中等-高严紧条件、更优选高严紧度条件、更优选很高严紧条件下分别与SEQIDNO:3的第55至1725位核苷酸或SEQIDNO:38的第55至1737位核苷酸所含cDNA序列的核苷酸序歹'U栓菌属cDNA)杂交；或(iii)(i)或(ii)的子序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链(J.Sambrook，E.F.Fritsch禾口T.Maniatis,1989,《A/o/ecw/arC7ow/"g,^丄a6ora^ryA/iawwa/》,第二版，ColdSpringHarbor,NewYork)。SEQIDNOS:l或3，或SEQIDNOS:36或38(栓菌属)的子序列包含有至少100个连续的核苷酸或优选至少200个连续核苷酸。另外，子序列可以编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽片段。本发明也涉及被下述多核苷酸所编码的具有葡糖淀粉酶活性的分离多肽，所述多核苦酸(i)在至少低严紧条件下，优选中等严紧条件、更优选中等-高严紧条件、甚至更优选高严紧度条件、且最优选很高严紧条件下分别与具有SEQIDNO:4的第55至2189位核苷酸或SEQIDNO:39的第55至2182位核苷酸(尸"c/7j^yto^ora基因组DNA)杂交；或(ii)在至少中等严紧条件、优选中等-高严紧条件、更优选高严紧度条件、更优选很高严紧条件下分别与具有SEQIDNO:6的第55至1725位核苷酸或SEQIDNO:41的第55至1749位核苷酸所含cDNA序列的核苷S交序列0Pac/7j^yto^oracDNA)杂交；或(iii)(i)或(ii)的子序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链。本发明还涉及由下述多核苷酸编码的具有葡糖淀粉酶活性的分离多肽，所述多核苷酸(i)在至少低严紧条件下，优选中等严紧条件、更优选中等—高严紧条件、甚至更优选高严紧度条件、且最优选很高严紧条件下，与具有SEQIDNO:23的第117至2249位核苦酸的核苷酸序列(白桩菇属基因组DNA)杂交；或(ii)在至少低严紧条件下，优选中等、更优选中等-高严紧条件、更优选高严紧条件、更优选很高严紧条件下分别与具有SEQIDNO:25中第52至1719位核苷酸或SEQIDNO:42中第52至1620位核苷酸中所含的cDNA序列的核苷酸序列(白桩菇属cDNA)杂交；或(iii)(i)或(ii)的子序列；或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链。可以使用SEQIDNO:l、3、36或38各自的核苷酸序列，或其子序列，或SEQIDNO:4、6、39或41各自的核苦酸序列，或其子序列，或SEQIDNO:23、25或42的各自的核苷酸序列，或其子序列，以及SEQIDNO:2或37各自的氨基酸序列，或其片段，或SEQIDNO:5或40各自的氨基酸序列，或其片段，或SEQIDNO:26、24或43各自的氨基酸序列，或其片段，根据本领域熟知的方法来设计核酸探针，来从不同种属的菌抹识别和克隆出编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽的DNA。特别地，可以^吏用这样的纟笨针遵循标准Southern印迹程序与目标种或属的基因组或cDNA杂交，从而鉴定和分离其中的相应基因。这些探针可以比完整序列短得多，但是长度应当是至少14个、优选至少25个、更优选至少35个、且最优选至少70个核苷酸。然而优选核酸探针的长度是至少100个核苷酸。例如，核酸探针的长度可以是至少200个核苷酸、优选至少300个核苷酸、更优选至少400个核苷酸、或最优选至少500个核苷酸。可使用更长的探针，例如长度是至少600核苦酸、至少优选至少700个核苷酸、更优选至少800个核苷酸、或最优选至少900个核苷酸的核酸探针。DNA和RNA探针都可使用。通常将探针进行标记，用于检测相应的基因(例如用32P、3H、35S、生物素、或亲和素)。本发明涵盖这些探针。因此，/人这样的其它生物体制备的基因组DNA或cDNA文库中可以筛选这样的DNA:其与上述探针发生杂交，且编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。来自这样的其它生物体的基因组或其它DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离技术来分离。可将来自所述文库的DNA或分离的DNA转移到并固定在硝酸纤维素或其它适宜载体材料上。为了鉴定分别与SEQIDNO:l、3、36或38或其子序列同源，或分别与SEQIDNO:4、6、39或41或其子序列同源，或分别与SEQIDNO:23、25或42或其子序列同源的克隆或DNA，将载体材料用于Southern印迹。对本发明而言，"杂交"是指在很低至很高的严紧条件下核苷酸序列与标记的核酸探针发生杂交，其中核酸探针分别对应于SEQIDNO:l、3、36或38，或分别对应于SEQIDNO:4、6、39或41,或分别对应于SEQIDNO:23、25或42,其互补链，或其子序列。在这些条件下与核酸探针发生杂交的分子可用X射线胶片检测。在一个优选实施方式中，所述核酸4笨4十是SEQIDNO:l的第55至2166位核苷酸或SEQIDNO:36的第55至2166位核芬酸，或SEQIDNO:3的第1至1725位核苷酸或SEQIDNO:38的第55至1737位核苷酸(栓菌属cDNA)。在一个优选实施方式中，核酸探针是SEQIDNO:4第55至2186位核苷酸或SEQIDNO:39第55至2182位核苷酸或SEQIDNO:6第1至1725位核苦酸或SEQIDNO:41第55至1749位核苷酸(尸ac/^^to^ora属cDNA)。在一个优选实施方式中，所述核酸探针是SEQIDNO:23第117至2249位核苷酸或SEQIDNO:25第52至1719位核苷酸(白桩菇属cDNA)或SEQIDNO:42第52至1620位核苦酸(白桩菇属cDNA)。在另一个优选实施方式中，所述核酸探针是编码催化区的多核苷酸序列，所述催化区为SEQIDNO:2第1至455位氨基酸之间或SEQIDNO:37第1至460位氨基酸之间(栓菌属)、或SEQIDNO:5第1至475位氨基酸之间或SEQIDNO:40第1至465位氨基酸之间CP"c/7^yto^ora属)或SEQIDNO:24第1至455位氨基酸之间或SEQIDNO:26第1至451位氨基酸之间或SEQIDNO:43第1至418位氨基酸之间的催化区(白桩菇属)。在另一个优选的方面，本发明涉及编码结合域的核酸探针，所述结合域是分别是SEQIDNO:2的第466至556位氨基酸或SEQIDNO:37的第471至561位氨基酸，或分别是SEQIDNO:5的第485至575位氨基酸或SEQIDNO:40的第475至565位氨基酸，或分别编码SEQIDNO:26的第463至556位氨基酸或SEQIDNO:24的第467至548位氨基酸或SEQIDNO:43的第430至523位氨基酸。在另一个优选的方面，核酸探针分别是SEQIDNO:l、3、36或39(栓菌属)的成熟多肽编码区。在另一个优选的方面，核酸探针分别是SEQIDNO:4、6、39或41(尸ac/2j^yto5/ora属)的成熟多肽编码区。在另一个优选的方面，核酸探针分别是SEQIDNO:23、25或42(白桩菇属)的成熟多肽编码区。在另一个优选的方面，核酸探针是分别在质粒pHUda595和pHUda594中的序列的部分，分别编码本发明的质粒pHUda595和pHUda594的成熟多肽，这两个质粒分别包含在大肠杆菌DSM17106和大肠杆菌DSM17105内，编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。对于长度为至少100个核苷酸的长探针来说，很低至很高的严紧条件定义为遵循标准Southern印迹程序，于42°C，在5XSSPE、0.3%SDS、200吗/ml经剪切且经变性的鲑精DNA、及25%曱酰胺(低严紧度)、35%曱酰胺(中等和中等-高严紧度)、或50%曱酰胺(高和很高严紧度)中进行最佳12-24小时的预杂交和杂交。