专利名称：可大量获得真菌胞外多糖的发酵和分离方法
技术领域：
本发明涉及大型真菌发酵领域，通过液体发酵生产真菌多糖的方法。本发明旨在提供一种具有pH缓冲作用的真菌液体发酵培养基，和一种利用该培养基在发酵过程中将胞内多糖转化为胞外多糖的发酵培养方法。发明还涉及一种对发酵生产获得的胞外多糖进行提取分离的方法。
背景技术：
真菌多糖广泛存在于各种大型真菌的菌丝体和子实体中。近年来的研究表明，大型真菌多糖是一种天然来源的，功效明确的生物反应调节剂(Biological Reaction Modifier)，具有抗肿瘤作用，免疫促进作用，抗辐射，调节血糖、血脂和血压，与放疗化疗方式联用具有增效减毒作用。真菌多糖制剂是近年来肿瘤生物治疗领域重要的辅助治疗药品之一。
真菌多糖的来源传统上是按照中药的提取方法，通过对栽培子实体进行提取获得。随着液体发酵技术在大型真菌生产领域的应用和成熟，越来越多的大型真菌品种可以通过液体深层发酵进行培养，为工业化大规模生产真菌多糖奠定了基础。通过液体发酵方式生产菌丝体，再对菌丝体进行提取分离获得真菌多糖得生产方法不受季节的限制，具有生产周期短，质量易控的优点。尽管前期投资较大，但由于不受自然环境条件、气候条件的影响，可工厂化大规模生产，因此成为近年来真菌多糖生产新的发展趋势。国内目前已经有30多种真菌进行了液体深层培养试验，证明通过液体发酵的方法生产真菌多糖是可行的。
真菌多糖无论来源于子实体还是菌丝体，所获多糖均为胞内多糖。胞内多糖的提取分离多采用热水提取，减压蒸发或薄膜超滤浓缩，乙醇沉淀后干燥获得。所获多糖均为杂多糖，溶解度低，复溶困难，且工艺流程长，操作复杂，能耗大，成本高，对原料的利用率相对较低。
大型真菌的液体发酵生产，就是利用适合于液体深层培养的菌种，在含有该真菌生长所需的营养物质的液体培养基中，以最大限度的获得菌丝体为目的，在控制适宜的温度、酸度、压力、空气等条件的发酵罐中进行发酵培养，再以获得的菌丝体为原料提取分离真菌多糖。
通过液体发酵生产菌丝体多糖的过程中，在获得胞内多糖的同时，还可以从发酵液中获得胞外多糖。与胞内多糖的提取分离相比，胞外多糖的获得要更简单易行。
本发明的目的就是通过对发酵培养基和发酵工艺过程的控制，使胞内多糖向胞外多糖转化，以期简化多糖的提取分离方法，降低生产成本。
发明内容
本发明提供一种具有pH缓冲作用的真菌发酵培养基，一种可以使胞内多糖向胞外多糖转化的真菌多糖发酵工艺，以及一种提取分离发酵液胞外多糖的工艺方法。
本发明的目的之一就是提供一种发酵生产真菌多糖的发酵培养基，通过以下过程实现本发明涉及的发酵培养基，具备大型真菌培养基的基本特征，提供真菌生长所必需的炭源、氮源和微量元素，具备一定的C/N比例。供体物质可以是天然产物，可以是提取物，也可以是化合物。
本发明涉及的发酵培养基，其碳源物质可以是淀粉、糊精、马铃薯、玉米粉、麦麸、米糠、葡萄糖、蔗糖、乙醇、苹果酸、乳酸中的一种或数种。培养基中的氮源物质可以是水解乳蛋白、水解酪蛋白、酵母提取物、蚕蛹提取物、蛋白胨、玉米浆、麦麸、豆芽提取物中的一种或数种。培养基中的微量元素由常规培养基中的硫酸镁、磷酸二氢钾供给。
本发明涉及的发酵培养基，其C/N比例为20∶1～40∶1，适合大型真菌菌丝体的快速生长和次生代谢产物的积累。
本发明涉及的发酵培养基，具有对发酵液pH的缓冲作用，该缓冲体系为有机酸-有机酸盐体系，缓冲体系的pH根据大型真菌的品种不同具体调节，一般在pH3～8的范围内。
