专利名称：一种细胞核移植的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用显微操纵仪进行细胞工程的方法，尤其涉及一种利用显微操纵仪进行核移植的方法。
背景技术：
细胞工程是生物工程的一个重要方面，当前细胞工程所涉及的主要技术领域有细胞培养、细胞融合、细胞拆合、染色体操作及基因转移等方面。而以细胞核移植为手段的细胞改造在细胞工程领域正发挥着越来越重要的作用。目前细胞核移植方法主要有以下几种(1)借助脉冲(Piezoimpact)装置直接去核和注核的方法。Wakayama等借助Piezoimpact装置完成了MII期卵母细胞的去核和注核，并首先获得了来源于体细胞的克隆小鼠，且具有较高的核移植效率。然而却很少有人能重复其工作，而且这种方法还需要配备Piezoimpact装置，应用也受到一定的限制。
(2)化学诱导去核然后注核的方法。即用脱羰秋水仙碱(Demecolcine)处理激活的小鼠MII期卵母细胞使其排出第二极体。由于脱羰秋水仙碱作用，染色单体没有分开而全部进入排出的第二极体从而完成去核，以小鼠卵丘细胞核为供体与此方法去核卵母细胞构建重构胚得到了克隆小鼠。但一系列结果表明用此方法对重构胚的后期发育具有很大的副作用，要使其能更好地应用于实践还需要进一步的研究。而且在注核过程中还要借助于特殊的装置或对细胞的再次损伤。
(3)Spindle-View系统辅助去核然后注核的方法。Liu等报道利用MII期卵母细胞的细胞质和纺缍体对光的不同折射率，在显微镜光学系统上附加在极性光学显微镜基础上研制出的一种纺缍体图像观察系统——Spindle-View偏振光系统，该系统捕获的图象进行计算机处理，显示出MII期染色体(纺锤体)所处位置，然后通过显微操作去核，用该方法可以对MII期卵母细胞进行无创伤去核。但此方法也需要特殊的设备而且还需要很多的经验进行判断，特别是在去核和注核过程中还要借助于Piezoimpact装置或对细胞的多次损伤，所以也并未流行使用。
(4)沈新明等报导了用改进的去核方法高效率的去除细胞核，之后在透明带开口的地方注入细胞核的核移植方法。这个方法是先在透明带上用实心针开一个比较大的口然后增加持卵针内的负压使极体与其下方核质从所开的口中挤出透明带，完全去核以后再从原来的开口处用注射针注入细胞核。该方法虽然可以省去特殊装置的使用，但也有其较大的弊端。如在进行穿孔的时候会使细胞质部分发生较大的变形及位移，这样开始的对位可能到后来就不怎么精确；通过负压挤压透明带的方法去除细胞质部分时力度不好掌握，如果力度太小无法将目标核质去除，如果太大就会一下子去除过多的细胞质，很难找到恰当的力度。还有一个很重要的弱点就是在进行移核的时候还要换针和对开口重新对位，这样在操作过程中将会浪费过多时间，而操作时间对卵的成活率具有很大的影响。
综上所述，当前所用的显微操作核移植方法大都需要借助于特殊的仪器(如Piezoimpact装置或Spindle-View系统)，对卵的损伤特别大而且相当费时，因此，在现实工作中迫切需要一种简便、实用、损伤小和快捷的核移植方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种简便、实用、损伤小和快捷的核移植方法。