对于长度为至少100个核苷酸的长探针来说，最后优选在至少50。C(低严紧度)、更优选至少55。C(中等严紧度)、更优选至少6(TC(中等-高严紧度)、更优选至少65。C(高严紧度)、最优选至少7(TC(很高严紧度)条件下，将载体材料用2xSSC、0.2%SDS清洗3次，每次15分钟。对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针来说，严紧条件定义为遵循标准Southern印迹程序，在比根据Bolton和McCarthy(1962，TVoceed/wgso/AeiVa/7'o"a/Jcacfem_y。/5We"casUSA48:1390)的"H"算方法算得的Tm值低大约5。C至大约10。C的温度，在0.9MNaCl、0.09MTris-HClpH7.6、6mMEDTA、0.5%NP-40、IXDenhardt氏溶液、1mM焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠、0.1mMATP、和0.2mg/ml酵母RNA中进4亍预杂交、杂交、和杂交后清洗。对于长度为大约15个核苷酸至大约70个核苷酸的短探针来说，在比Tm计算值低大约5。C至10。C的温度将载体材料用6XSCC力口0.1%SDS清洗l次15分钟，然后用6XSSC在比Tm计算值低5。C至10。C的温度下清洗两次，每次15分钟。在含盐的杂交条件下，有效Tm控制着成功的杂交所要求的探针与滤膜上结合的DNA之间的同一性程度。可以用下面的公式来有效Tm,以确定两个DNA在不同严紧度条件下杂交所需的同一性程度。有效Tm=81.5+16.6(logM[Na+])+0.41(%G+C)—0,72(%曱酰胺)SEQIDN0:1的G+C含量或SEQIDNO:l的第55至2166位核苦酸的G+C含量是60.5%。SEQIDNO:3(cDNA)的G+C含量或SEQIDNO:3的第55至1725位核芬酸的G+C含量是62.3%。SEQIDNO:4的G+C含量或SEQIDNO:4的第55至2189位核苷酸的G十C含量是60.7%。SEQIDNO:6(cDNA)的G+C含量或SEQIDNO:6的第55至1725位核苷酸的G+C含量是63.7%。对于中等严紧度，曱酰胺浓度为35%,5xSSPE的Na+浓度为0.75M。对这些值使用这个公式，有效Tm是79.0。C。另一种重要的关系是两个DNA的每1%的错配降低1.4'C的TJ直。为确定在中等严紧度条件下两个DNA在42°C杂交所需的同一性程度，使用下面的公式%同源性=100-[(有效Tm-杂交温度)/1.4]对这些值应用本公式，在中等严紧度条件下两个DNA在42°C杂交所需的同一性程度为100—[(79.0-42)/1.4]=51%。变体在另一个方面，本发明涉及人工变体，其分别在SEQIDNOS:2、5、24、26、37、40和43或其成熟多肽中包含一个或多个氨基酸的保守if又代、缺失、和/或插入。优选的是，氨基酸改变的性质是次要的，即不会明显影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；通常是1个至大约30个氨基酸的小段缺失；小段氨基或羧基末端延伸，诸如氨基末端的曱硫氨酸残基；可达大约20-25个残基的小段接头肽；或通过改变净电荷或另一功能而易于纯化的小段延伸，诸如多组氨酸序列段、抗原性表位、或结合域。保守取代的例子在以下各组内碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变特异活性的氨基酸取代是本领域已知的，例如H.Neurath和R丄.Hill在《TheProteins》中所述(1979,AcademicPress,NewYork)。最常发生的取代是Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。除20种标准氨基酸之外，也可用非标准氨基酸(诸如4-羟基脯氨酸、6一AL曱基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸、和a-甲基丝氨酸)来取代野生型多肽的氨基酸残基。可用有限数目的非保守氨基酸、非由遗传密码编码的氨基酸、和非天然氨基酸来取代氨基酸残基。"非天然氨基酸"在蛋白质合成后受到修饰，和/或在它们的侧链上具有与标准氨基酸不同的化学结构。可化学合成非天然氨基酸，优选的是可通过商业途径购买，非天然氨基酸包括。底咬酸、p塞唑烷羧酸、脱氬脯氨酸、3-和4-曱基脯氨酸、和3,3-二甲基脯氨酸。或者，氨基酸改变具有这样的性质，使得多肽的物理化学特性被改变。例如，氨基酸改变可提高多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最佳pH等等。亲本多肽中的关键氨基酸可根据本领域已知程序来确定，诸如定点诱变或丙氨酸扫描i秀变(Cunningham和Wells,1989,Sc/e"ce244:1081-1085)。在后一种技术中，在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并测试所得到的突变分子的生物学活性(即葡糖淀粉酶活性)以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。也可参见Hilton等人，1996,Ao/.Ozem.271:4699-4708。也可以结合假定的接触位点氨基酸的突变通过诸如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记等技术的测定结构，对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。例如参见deVos等人，1992,5We"ce255:306-312;Smith等人，1992，/M/.肠/.224:899-904;Wlodaver等人，1992，i^E^S丄e".309:59-64。也可从与本发明多肽相关的多肽的同一性分析来推断关键氨基酸的身份。单个或多个氨基酸的耳又代和检测可以如下进行使用已知的诱变、重组、和/或改组(shuffling)方法，随后进行相关筛选程序，诸如Reidhaar-Olson和Sauer，1988，5We脏241:53-57;Bowie和Sauer，1989，Prac.胸/.如d.5W.USA86:2152-2156;WO95/17413;或WO95/22625所公开的。可使用的其它方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如Lowman等人，1991，Biochem.30:10832-10837;美国专利号5,223,409;WO92/06204)、和定区"i秀变(region-directedmutagenesis)(Derbyshire等人，1986，(7e"e46:145;Ner等人，1988,潔J7:127)。可将诱变/改组方法与高通量、自动筛选方法相结合，用于检测由宿主细胞表达的克隆的、经诱变的多肽的活性。可使用本领域的标准方法从宿主细胞回收编码活性多肽的经诱变DNA分子并快速测序。这些方法可快速测定目的多肽中单个氨基酸残基的重要性，并可应用于结构未知的多肽。SEQIDNO:2的第1至556位或SEQIDNO:37第1至561位(栓菌属葡糖淀粉酶)；或SEQIDNO:5第1至575位或SEQIDNO:40第1至565位(尸ac/zyAyto^ora属葡糖淀粉酶)或SEQIDNO:26第1至556位或SEQIDNO:24第1至548位或SEQIDNO:43第1至523位(白桩菇属葡糖淀粉酶)中，各自的氨基酸取代、缺失、和/或插入的总数为10个、优选9个、更优选8个、更优选7个、更优选至多6个、更优选至多5个、更优选4个、甚至更优选3个、最优选2个、且甚至最优选l个。具有葡糖淀粉酶活性的多肽的来源可从任何属的微生物中获得本发明的多肽。对本发明来说，术语"从...获得"在本文与指定的来源联用时，应当意指由核苷酸序列编码的多肽是由该来源产生的，或是来自于该来源的核苷酸序列已经插入其中的菌抹产生的。在一个优选的方面，从指定来源获得的多肽分泌到细胞外。在一个优选实施方式中，本发明的葡糖淀粉酶来自担子菌纲(5似Womycetev)。