发酵培养基的缓冲体系可以是苹果酸-苹果酸钾、柠檬酸-柠檬酸钠、乳酸-乳酸钠、草酸-草酸铵中的一种或数种。构成缓冲体系的物质占培养基总量的比例为10～50％(V/V)。
本发明的第二个目的是提供一种真菌胞内多糖向胞外多糖转化的发酵生产工艺，通过下述发酵培养过程实现本发明涉及的液体深层发酵培养工艺，为三级发酵，逐级放大的生产工艺，经二级种子培养后，接入发酵罐进行菌丝体和多糖的发酵生产，级间放大比例为1∶5～10。发酵过程主要控制参数包括，温度、酸碱度、通气量、罐压、溶解氧，以真菌菌丝体和真菌多糖为主要目标产物，控制菌丝体生物量和多糖产率。
本发明涉及的液体深层发酵培养工艺，种子罐和发酵罐采用不同的培养基分别培养，种子罐采用常规加强培养基，发酵罐采用pH缓冲培养基，发酵罐发酵重复进行多次，发酵终点以还原糖含量和氨基氮含量为控制指标。
二级种子培养结束，在转入发酵罐之前进行低温处理。首先滤出菌液，无菌水洗涤菌丝体，10～60min内将菌丝体降温到-20～10℃，维持2～80min，在10～60min内升至室温，移入发酵罐。以上所有过程均在无菌条件下进行。
发酵罐中的菌丝体连续发酵2～6次，每次更新部分或全部培养基，在2个平行发酵罐中进行。600～1000r/min离心收集所有发酵液进行多糖的分离提取。
本发明的另一目的，是提供一种胞外多糖，也包括胞内多糖的提取分离方法，通过以下过程实现本发明涉及的真菌多糖提取方法，主要是对不含菌丝体的发酵液多糖进行提取分离。为最大限度的获得发酵产生的真菌多糖，本方法还对发酵菌丝体胞内多糖进行提取。
本发明涉及的真菌胞外多糖提取方法，首先对发酵液加热处理，温度95～100℃，微沸状态保持20～120min，冷却至室温后，微滤，去除杂质，10KD超滤膜进行超滤，浓缩至原体积的1/5～15，加入3～6倍体积95％的乙醇，离心，冷冻干燥，得真菌多糖组分I，该组分以杂多糖为主要构成成分。
本发明涉及的真菌胞外多糖的另一种提取方法，首先对发酵液进行微滤，调节pH到12～14，升高温度至60～80℃，保持1～3h，冷却至室温，6000～14000r/min离心，中和上清液，离心，对上清液用10KD超滤膜进行超滤，浓缩至原体积的1/5～15，加入3～6倍体积95％的乙醇，离心，冷冻干燥，得真菌多糖组分II，该组分以β-葡聚糖为主要构成成分。
发酵培养后过滤出的菌丝体仍然具有提取分离胞内多糖的价值。本发明涉及的真菌胞内多糖提取方法为，将菌丝体用10～40倍体积的去离子水稀释，加热到95～125℃，维持0.5～2h，离心收集上清液。对上清液用胞外多糖的分离方法进行提取分离，得真菌多糖组分III，该组分以杂多糖为主要构成成分。对菌丝体残渣用10～40体积的去离子水稀释，调节pH到12～14，加热至60～80℃，保持1～3h，冷却至室温，6000～14000r/min离心，中和上清液，离心，对上清液用10KD超滤膜进行超滤，浓缩至原体积的1/5～15，加入3～6倍体积95％的乙醇，离心，冷冻干燥，得真菌多糖组分IV，该组分以β-葡聚糖为主要构成成分。
根据真菌多糖的用途，可以采用不同的提取分离方法进行分离提取，以最大限度的获取所需多糖，适应不同的需要。
具体实施例方式
实施例1灰树花菌丝体发酵培养菌种灰树花GF93-2菌株(CGMCC No.1709，专利200610043944.2)。
培养基组成如下水解乳蛋白0.2％、蛋白胨0.3％、葡萄糖2.5％、乙醇5％(V/V)，P、K、Mg和乳酸纳适量，10％乳酸调pH4.8。