本发明所述的细胞核移植的方法，包含如下步骤(1)在直径为8±4μm的注射针中事先吸入生物物质；(2)先用口径15～30μm的持卵针以9点钟的方向固定住卵母细胞(图1)；(3)将另一侧的注射针针尖沿持卵针相对方向移至卵母细胞的正下方(图2)；(4)将注射针上移，挤压卵母细胞使其在注射针和持卵针之间形成透明带皱褶，至注射针针尖与持卵针开口位置对齐；(5)将注射针刺进并穿透透明带皱褶，进入持卵针的开口中(图3)；(6)降低持卵针内的负压，使其正好能支持卵母细胞止，一边将注射针拔回至卵周隙中，一边缓慢增加持卵针内的负压，直到极体与目标核质被吸进持卵针止(图4)；(7)降低持卵针内的负压至持卵针与卵母细胞脱离，以上述在卵周隙中的注射针为支点，用持卵针重新调整卵母细胞的位置，使其中心与注射针针尖在同一水平线上，然后增加持卵针内的负压，重新固定卵母细胞(图5)；(8)将上述事先吸到注射针中的生物物质注入到去核的卵母细胞质中或卵周隙中(图6，7，8)。
其中步骤(2)～(5)中所述的注射针可以用实心针代替，用来去核。
其中步骤(1)或(8)中所述的生物物质优选细胞核、核质体、细胞或DNA之一。
其中步骤(1)所述的注射针的直径优选8μm。
其中步骤(2)所述的持卵针的直径优选20±2μm。
利用本发明所述的方法进行细胞核移植同当前的显微操作核移植方法相比，具有明显的优越性(1)不需要特殊的设备，只需要一般的倒置显微镜和显微操纵仪即可进行，操作简便，便于广泛推广使用。
(2)可以准确去除目标核质，达到高效率去核的目的。
(3)对卵母细胞透明带的损伤较小，去除细胞核后透明带表面上还是很完整的。
(4)卵母细胞质不会受强烈挤压而解体。
(5)对重构胚的后期发育没有副作用。
(6)力度比较好控制，新手也很容易掌握。
(7)用本发明可以一次完成去核和注核两个步骤，减少了显微操作所要用的时间，这对提高重构胚的成活率至关重要。
图1用持卵针以9点钟的方向固定住卵母细胞。
其中1持卵针，2极体，3卵母细胞，4注射针，5供体核。
图2注射针针尖沿持卵针相对方向移至卵母细胞的正下方。
图3注射针刺进并穿透透明带皱褶进入持卵针的开口中。
图4极体与目标核质被吸进持卵针。
其中6极体与目标核质。
图5被持卵针固定的卵母细胞中心与注射针针尖在同一水平线上。
图6细胞核注入去核的卵母细胞质中。
图7注射针插入卵周隙。
图8供体细胞注入卵周隙中。
图9卵母细胞以9点钟的位置固定于持卵针上。
其中7玻璃实心针。
图10实心针刺进并穿透透明带皱褶进入持卵针的开口中。
图11极体与目标核质被吸进持卵针内。
图12去除极体和目标核质后，拔出实心针。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步说明实施例1(1)用直径为8μm的注射针吸取颗粒细胞，反复吹打该细胞使其细胞膜破裂，然后吸入注射针中，以此方式处理多个细胞使细胞核在注射针中排成一排，细胞核之间留有适当的空隙；(2)取进行超排处理的小鼠，引颈处死，取出输卵管；(3)将输卵管壶腹部带有颗粒细胞的卵母细胞用细针拨出，然后放入含有透明质酸酶的培养液中，37℃孵箱中处理5分钟，使颗粒细胞完全脱去；(4)取状态良好极体完整的卵母细胞，用口径为15μm的持卵针以9点钟方向固定(图1)；(5)将另一侧的注射针针尖沿持卵针相对方向移至卵母细胞的正下方(图2)；(6)将注射针上移，挤压卵母细胞使其在注射针和持卵针之间形成透明带皱褶，至注射针针尖与持卵针开口位置对齐；