在一个更优选的实施方式中，本发明的葡糖淀粉酶来自栓菌属菌4朱，更优选来自物种Trawefesc/"gw/Gto的菌抹，或保藏的克隆DSM17106，或Pac/zj^ytos7ora属菌才朱，更4尤选物种尸ac^y^vtospora/7a/_yracea的菌林，或保藏的克隆DSM17105，或白桩菇属菌林，更优选是物种大白桩菇的菌才朱。应当理解，对于上述物种，不管已知的种名是什么，本发明既包括完全阶段(perfectstate)和不完全阶段(imperfectstate),还包括其它分类学等价物，例如无性型。本领域技术人员能容易地识别适当等价物的身份。rrawW^c/gw/ato菌4朱于1995至1997年在津巴布韦采集。户ac/7j^ytoy/wrapap,acea菌林于1995至1997年在津巴布韦采集。大白桩菇菌抹于2003年在丹麦采集。此外，利用上述探针，可从其它来源，包括从自然界(例如土壤、堆肥、水等)分离的微生物中鉴定和获得这些多肽。从自然生境中分离微生物的技术在本领域技术是众所周知的。然后可通过类似的筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库来获得多核苦酸。一旦用探针检测出编码多肽的多核苦酸序列，就可通过本领域普通技术人员所熟知的技术(例如参见Sambrook等人，1989,同上)分离或克隆此多核苷酸。本发明的多肽还包括融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一多肽融合在所述多肽或其片段的N-末端或C-末端。可通过将编码另一多肽的核苷酸序列(或其部分)与本发明的核苷酸序列(或其部分)融合来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术在本领域是已知的，包括如此连接编码多肽的编码序列，使得它们共阅读框(inframe)且融合多肽的表达受相同的启动子和终止子的控制。多核苷酸本发明还涉及具有编码本发明多肽的核苷酸序列的分离多核苷酸。在一个优选的方面，所述核香酸序列分别为SEQIDNO:l、3、4、6、23、25、36、38、39、41或42中任一序列所示。在另一个更优选的方面，核苦酸序列是质粒pHuda595或pHuda594中所含的序列，这些质粒分别包含在大肠杆菌DSM17106和大肠杆菌DSM17105中。在另一个优选的方面，核苦酸序列是SEQIDNO:l、3、4、6、23、25、36、38、39、41或42的各自的成熟多肽编码区。本发明还涵盖这样的核苷酸序列，其编码分别具有SEQIDNO:2、5、24、26、37、40或43的任一序列或其成熟多肽的氨基酸序列的多肽，且其因遗传密码的筒并性而分别不同于SEQIDNO:l、3、4、6、23、25、36、38、39、41或42。本发明还涉及SEQIDNO:l、3、4、6、23、25、36、38、39、41或42各自的子序列，所述子序列分别编码SEQIDNO:2、5、24、26、37、40或43的具有葡糖淀粉酶活性的片段。本发明还涉及突变多核苦酸，其在SEQIDNO:l、3、4、6、23、25、36、38、39、41或42中任一序列的各自的成熟多肽编码序列中包含至少一处突变，其中突变核苷酸序列编码分别由下列序列组成的多肽SEQIDNO:2的第1至556位氨基酸、SEQIDNO:5的第1至575位氨基酸、SEQIDNO:24的第1至548位氨基酸、SEQIDNO:26的第1至556位氨基酸、SEQIDNO:37的第1至561位氨基酸、SEQIDNO:40的第1至565位氨基酸或SEQIDNO:43的第1至523位氨基酸。用于分离或克隆编码多肽的多核苷酸的技术在本领域是已知的，包括从基因组DNA分离，从cDNA制备，或者两者的组合。例如，通过利用众结构特征的克隆DNA片段，可以实现从这些基因组DNA克隆本发明的多核苷酸序列。例如参见Innis等人，1990，《PC7:爿toMef/w^a/W^，//caf/ow》，AcademicPress,NewYork。还可以-使用其它核酸扩增禾呈序，诸如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)、和基于核苷酸序列的扩增(NASBA)。可从栓菌属菌抹、Pac/z;^yto^xra属菌抹、白桩菇属菌抹或者另外的或相关的生物体克隆多核苷酸，因此它可以是例如核苦酸序列中多肽编码区的等位或种间变体。本发明还涉及具有如下核苷酸序列的多核苷酸，该核苷酸序列与下述的成熟多肽编码序列SEQIDNO:l(即55至2166位核苷酸)，或SEQIDNO:3(即55至1725位核苦酸)，或SEQIDNO:4(即55至2182位核苷酸)，或SEQIDNO:6(即55至17254立核芬酸)，或SEQIDNO:25(即52至1719位核香酸)，或SEQIDNO:38(即55至1737位核香酸)，或SEQIDNO:41(即55至1749位核苷酸)，或SEQIDNO:42(即55至1620位核香酸)具有至少60%、优选至少65%、更优选至少70%、更优选至少75%、更优选至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%、甚至更优选至少96%、甚至更优选至少97%、甚至更优选至少98%、且最优选至少99%的同一性，该多核苷酸编码活性多肽。为了合成与本发明多肽基本上类似的多肽，可能必需修饰编码多肽的核芬酸序列。术语与某多肽"基本上类似"是指该多肽的非天然形式。这些多比活、热稳定性、最佳pH等方面不同的人工变体。变体序列的构建可以通过下列方式在SEQIDNO:l、3、4、6、23、25、36、38、39、41或42各自的成熟多肽编码区所示的核苷酸序列的基础上构建，例如其子序列；和/或通过引入这样的核苷酸取代其不会导致核苷酸序列所编码的多肽具有另一种氨基酸序列、而是与要用来生产酶的宿主生物体的密码子用法相一致；或者通过引入可导致不同氨基酸序列的核苷酸取代。对于核苷酸取代的一般性描述可参见例如Ford等人，1991,尸rafe/"五x;mw/o"P鹏yca"ow2:95-107。对本领域技术人员而言，显而易见的是这些种取代可在分子功能的关键区域之外进行并且仍然可得到活性多肽。可根据本领域的已知程序来鉴别对于由本发明的分离多核苷酸所编码的多肽的活性来说至关重要的因此优选不进行取代的氨基酸残基，诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如参见Cunningham和Wells，1989，5We"ce244:1081-1085)。在后一种技术中，在分子中每一带正电荷残基处引入突变，然后对得到的突变分子测试葡糖淀粉酶活性以鉴定对分子活性至关重要的氨基酸残基。底物-酶相互作用位点也可通过三维结构分析来确定，其中三维结构可由诸如核磁共振分析、晶体学、或光亲和标记等纟支术来测定(例如参见deVos等人，1992,5We"ce255:306-312;Smith等人，1992,J冊r"a/o/Mo/ecM/ar历o/ogy224:899-904;Wlodaver等人，1992，F五5S丄e"era309:59-64)。本发明还涉及如下所述的编码本发明多肽的分离多核苷酸(i)在低严紧条件、更优选中等严紧条件、更优选中等-高严紧条件、甚至更优选高严紧度条件、且最优选很高严紧条件下分别与SEQIDNO:l的第55至2166位核苷酸或与SEQIDNO:36的第55至2166位核苷酸杂交；或(ii)在中等严紧条件、更优选中等-高严紧条件、甚至更优选高严紧度条件、且最优选很高严紧条件下分别与SEQIDNO:3的第55至1725位核苷酸或与SEQIDNO:38的第55至1737位核苷酸中所含的cDNA序列杂交；或(iii)，(i)或(ii)的互补链；或其等位变体和子序列(Sambrook等人，1989,同上)，如本文定义的。本发明还涉及如下所述的编码本发明多肽的分离多核苷酸(i)在低严紧条件、更优选中等严紧条件、更优选中等-高严紧条件、甚至更优选高严紧度条件、且最优选很高严紧条件下分别与SEQIDNO:4的第55至2189位核苷酸或SEQIDNO:39的第55至2182位核苷酸杂交；或(ii)在中等严紧条件、更优选中等-高严紧条件、甚至更优选高严紧度条件、且最优选很高严紧条件下分别与SEQIDNO:6的第55至1725位核苷酸或与SEQIDNO:41的第55至1749位核苦酸中所含的cDNA序列杂交;或(iii)(i)或(ii)的互补链；或其等位变体和子序列(Sambrook等人，1989,同上)，如本文所定义的。