专利名称：发酵与分离耦合制备壳低聚糖和壳寡糖的方法
技术领域：
本发明涉及一种连续酶催化降解壳聚糖制备壳低聚糖和壳寡糖的方法。
背景技术：
壳聚糖是一种来源丰富、价格较低的阳离子天然高分子聚合物，与DNA结合形成聚电解质复合体，使DNA具有更强的抵抗核酸酶降解能力。与病毒型基因载体相比，壳聚糖具有良好生物相容性、可降解性和低毒等性能，这些特性克服了病毒型基因载体的有免疫原性和致癌性的两大缺点，使得壳聚糖逐渐成为基因载体研究的热点。
研究表明，壳聚糖分子量对基因的转染效率有很大影响。通常认为，壳聚糖的分子量是通过以下几个方面影响转染效率1.DNA/壳聚糖的稳定性2.细胞的吸收效率3.经细胞内吞噬作用后DNA从复合物中释放的速率。日本的Sato T等人曾经用pGL3/壳聚糖分别转染A549细胞，B16黑素瘤细胞和Hela细胞，表明了壳聚糖分子量对荧光素酶表达的影响。实验表明，对于以上三种细胞来说，分子量在15-52kDa之间的壳聚糖都可以大大提高荧光素酶的活性，分子量在1.3kDa左右的七聚物基本上没有转染效率，而由分子量大于100kDa的壳聚糖介导的转染效率明显小于15～52kDa分子量的壳聚糖。
壳寡糖不但可以诱导植物产生广谱抗性，抑制多种病原微生物的生长，而且还能提高农作物的产量，低毒、施用后可被土壤中的微生物降解，不会对土壤环境造成不利的影响等优点，此外，壳寡糖对作物品质的改善和提高食品营养价值和经济价值也有较大的意义，这使其极有可能作为一种新型绿色农药在农业生产当中发挥重要的作用。
低聚糖和壳寡糖的制备主要有化学法、氧化法、超声波法和酶降解法。同其他方法相比较，酶法降解壳聚糖具有反应条件温和、操作简单、产物低聚糖和壳寡糖的相对分子质量容易控制、不产生二次污染等优点。
以前采用Penicillium sp.ZD-Z1菌株深层间歇发酵产酶降解壳聚糖易出现产物大量被消耗、对产品的质量的稳定性及产量影响较大。而采用半连续发酵和超滤耦合制备壳低聚糖有明显优势(1)半连续发酵效率更高。(2)产物的不断移出能够缓解酶解反应的产物抑制并且能够延长发酵时间，极大提高单位酶的利用率。(3)使用合适的超滤膜可以有效地控制产物分子量的分布。本发明公开了一种发酵和超滤的耦合，半连续酶催化降解壳聚糖制备壳低聚糖和壳寡糖的方法，适用于高效率制备高纯度壳低聚糖和壳寡糖产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备壳低聚糖和壳寡糖的方法。
方法的步骤如下1)将保藏号为CGMCC No.0851的高产壳聚糖酶生产菌Penicillium sp.ZD-Z1的斜面管5支，直接接种在5L的发酵罐中，培养基装液量3～3.8L，培养温度28～32℃、搅拌转速200～350r/min、通气量1.5～3.5L/min；2)发酵30～40小时后开始与超滤分离耦合，每隔2～4小时从发酵罐中取出500～800ml发酵液进行抽滤，同时流加等量发酵培养基，使罐内发酵液体积保持稳定；3)然后依次用截留分子量为20kDa、5kDa和2kDa的超滤膜进行超滤，被过滤膜截留的大分子量壳聚糖和壳聚糖酶等同时返回到5L发酵罐中去再继续反应；4)超滤后得到20kDa～5kDa、5kDa～2kDa和2kDa以下分子量的产品，真空浓缩至1/2～1/3体积，喷雾干燥得到壳低聚糖和壳寡糖。
