专利名称：家蚕生产重组犬CaIFN－α的方法
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术、蛋白质的纯化与活性分析，尤其涉及一种家蚕生产重组犬CaIFN-α的方法。
背景技术：
干扰素(Interferon，IFN)是由脊椎动物细胞产生的一类分泌型糖蛋白，它具有广谱抗病毒和增强免疫应答的作用，其主要活性是抗病毒。犬的α干扰素(CaIFN-α)全基因为561个碱基，编码187个氨基酸，其中前23个氨基酸为信号肽，后164个氨基酸为成熟蛋白，蛋白分子量约为19kDa。Hiummler等于1987年首先开始了犬IFNα基因的研究。报道了IFNα基因序列并专利控制了该基因的使用，而国内这方面研究较少。
近年来，养犬业在我国发展迅速，犬作为宠物饲养已成为人们生活的一部分，而病毒病却严重危害着犬的健康和生存。为了研制和开发犬重组干扰素生物制剂，本申请对CaIFN-α基因进行了克隆.测序，并建立了利用我国的特色资源昆虫家蚕表达、生产重组犬α干扰素的技术，为重组犬α干扰素的应用奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种家蚕生产重组犬CaIFN-α的方法。利用基因工程表达技术，构建含有犬CaIFN-α基因的重组病毒，并利用家蚕作为宿主，表达生产具有生物活性的重组犬CaIFN-α。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案其步骤如下1、一种家蚕生产重组犬CaIFN-α的方法(1)CaIFN-α基因的克隆以浙江省当地家犬的血细胞抽提的基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增得到犬CaIFN-α基因；引物设计如下正向引物5’ggatcctgcc acctgcccgac3’BamHI，含有BamHI酶切位点，反向引物5’aagctttcatttcctcctcct g 3’，含有HindIII酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下一个循环，94℃模板变性3分钟；以下30个循环，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟；最后1个循环，72℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆进Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的载体pCR2.1，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆CaIFN-α基因顺序正确性，并已登录国际基因数据库GenBank，登录号DQ520882；(2)含有犬CaIFN-α基因的重组杆状病毒的构建用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-CaIFN-α得到CaIFN-α基因片段，然后克隆入申请人已经构建成功的家蚕Bacmid(专利号200310108781.8)的质粒pFastBacHT获得重组体pFastBacHT-CaIFN-α；将该质粒转化入感受态大肠杆菌DH10BmBacmid，通过细菌转座子的作用在细菌内产生重组病毒基因组，通过挑选重组白色菌斑，随后抽提DNA，该DNA即为重组杆状病毒基因组；然后将该DNA与脂质体混合，并转染入家蚕培养细胞BmN，用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液，然后通过再次感染细胞获得高浓度的重组病毒溶液，浓度为108pfu/ml。申请人犬将此重组病毒命名为BmNPV-CaIFN-α；(3)家蚕体内表达和重组CaIFN-α纯化使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述重组病毒进行感染表达；接种前，将幼虫浸在冰水浴中麻醉10分钟，注射用病毒悬浮液浓度为106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每条家蚕注射20μl，注射1小时后给桑，在23-25℃下饲养；感染后的三天内，看不到明显的症状，到第四天，幼虫开始食欲减弱，渐渐地呈现出感染症状；感染后地五天或第六天，感染的幼虫大部分死亡，在此之前收集家蚕幼虫；将幼虫的血淋巴作为重组犬CaIFN-α纯化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴在15ml收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部和尾部，让腹部和腹足伸向外边。用石蜡膜密封的25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接滴进收集管中，为了防止血液氧化变黑，预先加入1/10体积的10mmol/L二硫苏糖醇DTT，使其终浓度为1mmol/L；由于重组蛋白N-末端带有6×His尾巴，可以用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化；从感染的幼虫收集的血淋巴用非变性结合缓冲液，Na3PO450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH 8.0，进行稀释；样品随后结合于Ni-NTA柱，最后，重组蛋白用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白；(4)重组CaIFN-α活性分析鉴定将纯化的、倍比稀释的重组CaIFN-α添加到犬肾细胞(MDCK)单层培养细胞，作用18h，然后加入VSV病毒，同时设置阴性对照组，24h后观察细胞病变结果。根据结果分析判断重组CaIFN-α的抗病毒活性。