本发明还涉及如下所述的编码本发明多肽的分离多核苦酸(i)在低严紧条件、更优选中等严紧条件、更优选中等-高严紧条件、甚至更优选高严紧度条件、且最优选很高严紧条件下分别与SEQIDNO:23的第117至2249位核苷酸杂交；或(ii)在低严紧条件、优选中等严紧条件、更优选中等-高严紧条件、甚至更优选高严紧度条件、且最优选很高严紧条件下分别与SEQIDNO:25的第52至1719位核香酸或与SEQIDNO:42的第52至1620位核苦酸中所含的cDNA序列杂交；或(iii)(i)或(ii)的互补链；或其等位变体和子序列(Sambrook等人，1989,同上)，如本文定义的。本发明还涉及如下获得的分离多核苷酸(a)在低、中等、中等-高、高、或很高严紧条件下将DNA群体分别与(i)SEQIDNO:l的第55至2166位核苷酸或与SEQIDNO:36的第55至2166位核苦酸杂交；或(ii)在中等、中等-高、高或很高严紧条件下将DNA群体分别与SEQIDNO:3的第55至1725位核普酸或与SEQIDNO:38的第55至1737位核苦酸中所含的cDNA序列杂交；或(iii)(i)或(ii)的互补链；并(b)分离发生杂交的多核苷酸；该多核苷酸编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。本发明还涉及如下获得的分离多核苷酸(a)在低、中等、中等-高、高、或很高严紧条件下将DNA群体分别与(i)SEQIDNO:4的第55至2189位核苷酸或与SEQIDNO:39的第55至2182位核苷酸杂交；或(ii)在中等、中等-高、高或很高严紧条件下将DNA群体分别与SEQIDNO:6的第55至1725位核香酸或与SEQIDNO:41的第55至1749位核苷酸中所含的cDNA序列杂交；或(iii)(i)或(ii)的互补链；并(b)分离发生杂交的多核苷酸；该多核苷酸编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。本发明还涉及如下获得的分离多核苷酸(a)在低、中等、中等-高、高、或4艮高严紧条件下将DNA群体分别与(i)SEQIDNO:23的第117至2249位核苷酸杂交；或(ii)在中等、中等-高、高或很高严紧条件下将DNA群体分别与SEQIDNO:25的第52至1719位核苷酸或与SEQIDNO:42的第52至16M位核苷酸中所含的cDNA序列杂交；或(iii)(i)或(ii)的互补链；并(b)分离发生杂交的多核苷酸；该多核苷酸编码具有葡糖淀粉酶活性的多肽。核酸构建体本发明还涉及包含与一种或多种控制序列可操作连接的本发明的分离多核苷酸的核酸构建体，所述控制序列在适当宿主细胞中在与控制序列相容的条件下指导编码序列的表达。可利用多种方法操作编码本发明多肽的分离多核苷酸以提供多肽的表达。根据表达载体的不同，可能希望或必需在将多核苷酸序列插入载体之前对其进行操作。利用重组DNA方法修饰多核苷酸序列的技术是为本领域众所周知的。控制序列可以是适当的启动子序列，即受到宿主细胞识别来表达编码本发明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。启动子序列包含调节多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在所选宿主细胞中表现出转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合的启动子，而且可从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因中获得。用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体转录的适当启动子的实例是从米曲霉TAKA淀粉酶、i/z/zomMcorm/e/^/天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉酸稳定a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、7/n'zo附Mcorm/e/ze/脂肪酶、米曲霉石成性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异片勾酵、冲勾巢曲零(/15>^^产^7'//">51w/ciM/a;M)乙醜胺酵、尸wi^r/w附ve"e""/w/w葡^唐淀4分酶(WO00/56900)、vewe"a^附Daria(WO00/56900)、wwewa^mQuinn(WO00/56900)、尖孑包镰孑包(Fwsan'Mmcocj^ponw)月夷蛋白酶才羊蛋白酶(WO96/00787)、7Hc/zo^/ermfifreesd(3-葡糖苦酶、7Hc/zoofermaree化/纤维二糖水解酶I、7Hc/w&rma内切葡聚糖酶I、7Hc/zot/erma内切葡聚糖酶II、7Hc/zcxie;7m2reese/内切葡聚糖酶III、7Hc/zocferwaese/内切葡聚糖酶IV、7Hc/zO(iem7aese/内切葡聚糖酶V、THc^ocfermareese/木^1沣唐酶I、7Hc/zofifer附a木聚4唐酶II、7Hc/70cferwa卩-木冲唐苦酶基因中获得的启动子，以及NA2-tpi启动子(来自黑曲霉中性a-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶基因的杂合启动子)；及其突变的、截短的和杂合的启动子。在酵母宿主中，有用的启动子是从酿酒酵母(5"acc/wra附少cescev/Wae)烯醇化酶(ENO-l)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛—3-磷酸脱氬酶(ADHl、ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酉良酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶基因中所获得的。还有Romanos等人，1992，1fea^8:423-488中描述了用于酵母宿主细胞的其它有用启动子。控制序列也可以是适当的转录终止子序列，即由宿主细胞识别来终止转录的序列。终止子序列可操作连接于编码多肽的核苷酸序列的3'端。在所选择的宿主细胞中起作用的任何终止子都可用于本发明。对于丝状真菌宿主细胞优选的终止子是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯曱酸合酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因中获得的。对于酵母宿主细胞优选的终止子是,人酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因中获得的。还有Romanos等人，1992，同上中描述的用于酵母宿主细胞的其它有用终止子。控制序列还可以是适当的前导序列，即对宿主细胞进行的翻译重要的mRNA非翻if区。前导序列可操作连接于编码多肽的核苷酸序列的5'端。在所选4奪的宿主细胞中起作用的任何前导序列都可用于本发明。对于丝状真菌宿主细胞而言，优选的前导序列是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉磷酸丙糖异构酶基因中获得的。对于酵母宿主细胞而言，合适的前导序列是从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-l)、酿酒酵母3J痒酸甘油酸激酶、酿酒酵母a-因子和酿酒酵母乙醇脱氬酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因中获得的。控制序列还可以是聚腺苷酸化序列，它是一种可操作连接于核苷酸序列3'端的序列，当转录时可由宿主细胞识别为将聚腺苷残基添加到转录的mRNA上的信号。