灰树花菌种经500ml、3000ml二级摇瓶放大培养，滤出发酵清液，无菌水洗涤菌丝体后，-40℃条件下冷冻10min，升温至室温，无菌条件下接入50L发酵罐培养。培养条件为，温度26℃，摇瓶装液量30％，转速120r/min，罐压0.05MPa，通气量50L/min，搅拌转速400r/min，相对溶氧10％以上，接种量10％，培养时间，摇瓶72h，发酵罐60h。上述培养条件下发酵培养60h放罐，无菌条件过滤，菌丝体重新接入发酵罐，同法发酵培养3次。采用硫酸苯酚法测定各次培养物多糖含量，结果发现，各次提取物中多糖含量均在30～42％之间，提取多糖的结果如表1所示。
表1 50L发酵罐培养灰树花菌丝体的多糖产生情况
由表1可知，经3次发酵提取，共得发酵液94.2L，发酵结束时获菌丝体306.36g，胞外多糖87.79g，胞内多糖38.16g，胞外多糖的总量为总多糖量(125.95g)的69.7％。
实施例2云芝菌丝体三级发酵生产菌种云芝ACCC50435菌株。
培养基组成如下酵母提取物0.2％、蛋白胨0.4％、葡萄糖3.0％、乙醇4％(V/V)，P、K、Mg和柠檬酸钠适量，10％柠檬酸调pH4.8。
云芝菌种经500ml、3000ml二级摇瓶放大培养，无菌条件下接入发酵罐，经30L、300L二级种子罐培养。培养条件为，温度25℃，摇瓶装液量30％，转速120r/min，罐压0.05MPa，通气量50L/min和500L/min，搅拌转速300r/min和180r/min，相对溶氧10％以上，接种量10％，发酵罐装料系数70％，培养时间，摇瓶72h，种子罐48h。二级种子罐发酵培养完成，将发酵液压入无菌过滤器，滤出发酵清液，无菌水洗涤后，-40℃条件下冷冻10min，升温至室温，无菌条件下接入3000L发酵罐。培养条件为，温度25℃，装料系数30％，转速120r/min，罐压0.05MPa，通气量5000L/min，搅拌转速120r/min，相对溶氧10％以上，接种量10％，发酵培养120h放罐。发酵液无菌过滤后，菌丝体重新接入发酵罐，同法发酵培养3次。采用硫酸苯酚法测定各次培养物多糖含量，结果发现，各次提取物中多糖含量均在25～45％之间，提取多糖的结果如表2所示。
表2 3000L发酵罐培养云芝菌丝体的多糖产生情况
由表2可知，在3000L发酵罐中培养的发酵液，经3次发酵提取，共得发酵液5998L，发酵结束时获菌丝体27550.2g，胞外多糖10478.5g，胞内多糖2847g，胞外多糖的总量为总多糖量(13325g)的78.63％。
实施例3取云芝发酵液2000mL，98℃条件下加热处理20min，冷却至室温后，0.45μm的膜微滤去杂，10KD超滤膜超滤至原体积的1/10，加入4倍体积95％的乙醇，4200r/min离心20min，冷冻干燥，得真菌胞外多糖15.2g，采用硫酸苯酚法测定，该组分多糖含量为37.6％，得率为0.76％。
实施例4取云芝发酵液2000mL，0.45μm的膜微滤去杂，NaOH调节pH到14，升高温度至65℃，保持1.5h，冷却至室温，14000r/min离心10min，乙酸中和，6000r/min离心20min，上清液用10KD超滤膜超滤至原体积的1/10，加入4倍体积95％的乙醇，6000r/min离心20min，冷冻干燥，得真菌胞外多糖8.6g，采用硫酸苯酚法测定，该组分多糖含量为56.3％，得率为0.43％。该组分以β-葡聚糖为主要构成成分。