所说的培养基为壳聚糖5～40g/L、尿素0.5～3g/L、磷酸二氢钾0.2～1g/L、硫酸铵0.5～3g/L。
本发明的优点是采用发酵和超滤的耦合，半连续酶催化降解壳聚糖制备壳低聚糖和壳寡糖，提高壳聚糖酶的利用率，大大提高单位时间产品的得率，适用于高效率制备高纯度壳低聚糖和壳寡糖产品。
具体实施例方式
本发明提供了利用青霉菌发酵和超滤分离耦合制备不同分子量壳低聚糖的方法。在5L的发酵罐中，装入培养基量3～3.8L，培养温度28～32℃、转速200～350r·min-1、通气量1.5～3.5L·min-1。发酵30-40小时后开始与超滤分离耦合，及时分离生成的壳低聚糖和壳寡糖。依次用截留分子量为20kDa、5kDa和2kDa的超滤膜进行超滤。超滤后得到不同分子量的产品，采用不同的真空浓缩倍数和喷雾干燥条件制备高纯度壳低聚糖和壳寡糖样品。
实施例1(1)前期发酵将高产壳聚糖酶生产菌Penicillium sp.ZD-Z1的斜面管(CGMCC No.0851)5支，直接接种在5L的发酵罐中，培养基装液量3L，培养温度28℃、搅拌桨转速250r/min、通气量1.8L/min。
发酵培养基组成如下初始pH值为5
发酵32小时，青霉菌生长进入稳定期，为后期的发酵和超滤分离耦合做准备。
(2)发酵和超滤分离耦合每隔2小时从发酵罐中取出500ml发酵液进行抽滤，去除发酵液中的菌体及大颗粒杂质。同时流加等量发酵培养基，使罐内发酵液体积保持稳定。抽滤后的发酵液依次用截留分子量为20kDa、5kDa和2kDa的超滤膜进行超滤，被过滤膜截留的大分子量壳聚糖和壳聚糖酶等同时返回到发酵罐中继续反应。
(3)壳低聚糖溶液的浓缩超滤后得到分子量范围分别为5k～20kDa、2k～5kDa和2kDa以下的溶液，再分别进行真空蒸馏浓缩，得到浓度较高的壳低聚糖溶液。
(4)高纯度壳低聚糖的制备利用喷雾干燥制备样品。条件如下进口温度160℃；进料速率6ml/min；气体流速27m3/h，出口温度90℃。所得产品经真空干燥后测得其水分含量为7％～10％，扣除水分后产品得率可达到90％以上。喷雾干燥得到的壳低聚糖呈淡黄色粉末状，在干燥避光条件下保存。
实施例2(1)前期发酵将高产壳聚糖酶生产菌Penicillium sp.ZD-Z1的斜面管(CGMCC No.0851)5支，直接接种在5L的发酵罐中，培养基装液量3.5L，培养温度30℃、搅拌桨转速300r/min、通气量2.5L/min。
发酵培养基组成如下初始pH值为5
发酵36小时，青霉菌生长进入稳定期，为后期的发酵和超滤分离耦合做准备。
(2)发酵和超滤分离耦合每隔2小时从发酵罐中取出600ml发酵液进行抽滤，去除发酵液中的菌体及大颗粒杂质。同时流加等量发酵培养基，使罐内发酵液体积保持稳定。抽滤后的发酵液依次用截留分子量为20kDa、5kDa和2kDa的超滤膜进行超滤，被过滤膜截留的大分子量壳聚糖和壳聚糖酶等同时返回到发酵罐中继续反应。
(3)壳低聚糖溶液的浓缩超滤后得到的不同溶液中，壳低聚糖分子量范围分别为5k～20kDa、2k～5kDa和2kDa以下，再进行真空蒸馏浓缩，得到浓度较高的壳低聚糖溶液。
(4)高纯度壳低聚糖的制备利用喷雾干燥制备样品。条件如下进口温度160℃；进料速率8ml/min；气体流速27m3/h，出口温度88℃。所得产品经真空干燥后测得其水分含量为7％～10％，扣除水分后产品得率可达到90％以上。喷雾干燥得到的壳低聚糖呈淡黄色粉末状，在干燥避光条件下保存。