(7)将注射针刺进并穿透透明带皱褶，进入持卵针的开口中(图3)；(8)降低持卵针内的负压，使其正好能支持卵母细胞止，一边将注射针拔回至卵周隙中，一边缓慢增加持卵针内的负压，直到极体与目标核质被吸进持卵针内止(图4)；(9)降低持卵针内的负压至持卵针与卵母细胞脱离，以上述在卵周隙中的注射针为支点，用持卵针重新调整卵母细胞的位置，使其中心与注射针针尖在同一水平线上，然后增加持卵针内的负压，重新固定卵母细胞(图5)；(10)将注射针扎入细胞质中，增加注射针的正压成功地将颗粒细胞的细胞核移入去核的卵母细胞质中(图6)；(11)拔出注射针，对该细胞的显微操作核移植过程结束；(12)所有细胞操作完毕以后在新鲜的培养液中培养1小时，取状态良好的细胞进行后续操作。
实施例2(1)用直径为8μm的注射针吸取颗粒细胞，反复吹打该细胞使其细胞膜破裂，然后吸入注射针中，以此方式处理多个细胞使细胞核在注射针中排成一排，细胞核之间留有适当的空隙；(2)取进行超排处理的小鼠，引颈处死，取出输卵管；(3)将输卵管壶腹部带有颗粒细胞的卵母细胞用细针拨出，然后放入含有透明质酸酶的培养液中，37℃孵箱中处理5分钟，使颗粒细胞完全脱去；(4)取状态良好极体完整的卵母细胞，用口径为20μm的持卵针以9点钟方向固定(图1)；(5)将另一侧的注射针针尖沿持卵针相对方向移至卵母细胞的正下方(图2)；(6)将注射针上移，挤压卵母细胞使其在注射针和持卵针之间形成透明带皱褶，至注射针针尖与持卵针开口位置对齐；(7)将注射针刺进并穿透透明带皱褶，进入持卵针的开口中(图3)；(8)降低持卵针内的负压，使其正好能支持卵母细胞止，一边将注射针拔回至卵周隙中，一边缓慢增加持卵针内的负压，直到极体与目标核质被吸进持卵针止(图4)；(9)降低持卵针内的负压至持卵针与卵母细胞脱离，以上述在卵周隙中的注射针为支点，用持卵针重新调整卵母细胞的位置，使其中心与注射针针尖在同一水平线上，然后增加持卵针内的负压，重新固定卵母细胞(图5)；(10)将注射针扎入细胞质中，增加注射针的正压成功地将颗粒细胞的细胞核移入去核的卵母细胞质中(图6)；(11)拔出注射针，对该细胞的显微操作核移植过程结束；(12)所有细胞操作完毕以后在新鲜的培养液中培养1小时，取状态良好的细胞进行后续操作。
实施例3
(1)用直径为8μm的注射针吸取颗粒细胞，反复吹打该细胞使其细胞膜破裂，然后吸入注射针中，以此方式处理多个细胞使细胞核在注射针中排成一排，细胞核之间留有适当的空隙；(2)取进行超排处理的小鼠，引颈处死，取出输卵管；(3)将输卵管壶腹部带有颗粒细胞的卵母细胞用细针拨出，然后放入含有透明质酸酶的培养液中，37℃孵箱中处理5分钟，使颗粒细胞完全脱去；(4)取状态良好极体完整的卵母细胞，用口径为30μm的持卵针以9点钟方向固定(图1)；(5)将另一侧的注射针针尖沿持卵针相对方向移至卵母细胞的正下方(图2)；(6)将注射针上移，挤压卵母细胞使其在注射针和持卵针之间形成透明带皱褶，至注射针针尖与持卵针开口位置对齐；(7)将注射针刺进并穿透透明带皱褶，进入持卵针的开口中(图3)；(8)降低持卵针内的负压，使其正好能支持卵母细胞止，一边将注射针拔回至卵周隙中，一边缓慢增加持卵针内的负压，直到极体与目标核质被吸进持卵针内止(图4)；(9)降低持卵针内的负压至持卵针与卵母细胞脱离，以上述在卵周隙中的注射针为支点，用持卵针重新调整卵母细胞的位置，使其中心与注射针针尖在同一水平线上，然后增加持卵针内的负压，重新固定卵母细胞(图5)；(10)将注射针扎入细胞质中，增加注射针的正压成功地将颗粒细胞的细胞核移入去核的卵母细胞质中(图6)；(11)拔出注射针，对该细胞的显微操作核移植过程结束；(12)所有细胞操作完毕以后在新鲜的培养液中培养1小时，取状态良好的细胞进行后续操作。