在所选择的宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列都可用于本发明。对于丝状真菌宿主细胞而言，优选的聚腺苷酸化序列是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯曱酸合酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶和黑曲霉a-葡糖苷酶的基因获得的。Guo和Sherman等人，1995,Mo/ecw/wCW/w/arB/o/ogy15:5983-5990中描述了对酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列。控制序列还可以是信号肽编码区，它编码的氨基酸序列连接于多肽的氨基末端并指导编码的多肽进入细胞分泌途径。核苷酸序列的编码序列的5'端可固有地包含信号肽编码区，它在翻译阅读框中与编码分泌多肽的编码区段天然连接。或者，编码序列的5'端可以包含对编码序列而言外源的信号肽编码区。如果编码序列天然不含信号肽编码区，则可能需要外源的信号肽编码区。或者，外源的信号肽编码区可直接替换天然信号肽编码区以便增强多肽的分泌。然而，指导表达的多肽进入所选择宿主细胞分泌途径的任何信号肽编码区均可用于本发明。对于丝状真菌宿主细胞有效的信号肽编码区是从米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、i/z/zomor脂Wze/天冬氨酸蛋白酶、//ww/co/az.mo/era纤维素酶禾口7fwm/co/a/a"Mg7'wos^月旨肪酶的基因获4寻的信号肽编码区。对于酵母宿主细胞有用的信号肽是从酿酒酵母(X-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得的。还有Romanos等人，1992，同上中描述了的其它有用的信号肽编码区。控制序列还可以是前肽(propeptide)编码区，它编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列。所得的多肽称为酶原(proenzyme)或多肽原(propolypeptide)(或有时候称作酶原(zymogen))。多肽原一般是没有活性的，且可通过前肽的催化或自催化切割^v多肽原转变成成熟有活性的多肽。前肽编码区可^v枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(叩rT)、酿酒酵母a-因子、i/n'zomwcorw/eAe/天冬氨酉吏蛋白酶、禾口A^ce//o//^/zora;f/zermop/z/Zca漆酶(WO95/33836)的基因获得。当信号肽和前肽区都存在于多肽的氨基末端时，前肽区位于与多肽的氨基末端相邻的位置，而信号肽区位于与前肽区的氨基末端相邻的位置。还可能需要加上调节序列以使多肽的表达可以相对于宿主细胞的生长进行调节。调节系统的实例是能响应化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而引起基因表达的开启或关闭。在原核系统中，调节系统包括/flC,toc、和^p操纵子系统。在酵母中，可使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可使用TAKAa-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子作为调节序列。调节序列的其它实例是为基因扩增提供条件的那些序列。在真核系统中，这些包括在氨曱喋呤(methotrexate)存在时扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及有重金属存在时扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的核苷酸序列将与调节序列可操作连接。表达载体本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、及转录和翻译终止信号的重组表达载体。可以将本文所述的各种核酸和控制序列连接起来以产生重组表达载体，此重组表达载体可包括一个或多个适宜的限制性位点使得在这些位点可插入或替换编码多肽的核苷酸序列。或者，本发明的核苷酸序列可通过将核苷酸序列或含有该序列的核酸构建体插入适当的表达载体进行表达。构建表达载体时，将编码序列置于载体中以使编码序列与适当的表达控制序列可操作连接。重组表达载体可以是可适宜地接受重组DNA操作并能引起核苷酸序列表达的任何载体(例如质粒或病毒)。载体的选择一般取决于载体与要引入此载体的宿主细胞之间的相容性。载体可以是线性的或闭合环状的质粒。载体可以是自主复制载体，即载体可以染色体外实体的形式存在，其复制独立于染色体的复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体、或人工染色体。载体可包含任何用于确保自我复制的手段。或者，载体可以是这样的一种载体，它在导入宿主细胞后，整合到基因组中并与其整合进入的染色体一起复制。此外，可使用单一载体或质粒，或是一起含有待引入宿主细胞基因组的全部DNA的两种或多种载体或质粒，或者转座子。本发明载体优选包含一种或多种选择标记，所述选4奪标记允许易于选择转化的的细胞。选择标记是一种基因，其产物有助于产生抗微生物剂或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型变成原养型等等。适于酵母宿主细胞的标记实例有ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、和URA3。在丝状宿主细胞中使用的选择标记包括但不限于am^S(乙酰胺酶)、a/^S(鸟氨酸氨曱酰基转移酶)、/)ar(膦丝菌素乙酰基转移酶)、/zp/7(潮霉素磷酸转移酶)、w'aD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5'-磷酸脱羧酶)、sCp危酸腺苦酰转移酶(sulfateadenyltransferase))、和化/C(邻氨基苯曱酸合酶)及其等价物。优选用于曲霉属细胞的是构巢曲霉或米曲霉的aw必和/,G基因以及吸水链霉菌()S^epto，ces1Zz_ygra5cop/c—的6ar基因。本发明的载体优选包含允许载体整合到宿主细胞基因组中或者允许载体在细胞中不依赖于基因组自主复制的元件。为了整合到宿主细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸序列或任何其它载体元件而通过同源或非同源重组整合到基因组中。或者，载体可包含附加的核苷酸序列用于指导通过同源重组在染色体精确位置整合进入宿主细胞基因组中。为了提高在精确位置整合的可能性，整合元件应优选包含足够数目的与对应靶序列具有高度同一性的核酸，诸如100-10,000个碱基对、优选400-10,000个碱基对、且最优选800-10,000个碱基对，从而提高同源重组的几率。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码核苷酸序列。另一方面，载体可通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。为了自主复制，载体还可包含能使载体在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的调节自主复制的任何质粒复制因子。术语"复制起点"或"质粒复制子"在本文中定义为能使质粒或载体在体内复制的核苷酸序列。用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2(im复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、及ARS4和CEN6的组合。可用于丝状真菌细胞的复制起点的实例有AMA1和ANSl(Gems等人，1991，Gene98:61-67;Cullen等人，1987,NucleicAcidsResearch15:9163-9175;WO00/24883)。AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建可才艮据WO00/24883中所/>开的方法来完成。可将本发明多核苷酸的一个以上的拷贝插入宿主细胞中以提高基因产物的产量。提高多核苷酸拷贝数可通过下面的手段实现将序列的至少一个附加拷贝整合进宿主细胞基因组中；或使多核普酸中包含可扩增的选择标记基因，并在合适的选择剂存在下培养此细胞，以筛选出包含所述选择标记基因的扩增拷贝一因此也包含所述多核苷酸的更多拷贝一的细胞。用于连接上述元件以构建本发明重组表达载体的方法是本领域技术人员所熟知的(例如参见Sambrook等人，l989，同上)。宿主细胞本发明还涉及包含本发明多核苷酸的重组宿主细胞，它们可有利地用于多肽的重组生产。可将包含本发明多核苷酸的载体导入宿主细^^以4吏载体保持为染色体的整合体或作为自主复制的染色体外载体，如前所述。术语"宿主细胞，，包括所有那些由于在复制期间出现的突变而不与亲本细胞相同的亲本细胞的后代。宿主细胞的选择在很大程度上依赖于编码多肽的基因和它的来源。宿主细胞可以是真核生物，例如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。在一个优选的方面，宿主细胞是真菌细胞。"真菌"在用于本文时包括子嚢菌门(Acomycota)、4旦子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)(如Hawksworth等人,在《AinsworthandBisby，sDictionaryofTheFungi》，第八版，1995，CABInternational，UniversityPress，Cambridge,UK中所定义的)，以及卵菌门(Oomycota)(如Hawksworth等人，1995，同上第171页中所引用的)和所有有丝分裂孢子真菌(mitosporicfungi)(Hawksworth等人，1995，同上)。在一个更优选的方面，真菌宿主细胞是酵母细胞。"酵母"在用于本文时包括产子嚢酵母(内孢霉目Endomycetales)、产担孢子酵母、和属于半知菌类的酵母(芽孢纲Blastomycetes)。由于酵母的分类今后还会变化，对于本发明来说，酵母应该是如在《BiologyandActivitiesofYeast》(Skinner,RA.、Passmore，S.M,和Davenport,R.R.编,Soc.App.Bacteriol.SymposiumSeriesNo.9，1980)中所定义的。在一个更优选的方面，酵母宿主细胞是假丝酵母属(Ca"W&)、汉逊氏酵母属(//araem//a)、克鲁维氏酵母属(《/M"eramyc")、毕赤氏酵母属(/Vc/z/a)、酵母属(Sacc/zflramyce力、裂殖酵母属(5"c/7/zayacc/2ara/7i^cas)、或Yarrowia属纟田月包。在一个最优选的方面，酵母宿主细胞是卡尔酵母(&cc/7aram;;cMcar/s6e^gem》、酉良酒酵母、#唐4匕酵母(tSacc/zaramyces1AVwto/7'cM力、/Sacc/zaramjK^(iowg/os77、克鲁弗酵母(iSacc/zara哼cesA:—wn')、诺第酵母(5"acc/7ara附少c&s1wor6em'力、或Sacc/zaraw^yceyovzybrw&纟田月包。在另一个最4尤选的方面，酵母宿主细胞是乳克鲁维氏酵母(《/M"erawycey/flcfe)细胞。在另一个最优选的方面，酵母宿主细胞是KwTow/a细胞。在另一个更优选的方面，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞。"丝状真菌"包括真菌门()和卵菌门亚门(6>om_ycoto)的所有丝状体(如Hawksworth等人，1995,同上中所定义的)。丝状真菌通常是以由壳多糖、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、及其他复合多糖组成的菌丝壁为特征。营养生长是通过菌丝伸长，碳代谢是专性需氧的。相反，酵母诸如酿酒酵母的营养生长是通过单细胞菌体的出芽，而碳代谢可以是发酵性的。在一个甚至更优选的方面，丝状真菌宿主细胞是枝顶孢属(/lcremom-wm)、曲霉属、^i才丙霉属(Jwreo6os7'(i/wm)、头因管菌属(^/erA:a"cfera)、Cen》o".o/w/s属、鬼伞属(CV/n77w力、革盖菌属(Cbn.o/i/力、隐5求酵母属(CV，tocoec—、i7///605Wwm属、嫌孑包属(i^"n'wm)、腐质審属(7/wm/co/a)、Mag朋戶W/ze属、毛霉属(Mwcor)、毁丝霉属(Afyce/—滅ora)、7Veoc<a〃z.mast/x属、月永孑包菌属(iVewras790ra)、^以青霉属(PaecZ/omyce力、青霉属(Pem'c/〃/wm)、P/zawerac/zaefe属、射月永菌属(尸/z/e6/a)、尸zVcw^c^属、侧耳属(尸/ew/x^us)、裂一習菌属(1Sc/n.zop/2y〃w附)、T^/aromyces1属(ra/arowyces)、口耆《A子嚢菌属(T72e/"7woasc船)、冲复孑包壳属(77z/e/aWa)、7b/_y/oc/a<i/iw属、才全菌属(rnametes)、或木霉属(7Hc/wcferma)的纟田月包。在一个最优选的方面，丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、烟曲霉(Aperg/〃MS/wm/ga加)、臭曲霉(血perg/〃ws^b幼'(iws)、曰本曲霉(A/erg〃/t^y'apom'cw)、构巢曲霉、黑曲霉、或米曲霉细胞。在另一个最优选的方面，丝4犬真菌宿主纟田月包是#干孑包^)犬镰孑包(i^yar/wmZa"/7.c//wVifey)、Fw^n^mcere<3//>s、Fwsar/w附crao^vve〃e"化、大刀镰孑包(Fi^an'M附cw/morww)、禾本牙牛镰孑包(Fi/sam'Mm)、禾赤錄孑包(Fwar/wmgra柳z'wwm)、异孑包镰孑包(尸wsan'wm/zeterospw/ww)、合7欠木镰孑包(_Fw>s"a/-/Mmwegwm^,)、尖孑包镰孑包、多枝镰孑包(Fwson'm附7^/cw/a/7/w)、4分红镰孑包(Fwsar&m)、才妄骨木镰孑包(i^"ar/w附sam6w"'www)、月夫色镰孑包(Ftwan'wwsarcoc/zraww)、4以分4支孑包Fusan,wmfrfc/of/zec〖o/(ies、或i^san'wmvewewafwm纟田月包。在另一个最4尤选的方面，丝4犬真菌宿主细月包是无烟管菌(场'erA:a"(ierac^wWa)、Cenj^on'o/w^sw6ve厂m^/on3、灰色鬼伞(Co/^7'wwsc/wereMs)、毛革盖菌(Con.o/ws/h7^m/^s)、//ww/co/(3/rao/e似、/7w冊.co/(3/a冊g7,"cwa、曼赫毛霉(Mwcor服'e/ze/)、粗糙脉孢菌(A^wra^oracmsM)、产紫青霉(pe/7/c〃/ww/wrpw厂oge"M附)、/Vzawerac/zaefec/z/3^aspor/w附、辆射射月永菌(尸//e6/an^(i/ato)、尸/ewra^s1e^ywg//、土生才炎孑包壳(T7w'e/av/ate^r^str/s)、长纟戎毛牙全菌(7h3附e/es1v/〃osyi)、Tr"we/es1verw'co/or、口合茨木霉(7/c/z(9(ier附a/z(3/^朋m—、康T木霉(7Hc/wtife環〃A:om'wg77)、7Wc/20(ie環a/6wg/6rac/n'af訓、7Hc/zO(ierwarees'e〖、或舌录色木霍(7Wc/zocfermavz'n'ofe)纟田月包。真菌细胞可以本身已知的方式通过涉及原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁再生的过程进行转化。EP238,023和Yelton等人，1984,/Vo"eA"^o/AeAto/o"a/Jc^few少o/&/e"cayUSA81:1470-1474中描述了适合曲霉属和木霉属宿主细胞转化的过程。Malardier等人，1989,Gene78:147-159和WO96/00787中描述了适合转化镰孢属物种的方法。可利用Becker和Guarente在Abelson,J.N.和Simon,M.I.编的《(7w/<ietol^a^G"e""/csM9/ecw/ar所o/ogy》,A/^/zcxis1/"Vol.194,pp182-187，AcademicPress公司，NewYork;Ito等人,1983,Tc/o/Sacten'o/ogy153:163;及Hinnen等人，1978,尸raceecfe7g5f/zeAto/oMa/Jctwfe，0/iSWe"ces1t7S^75:1920中所描述的程序转化酵母。生产方法