本发明与背景技术相比，具有的有益效果是本发明较好地解决了CaIFN-α在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作、酵母表达中质粒转化体不稳定和在哺乳动物培养细胞生产的成本太高的缺点，家蚕幼虫表达重组犬CaIFN-α具有较高的生物活性，且大部分被分泌进血淋巴中，非常有利于蛋白质的快速提取。重组CaIFN-α可以大量生产为CaIFN-α在医学上的应用开辟了广阔的前景。
具体实施例方式
1、材料DNA抽提试剂盒购于Qiagene。DNA处理和PCR扩增试剂盒购于Takara Biomedicals(Kyoto，Japan)。TA克隆试剂盒、杆状病毒转移载体pFastBacHT、lipofectin和Ni-NTA树脂均为Invitrogen公司产品。DNA测序试剂盒购于PE Applied Biosystems。胎牛血清FCS、家蚕BmN细胞培养基TC-100均为GibcoBRL的产品。本试验使用家蚕杂交种，品种名称为秋丰×白玉，家蚕幼虫桑叶饲养，温度为23～25℃。
2、工作流程一种家蚕生产重组犬CaIFN-α的方法(1)CaIFN-α基因的克隆以浙江省当地家犬的血细胞抽提的基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增得到犬CaIFN-α基因；引物设计如下正向引物5’ggatcctgccacctgcccgac3’BamHI，含有BamHI酶切位点，反向引物5’aagctttcatttcctcctcct g 3’，含有HindIII酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下一个循环，94℃模板变性3分钟；以下30个循环，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟；最后1个循环，72℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆进Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的载体pCR2.1，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆CaIFN-α基因顺序正确性，并已登录国际基因数据库GenBank，登录号DQ520882；(2)含有犬CaIFN-α基因的重组杆状病毒的构建用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-CaIFN-α得到CaIFN-α基因片段，然后克隆入申请人已经构建成功的家蚕Bacmid(专利号200310108781.8)的质粒pFastBacHT获得重组体pFastBacHT-CaIFN-α；将该质粒转化入感受态大肠杆菌DH10BmBacmid，通过细菌转座子的作用在细菌内产生重组病毒基因组，通过挑选重组白色菌斑，随后抽提DNA，该DNA即为重组杆状病毒基因组；然后将该DNA与脂质体混合，并转染入家蚕培养细胞BmN，用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液，然后通过再次感染细胞获得高浓度的重组病毒溶液，浓度为108pfu/ml。申请人将此重组病毒命名为BmNPV-CaIFN-α；(3)家蚕体内表达和重组CaIFN-α纯化使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述重组病毒进行感染表达；接种前，将幼虫浸在冰水浴中麻醉10分钟，注射用病毒悬浮液浓度为106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每条家蚕注射20μl，注射1小时后给桑，在23-25℃下饲养；感染后的三天内，看不到明显的症状，到第四天，幼虫开始食欲减弱，渐渐地呈现出感染症状；感染后地五天或第六天，感染的幼虫大部分死亡，在此之前收集家蚕幼虫；将幼虫的血淋巴作为重组犬CaIFN-α纯化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴在15ml收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部和尾部，让腹部和腹足伸向外边。