实施例3(1)前期发酵将高产壳聚糖酶生产菌Penicillium sp.ZD-Z1的斜面管(CGMCC No.0851)5支，直接接种在5L的发酵罐中，培养基装液量3.8L，培养温度32℃、搅拌桨转速350r/min、通气量3.5L/min。
发酵培养基组成如下初始pH值为5
发酵36小时，青霉菌生长进入稳定期，为后期的发酵和超滤分离耦合做准备。
(2)发酵和超滤分离耦合每隔2小时从发酵罐中取出800ml发酵液进行抽滤，去除发酵液中的菌体及大颗粒杂质。同时流加等量发酵培养基，使罐内发酵液体积保持稳定。抽滤后的发酵液依次用截留分子量为20kDa、5kDa和2kDa的超滤膜进行超滤，被过滤膜截留的大分子量壳聚糖和壳聚糖酶等同时返回到发酵罐中继续反应。
(3)壳低聚糖溶液的浓缩超滤后得到的不同溶液中，壳低聚糖分子量范围分别为5k～20kDa、2k～5kDa和2kDa以下，再进行真空蒸馏浓缩，得到浓度较高的壳低聚糖溶液。
(4)高纯度壳低聚糖的制备利用喷雾干燥制备样品。条件如下进口温度160℃；进料速率10ml/min；气体流速27m3/h，出口温度90℃。所得产品经真空干燥后测得其水分含量为7％～10％，扣除水分后产品得率可达到90％以上。喷雾干燥得到的壳低聚糖呈淡黄色粉末状，在干燥避光条件下保存。
权利要求
1.一种壳寡糖的制备方法，其特征在于方法的步骤如下1)将保藏号为CGMCC No.0851的高产壳聚糖酶生产菌Penicillium sp.ZD-Z1的斜面管5支，直接接种在5L的发酵罐中，培养基装液量3～3.8L，培养温度28～32℃、搅拌转速200～350r/min、通气量1.5～3.5L/min；2)发酵30～40小时后开始与超滤分离耦合，每隔2～4小时从发酵罐中取出500～800ml发酵液进行抽滤，同时流加等量发酵培养基，使罐内发酵液体积保持稳定；3)然后依次用截留分子量为20kDa、5kDa和2kDa的超滤膜进行超滤，被过滤膜截留的大分子量壳聚糖和壳聚糖酶等同时返回到5L发酵罐中去再继续反应；4)超滤后得到20kDa～5kDa、5kDa～2kDa和2kDa以下分子量的产品，真空浓缩至1/2～1/3体积，喷雾干燥得到壳低聚糖和壳寡糖。
2.根据权利要求1所述一种高产壳聚糖酶的真菌菌株，其特征在于所说的培养基为壳聚糖5～40g/L、尿素0.5～3g/L、磷酸二氢钾0.2～1g/L、硫酸铵0.5～3g/L。
全文摘要
本发明公开了一种发酵和超滤耦合制备不同分子量壳低聚糖产品的方法。所述的发酵微生物是从土壤中筛选得到并已经授权国家发明专利的高产壳聚糖酶菌Penicillium sp.ZD－Z1，菌种培养的方法是将菌种接种到加入到发酵培养基中，在5L的发酵罐中，经半连续发酵和超滤耦合制备不同分子量壳低聚糖。在30℃下培养36小时开始耦合，每2小时从发酵罐中取出发酵液进行抽滤，除去大部分悬浮菌体，同时流加等量壳聚糖溶液，使罐内发酵液体积保持稳定。当稀释率为0.15h
文档编号C12P19/00GK1928106SQ20061005324
公开日2007年3月14日 申请日期2006年9月1日 优先权日2006年9月1日
发明者郑连英, 张匡 申请人:浙江大学