技术领域：
：本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养细胞，所述细胞的野生型能够产生所述多肽；并(b)回收所述多肽。在一个优选的方面，所述细胞是栓菌属、Pac/z;^vtos/7ora属或白桩或大白桩菇。本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于产生所述多肽的条件下培养宿主细胞；并(b)回收所述多肽。本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于产生所述多肽的条件下，培养包含如下核苷酸序列的宿主细胞，所述核苷酸序列具有SEQIDNO:l、3、4、6、23、25、36、38、39、41或43各自的成熟多肽编码区，其中该核苷酸序列编码多肽，该多肽分别由SEQIDNO:2的第1至556位氨基酸或SEQIDNO:37的第1至561位氨基酸；或SEQIDNO:5的第1至575位氨基酸或SEQIDNO:40的第1至565位氨基酸组成；或分别由SEQIDNO:26的第1至556位氨基酸或SEQIDNO:24的第1至548位氨基酸或SEQIDNO:43的第1至523位氨基酸组成；并(b)回收该多肽。在本发明的生产方法中，利用本领域众所周知的方法在适于产生所述多肽的营养培养基中培养细胞。例如，细胞培养可在实验室或工业发酵罐中在适当的培养基中和允许所述多肽被表达和/或分离的条件下，通过摇瓶培养、小规模或大规模发酵(包括连续的、分批的、补料-分批、或固态发酵)来进行。培养可使用本领域已知的程序在含有碳源、氮源以及无机盐的合适营养培养基中进行。适宜的培养基可从商业供应商获得，或者可根据已公开的配方来制备(例如美国典型培养物保藏中心的目录中公开的)。如果多肽分泌到营养培养基中，那么可直接从培养基回收多肽。如果多肽不分泌到培养基中，其可从细胞裂解物回收。所述多肽可以通过本领域已知的对多肽特异性的方法来检测。这些检测方法可包括特异性抗体的使用，酶产物的生成，或者酶底物的消失。例如，可4吏用如本文所述的酶测定来确定酶的活性。所得多肽可通过本领域已知的方法回收。例如，所述多肽可通过常规程序从营养培养基中回收，所述程序包括但不限于离心、过滤、萃取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。本发明的多肽可通过本领域已知的多种程序纯化，包括但不限于下述程序层析(例如离子交换、亲和、疏水、层析聚焦和大小排阻)、电泳(例如制备性等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或萃取(例i口参见《ProteinPurification》，J,C.Janson和LarsRyden编，VCHPublishers,NewYork,1989)，以获得基本上纯的多肽。植物本发明还涉及已被编码本发明具有葡糖淀粉酶活性的多肽的核苷酸序列转化，从而以可回收量表达和产生该多肽的转基因植物、植物部分或植物细胞。所述多肽可从植物或植物部分回收。或者，将含有重组多肽的植物或植物部分本身用于改善食物或飼料的质量，例如提高营养价值、可口性(palatability)和流变性、或石皮坏抗营养因子(antinutritivefactor)。转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶才直物的实例有禾草(grasses),例》。草i也草(meadowgrass)(蓝草(bluegrass),早熟禾属(Poa));草料草(foragegrass),诸如羊矛属(Festuca)、黑麦草属(Lolium);温带草(temperategrass),例如剪月殳颖属(Agrostis);和谷类(cereals),例^口小麦(wheat)、燕麦(oat)、黑麦(rye)、大麦(barley)、牙舀(rice)、高粱(sorghum)、和玉蜀泰(maize)(玉米(corn))。双子叶植物的例子有烟草；豆类(legumes),例如羽扇豆(lupins);马铃薯；甜菜；豌豆；菜豆(bean)和大豆，和十字花科(Smw/caceae)植物，例如花椰菜(cauliflower)、油菜籽(rapeseed)和与之亲缘关系紧密的模式生物拟植物部分的实例有茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、和块茎，以及构成这些部分的单独组织，例如表皮、叶肉、薄壁组织、维管组织、分生组织。特殊的植物细胞区室(compartments),诸如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质也认为是植物部分。此外，任何植物细胞，无论什么组织来源，也认为是植物部分。类似的，植物部分，诸如被分离用来帮助本发明的应用的特定组织和细胞也认为是植物部分，例如胚、胚乳、糊^f分和种皮。这些植物、植物部分和植物细胞的后代也被包括在本发明的范围之内。可根据本领域已知的方法构建表达本发明多肽的转基因植物或植物细胞。简而言之，植物或植物细胞的构建可通过将一种或多种编码本发明多肽的表达构建体整合到植物宿主基因组或叶绿体基因组中，并使所得的修饰植物或植物细胞增殖形成转基因植物或植物细胞。所述表达构建体合适地为核酸构建体，其包含编码本发明多肽、且可操作地与在所选植物或植物部分中表达该核苷酸序列所需的合适调控序列连接的多核苷酸。另外，该表达构建体还可以包括可用于鉴定已整合所述表达构建体的宿主细胞的选择标记；以及将该构建体导入所述植物所需的DNA序列(后者取决于使用的DNA导入方法)。调节序列(例如启动子和终止子序列，以及可选的信号或转运(transit)序列)的选择，是根据例如想要在何时、何处、怎样表达该多肽而决定的。例如，编码本发明多肽的基因的表达可以是组成型或诱导型的，或者可为发育特异性、阶段特异性或组织特异性的，而且基因产物可以被靶向于具体的组织或者植物部分例如种子或叶。对调节序列的描述有例如Tague等，1988,尸/a"/1P—油gy86:506。对于组成性表达，可以使用35S-CaMV、玉米泛素1和水稻肌动蛋白启动子(Franck等.，1980.Ce〃21:285-294,ChristensenAH,SharrockRA和Quail,1992,户/a"fMaS/o/.18:675-689;ZhangW，McElroyD.和WuR.,1991,P/a"fCe〃3:1155-1165)。器官特异性的启动子可以是，例如，来自存储性贮藏组织(storagesinktissues)例如种子、马铃薯的块茎及果实的启动子(Edwards和Coruzzi,1990，j朋.G^"W.24:275-303),或者来自代谢性贮藏组织(metabolicsinktissues)，例如分生组织的启动子(Ito等，1994，尸/a"fMo/.24:863-878);或者是种子特异性的启动子，例如来自稻的谷蛋白、谷醇溶蛋白、球蛋白或白蛋白启动子(Wu等，1998,P/朋f朋dCe〃P/z，/o/ogy39:885-889)，来自蚕豆(Wc/a/aZ)a)的豆球蛋白B4和未知的种子蛋白基因的蚕豆启动子(Conrad等，1998,Toi/m"/o/P/a"/1P/zjw'o/ogy152:708-711),来自一种种子油体(seedoilbody)蛋白的启动子(Chen等，1998,尸/耐a"c/Ce〃P/z"/o/ogy39:935-941),来自区欠洲油菜(5ra^/ca)的贝i存蛋白napA启动子，或任何其他本领域已知的种子特异性的启动子，例如WO91/14772所描述的。