用石蜡膜密封的25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接滴进收集管中，为了防止血液氧化变黑，预先加入1/10体积的10mmol/L二硫苏糖醇DTT，使其终浓度为1mmol/L；由于重组蛋白N-末端带有6×His尾巴，可以用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化；从感染的幼虫收集的血淋巴用非变性结合缓冲液，Na3PO450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH 8.0，进行稀释；样品随后结合于Ni-NTA柱，最后，重组蛋白用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白；(4)重组CaIFN-α活性分析鉴定将纯化的、倍比稀释的重组CaIFN-α添加到犬肾细胞(MDCK)单层培养细胞，作用18h，然后加入VSV病毒，同时设置阴性对照组，24h后观察细胞病变结果，根据结果分析判断重组CaIFN-α的抗病毒活性。
权利要求
1.一种家蚕生产重组犬CaIFN-α的方法，其特征在于(1)CaIFN-α基因的克隆以浙江省当地家犬的血细胞抽提的基因组DNA为模板，利用PCR技术扩增得到犬CaIFN-α基因；引物设计如下正向引物5’ggatcctgcc acctgcccgac3’BamHI，含有BamHI酶切位点，反向引物5’aagctttcatttcctcctcct g 3’，含有HindIII酶切位点；PCR反应的循环数、温度和时间的设计如下一个循环，94℃模板变性3分钟；以下30个循环，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟；最后1个循环，72℃延伸10分钟；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用Qiagene的PCR纯化试剂盒纯化，随后将目的PCR产物克隆进Invitrogen公司的TA克隆3.9kb的载体pCR2.1，利用双脱氧链终止法在核苷酸测序仪上测序确认克隆CaIFN-α基因顺序正确性，并已登录国际基因数据库GenBank，登录号DQ520882；(2)含有犬CaIFN-α基因的重组杆状病毒的构建用限制性内切酶BamHI和HindIII消化pCR2.1-CaIFN-α得到CaIFN-α基因片段，然后克隆入申请人已经构建成功的家蚕Bacmid，(专利号200310108781.8)的质粒pFastBacHT获得重组体pFastBacHT-CaIFN-α；将该质粒转化入感受态大肠杆菌DH10BmBacmid，通过细菌转座子的作用在细菌内产生重组病毒基因组，通过挑选重组白色菌斑，随后抽提DNA，该DNA即为重组杆状病毒基因组；然后将该DNA与脂质体混合，并转染入家蚕培养细胞BmN，用无血清的TC-100培养基培养24小时后，换成含有10％胎牛血清的新鲜培养基，27℃培养5天，收集培养基上清作为病毒储存原液，然后通过再次感染细胞获得高浓度的重组病毒溶液，浓度为108pfu/ml，申请人将此重组病毒命名为BmNPV-CaIFN-α；(3)家蚕体内表达和重组CaIFN-α纯化使用家蚕幼虫5龄起蚕，接种上述重组病毒进行感染表达；接种前，将幼虫浸在冰水浴中麻醉10分钟，注射用病毒悬浮液浓度为106pfu/ml，采用皮下注射的方法，每条家蚕注射20μl，注射1小时后给桑，在23-25℃下饲养；感染后的三天内，看不到明显的症状，到第四天，幼虫开始食欲减弱，渐渐地呈现出感染症状；感染后地五天或第六天，感染的幼虫大部分死亡，在此之前收集家蚕幼虫；将幼虫的血淋巴作为重组犬CaIFN-α纯化的起始材料，使用以下方法收集血淋巴在15ml收集管的上方，将幼虫向背面弯曲，用一只手固定幼虫的头部和尾部，让腹部和腹足伸向外边，用石蜡膜密封的25号针头刺破腹足收集血液，让血液直接滴进收集管中，为了防止血液氧化变黑，预先加入1/10体积的10mmol/L二硫苏糖醇DTT，使其终浓度为1mmol/L；由于重组蛋白N-末端带有6×His尾巴，可以用Ni-NTA亲和柱在非变性条件下进行蛋白纯化；从感染的幼虫收集的血淋巴用非变性结合缓冲液，Na3PO450mmol/L，NaCl 0.5mol/L，pH8.0，进行稀释；样品随后结合于Ni-NTA柱，最后，重组蛋白用含有250mmol/L咪唑的非变性洗脱缓冲液洗脱，通过SDS-PAGE考马斯亮蓝染色后鉴定重组蛋白；(4)重组CaIFN-α活性分析鉴定将纯化的、倍比稀释的重组CaIFN-α添加到犬肾细胞(MDCK)单层培养细胞，作用18h，然后加入VSV病毒，同时设置阴性对照组，24h后观察细胞病变结果，根据结果分析判断重组CaIFN-α的抗病毒活性。
全文摘要
本发明公开了一种家蚕生产重组犬CaIFN－α的方法。利用家蚕杆状病毒作为载体，构建了重组含有犬CaIFN－α基因的重组病毒。利用家蚕作为重组杆状病毒的宿主，表达了具有生物活性的重组犬CaIFN－α。解决了CaIFN－α在大肠杆菌中表达需要复杂的复性操作、酵母表达中质粒转化体不稳定和在哺乳动物培养细胞生产的成本太高的缺点，家蚕幼虫表达的重组犬CaIFN－α大部分被分泌进血淋巴中，非常有利于蛋白质的快速提取。实验结果证明利用重组杆状病毒以家蚕生产重组犬CaIFN－α方法可行。重组犬CaIFN－α的大量生产为CaIFN－α在医学和治疗领域上的应用开辟了广阔的前景。
文档编号C12P21/02GK1916175SQ200610053280
公开日2007年2月21日 申请日期2006年9月6日 优先权日2006年9月6日
发明者姚慧鹏, 吴小锋, 赵娜 申请人:浙江大学