实施例4(1)用直径为10μm的注射针吸取颗粒细胞，使其在注射针中排成一排，颗粒细胞之间留有适当的空隙；(2)取进行超排处理的小鼠，引颈处死，取出输卵管；(3)将输卵管壶腹部带有颗粒细胞的卵母细胞用细针拨出，然后放入含有透明质酸酶的培养液中，37℃孵箱中处理5分钟，使颗粒细胞完全脱去；(4)取状态良好极体完整的卵母细胞，用口径为20μm的持卵针以9点钟方向固定(图1)；(5)将另一侧的注射针针尖沿持卵针相对方向移至卵母细胞的正下方(图2)；(6)将注射针上移，挤压卵母细胞使其在注射针和持卵针之间形成透明带皱褶，至注射针针尖与持卵针开口位置对齐；(7)将注射针刺进并穿透透明带皱褶，进入持卵针的开口中(图3)；(8)降低持卵针内的负压，使其正好能支持卵母细胞止，一边将注射针拔回至卵周隙中，一边缓慢增加持卵针内的负压，直到极体与目标核质被吸进持卵针内止(图4)；(9)降低持卵针内的负压至持卵针与卵母细胞脱离，以上述在卵周隙中的注射针为支点，用持卵针重新调整卵母细胞的位置，使其中心与注射针针尖在同一水平线上，然后增加持卵针内的负压，重新固定卵母细胞(图5)；(10)调整注射针位置使其深入卵周隙中(图7)，增加注射针内的正压成功地将颗粒细胞注入去核卵母细胞的卵周隙中(图8)；(11)拔出注射针，对该细胞的显微操作核移植过程结束；(12)所有细胞操作完毕以后在新鲜的培养液中培养20分钟，取状态良好的细胞进行后续操作。
实施例5(1)用直径为10μm的注射针吸取事先经过离心方法制备的淋巴细胞核质体，使其在注射针中排成一排，核质体之间留有适当的空隙；(2)取进行超排处理的小鼠，引颈处死，取出输卵管；(3)将输卵管壶腹部带有颗粒细胞的卵母细胞用细针拨出，然后放入含有透明质酸酶的培养液中，37℃孵箱中处理5分钟，使颗粒细胞完全脱去；(4)取状态良好极体完整的卵母细胞，用口径为20μm的持卵针以9点钟方向固定(图1)；(5)将另一侧的注射针针尖沿持卵针相对方向移至卵母细胞的正下方(图2)；(6)将注射针上移，挤压卵母细胞使其在注射针和持卵针之间形成透明带皱褶，至注射针针尖与持卵针开口位置对齐；(7)将注射针刺进并穿透透明带皱褶，进入持卵针的开口中(图3)；(8)降低持卵针内的负压，使其正好能支持卵母细胞止，一边将注射针拔回至卵周隙中，一边缓慢增加持卵针内的负压，直到极体与目标核质被吸进持卵针内止(图4)；(9)降低持卵针内的负压至持卵针与卵母细胞脱离，以上述在卵周隙中的注射针为支点，用持卵针重新调整卵母细胞的位置，使其中心与注射针针尖在同一水平线上，然后增加持卵针内的负压，重新固定卵母细胞(图5)；(10)调整注射针位置使其深入卵周隙中(图7)，增加注射针内的正压成功地将核质体注入去核卵母细胞的卵周隙中(图8)；(11)拔出注射针，对该细胞的显微操作核移植过程结束；(12)所有细胞操作完毕以后在新鲜的培养液中培养20分钟，取状态良好的细胞进行后续操作。