另外，该启动子可以是叶特异性的启动子，例如来自稻或西红柿的Acs启动子(Kyozuka等，1993,P/P/y/w》/ogy102:991-1000);小球藻病毒腺嘌呤曱基转移酶基因启动子(Mitra和Higgins,1994,户/a^Mo/ecw/w26:85-93)，或来自稻的aW尸基因启动子(Kagaya等，1995，M/腦/crWG置ra/Gewe"oy248:668-674);或为创伤诱导性(woundinducible)的启动子，例^口马铃著pin2启动子(Xu等，1993,尸/awfTWo/ecw/w22:573-588)。类似地，该启动子也可以被非生物性的处理例如温度、干旱或盐度变化所诱导，或者被外加的活化启动子的物质，例如乙醇、雌激素、植物激素如乙烯、脱落酸和赤霉酸、及重金属所诱导。还可使用启动子增强子元件以实现本发明多肽在植物中的更高表达。例如，启动子增强子元件可以是位于启动子和编码本发明多肽的核苷酸序列之间的内含子。例如Xu等人，1993,同上中公开了利用水稻肌动蛋白1基因的第一个内含子来增强表达。选择标记基因和表达构建体的任何其他部分都可以从本领域可用的那些进行选择。可根据本领域已知的常规技术将核酸构建体整合入植物基因组中，包括土壤杆菌04gratocten'Mm)介导的转化、病毒介导的转化、显微注射、粒子轰击、生物射弹转化(biolistictransformation),和电穿孔(Gasser等人，1990，Science244:1293;Potrykus，1990，肠/rec/z"o/，8:535;Shimamoto等人，1989,Atowe338:274)。目前，才艮瘤土i裏牙干菌(JgraZ(3cten'wm^附e/ac/em1)介导的基因举争移是产生转基因双子叶4直物的首选方法(其综述可参见Hooykas和Schilperoort，1992,P/a^iWo/ecw/ar所ofogy19:15-38),而且也可用于转化单子叶植物，尽管这些植物常使用其它转化方法。目前，优选用于产生转基因单子叶植物的方法是粒子轰击(极小金或钨粒子，被用于转化的DNA所包被)胚愈伤组织或发育中的胚(Christou,1992,P/aw〃o訓a/2:275-281;Shimamoto,1994,Cwr固fQp/m.cw肠fec/wo/ogy5:158-162;Vasil等人，1992,fi/o/Tec/mo/ogy10:667-674)。另外一种可选的转化单子叶植物的方法是基于原生质体转化，如Omimlleh等，1993,PlantMolecularBiology21:415-428所述。在转化后，根据本领域熟知的方法选出已整合入表达构建体的转化体，中选择性地除去选择基因，例如通过用两个单独的T-DNA构建体共转化，或通过特异性的重组酶位点特异性地切下选择基因。本发明还涉及生产本发明多肽的方法，包括(a)在有助于产生所述多肽的条件下，培养含有如下多核苷酸的转基因植物或植物细胞，所述多核苷酸编码本发明具有葡糖淀粉酶活性的多肽；并(b)回收所述多肽。组合物本发明还涉及包含本发明多肽的组合物。优选地，所述组合物富集了这样的多肽。术语"富集，，表示该组合物的葡糖淀粉酶活性已经被增加，例如以至少为1.1的富集因子(enrichmentfactor)增力口。所述组合物可包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单一组分组合物。或者，该组合物可以含有多种酶活性，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、a-半乳糖苷酶、P-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、a-葡萄糖香酶、p—葡萄糖香酶、卣代过氧化物酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苦酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶或木聚糖酶。更多的酶可由，例如，属于下列属的微生物产生曲霉属，优选棘孢曲霉(y^pw^〃^acM/ea^0、泡盛曲霉、烟曲霉、臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉或米曲霉；镰孢属，优选杆孢状镰孢、Fwan'MWcweafc、Fi^an'wwcraoybve//e^e、大刀镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰3包、合欢木镰孢、尖孢镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、4妄骨木镰孢、肤色镰孢、Fw^r/wm、i^w'M附/ora/ayw附、T^"r/w附Wc/o/Z2e"》法5或i^w/w附vewe腦&m;腐质審属，优选//wm/co/a/rao/em1或//w丽'co/a/awwg/waa;或木審属,^f尤选口合茨木審、康宁木審、JWc/zO(ierwa/o"g/6nac/n.a/^w、7>/c/zocfe7-marees^/或绿色木霉。所述多肽组合物可以根据本领域已知的方法制备，并可以为液体或干组合物的形式。例如，该多肽组合物可以是颗粒或者微粒(microgranulate)的形式。可以用本领域已知的方法稳定组合物中要包含的多肽。葡糖淀粉酶和酸性a-淀粉酶的组合根据本发明的这个方面，本发明的葡糖淀粉酶可与酸性a-淀粉酶以0.3至5.0AFAU/AGU的比例相组合。更优选的是，酸性a-淀粉酶活性与葡糖淀斗分酶活性的比例为至少0.35、至少0.40、至少0.50、至少0.60、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少1.1、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.85或甚至至少1.9AFAU/AGU。然而，酸性a-淀粉酶活性与葡糖淀粉酶活性的比例应优选小于4.5、小于4.0、小于3.5、小于3.0、小于2.5或小于2.25AFAU/AGU。以AUU/AGI计，酸性a-淀粉酶活性与葡糖淀粉酶活性的比例优选存在于在0.4至6.5AUU/AGI之间。更优选的是，酸性a-淀粉酶活性与葡糖淀粉酶活性的比例至少为0.45、至少0.50、至少0.60、至少0.7、至少0.8、至少0.9、至少1.0、至少l.l、至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少1.6、至少1.7、至少1.8、至少1.9、至少2.0、至少2.1、至少2.2、至少2.3、至少2.4或甚至至少2.5AUU/AGI。然而，酸性a-淀粉酶活性与葡糖淀粉酶活性的比例应优选小于6.0、小于5.5、小于4.5、小于4.0、小于3.5或小于3.0AUU/AGI。上述组合物适于用于下述淀粉转化过程，以生产糖浆和发酵产物，例如乙酉事。下述给出了本发明多肽组合物的优选用途的实例。本发明多肽组合物rmwgfeyc/wgw/ato葡糖淀粉酶与其他葡糖淀粉酶和酸性a-淀粉酶的组合本发明的rrawefesc/"gw/ato葡糖淀井分酶^皮发现具有比其它葡糖淀4分酶，例^口v4f/2e/^ra诉W、黑曲霉和ra/aromyceyemeraow7高4—74咅的a-1,6-去分枝活性(参见实施例12)。因此，根据本发明，7Vametesc/"gw/Gto葡糖淀粉酶可与酸性a-淀粉酶及另一种葡糖淀粉酶相组合。这样的酶组合适于用于包括淀粉转化的过程，包括乙醇生产，包括一步发酵方法。a-淀粉酶可为任何a-淀粉酶。在一个优选实施方式中，a-淀粉酶是下面的"a-淀粉酶"部分列出的任何a-淀粉酶。在一个优选实施方式中，a-淀粉酶是真菌a-淀粉酶，特别是下面的"真菌a-淀粉酶"部分所披露的那些，尤其是川地曲霉a-淀粉酶。优选的还有下面的"真菌杂合a-淀粉酶"部分所4皮露的杂合a-淀粉酶，包括美国专利发明者井原美智子,刘继银,埃里克·阿兰,宇田川裕晃,宋子良,福山志朗,萨拉·兰德维克申请人:诺维信北美公司;诺维信公司