实施例6(1)取进行超排处理的小鼠，引颈处死，取出输卵管；(2)将输卵管壶腹部带有颗粒细胞的卵母细胞用细针拨出，然后放入含有透明质酸酶的培养液中，37℃孵箱中处理5分钟，使颗粒细胞完全脱去；
(3)取状态良好极体完整的卵母细胞，用口径为20μm的持卵针以9点钟方向固定(图9)；(4)将另一侧的针尖根部直径为10μm的实心针针尖沿持卵针相对方向移至卵母细胞的正下方；(5)将实心针上移，挤压卵母细胞使其在实心针和持卵针之间形成透明带皱褶，至实心针针尖与持卵针开口位置对齐；(6)将实心针刺进并穿透透明带皱褶，进入持卵针的开口中(图10)；(7)降低持卵针内的负压，使其正好能支持卵母细胞止，一边将实心针拔回至卵周隙中，一边缓慢增加持卵针内的负压，直到极体与目标核质被吸进持卵针内止(图11)；(8)拔出实心针，对该细胞的去核过程结束(图12)；(9)所有细胞操作完毕以后在新鲜的培养液中培养10分钟，取状态良好的去核卵母细胞进行后续操作。
权利要求
1.一种细胞核移植的方法，包含如下步骤(1)在直径为8±4μm的注射针中事先吸入生物物质；(2)先用直径15～30μm的持卵针以9点钟的方向固定住卵母细胞；(3)将另一侧的注射针针尖沿持卵针相对方向移至卵母细胞的正下方；(4)将注射针上移，挤压卵母细胞使其在注射针和持卵针之间形成透明带皱褶，至注射针针尖与持卵针开口位置对齐；(5)注射针刺进并穿透透明带皱褶，进入持卵针的开口中；(6)降低持卵针内的负压，使其正好能支持卵母细胞止，一边将注射针拔回至卵周隙中，一边缓慢增加持卵针内的负压，直到极体与目标核质被吸进持卵针内止；(7)降低持卵针内的负压至持卵针与卵母细胞脱离，以上述在卵周隙中的注射针为支点，用持卵针重新调整卵母细胞的位置，使其中心与注射针针尖在同一水平线上，然后增加持卵针内的负压，重新固定卵母细胞；(8)将上述事先吸到注射针中的生物物质注入到去核的卵母细胞质中或卵周隙中。
2.如权利要求1所述的细胞核移植的方法，其特征是步骤(2)～(5)中所述的注射针用实心针代替，用来去核。
3.如权利要求1所述的细胞核移植的方法，其特征是步骤(1)或(8)中所述的生物物质是细胞核、核质体、细胞或DNA之一。
4.如权利要求1所述的细胞核移植的方法，其特征是步骤(1)所述的注射针的直径为8μm。
5.如权利要求1所述的细胞核移植的方法，其特征是步骤(2)所述的持卵针的直径为20±2μm。
全文摘要
本发明公开了一种简便、有效而且实用的显微操作细胞核移植的方法。该方法主要为利用事先吸入生物物质的注射针挤压卵母细胞使其在注射针和持卵针之间形成透明带皱褶，然后将注射针刺进并穿透透明带皱褶进入持卵针的开口中，一边将注射针拔回至卵周隙中一边缓慢增加持卵针内的负压，将极体与目标核质吸进持卵针，再用持卵针调整卵母细胞的位置，使其中心与注射针针尖在同一水平线上，重新固定卵母细胞，最后将注射针内的生物物质直接注入细胞质或卵周隙中。该方法可以在不需要特殊设备的情况下一次快速完成显微去核和注核过程，而且对卵的损伤较小，便于在动物克隆和转基因等细胞工程领域广泛推广应用。
文档编号C12N15/09GK1807616SQ20061004218
公开日2006年7月26日 申请日期2006年1月13日 优先权日2006年1月13日
发明者时永香, 吴克良, 田海滨, 白增亮 申请人:山东大学