实施例5灰树花发酵菌丝体60℃条件下减压干燥，粉碎80目，取200g，用40倍体积的去离子水稀释，加热到121℃，1h，6000r/min离心，收集上清液。对上清液用胞外多糖的分离方法进行提取分离，得真菌多糖组分I9.2g，该组分以杂多糖为主要构成成分。对菌丝体残渣用30倍体积的去离子水稀释，调节pH到14，加热至80℃，保持3h，冷却至室温，14000r/min离心，中和上清液，离心，得真菌多糖组分II19.6g，该组分为水不溶多糖。对上清液用10KD超滤膜进行超滤，浓缩至原体积的1/15，冷冻干燥，得真菌多糖组分III3.6g，该组分以β-葡聚糖为主要构成成分。
权利要求
1.一种真菌发酵培养基系统，其特征是除供给所培养真菌生长所需的基本营养物质外，该培养基系统对发酵液pH值具有缓冲作用，可人为的降发酵培养基的pH值控制在所培养的真菌液体发酵最适宜的范围内。
2.按照权利要求1所述的真菌发酵培养基系统，其特征是在利用该培养基进行真菌发酵培养过程中，可使该真菌生长过程中细胞壁产生的胞内多糖向胞外多糖转化。
3.按照权利要求1所述的真菌发酵培养基系统，其特征是该培养基缓冲体系的构成为有机酸-有机酸盐系统，可以是苹果酸-苹果酸钠、柠檬酸-柠檬酸钠、乳酸-乳酸钠或草酸-草酸铵中的一种或数种。构成缓冲体系的物质占培养基总量的比例为10～50％(V/V)。
4.按照权利要求1所述的真菌发酵培养基系统，其特征是培养基中的碳源物质和氮源物质所含的总碳和总氮在发酵培养开始之前具有一定的比例(C/N)，该比例为10∶1～40∶1，适合大型真菌菌丝体的快速生长。
5.一种真菌发酵工艺，其特征是发酵培养过程中，真菌细胞壁产生的各种多糖逐渐由胞内多糖项胞外多糖转化，通过更新培养基，可使转化的过程连续进行。发酵工艺为常规三级发酵，种子培养使用常规培养基，发酵罐培养使用本发明的培养基。
6.按照权利要求4所述的真菌发酵工艺，其特征是发酵培养过程所获得的多糖中，胞外多糖的产量占发酵产生的全部多糖产量的50％以上。
7.按照权利要求4所述的真菌发酵工艺，其特征是二级种子在进入发酵罐之前对菌丝体进行低温处理，温度为-40～10℃，时间2～80min。
8.按照权利要求4所述的真菌发酵工艺，其特征是发酵过程中菌体可以多次重复利用，发酵罐中可连续进行2～6次培养。
9.按照权利要求4所述的真菌发酵工艺，其特征是菌体转罐过程中，全部过程都在无菌条件下进行操作。菌丝体需用无菌水进行洗涤，培养液在无菌条件下部分或全部更新。
10.一种真菌多糖提取分离方法，其特征是只对发酵液多糖进行分离即可获得发酵生产的大部分多糖。
11.按照权利要求8所述的真菌多糖提取方法，其特征是提取过程先滤出菌丝体，再对发酵液分别进行微滤、超滤，浓缩至原体积的1/5～15，加入3～5倍体积95％的乙醇，离心，干燥，得真菌蛋白聚糖。
12.按照权利要求8所述的真菌多糖提取方法，其特征是先对发酵液进行过滤滤出菌丝体，再对滤出液进行微滤，调节pH到12～14，升高温度至60～80℃，保持1～3h，冷却至室温，6000～14000r/min离心，中和上清液，再离心，对上清液用5～10KD的超滤膜超滤，浓缩至原体积的1/5～15，加入3～5倍体积95％的乙醇，6000～14000r/min离心，沉淀物冷冻干燥，得β-葡聚糖为主要成分的真菌多糖。
全文摘要
本发明涉及一种具有缓冲作用的大型真菌培养基系统，以及利用该培养基对适合于液体发酵的大型真菌进行液体深层培养，以最大限度的获取真菌胞外多糖为目的的发酵工艺和多糖提取工艺。本发明的培养基系统由基本营养供给物质和pH缓冲体系构成，能使真菌细胞在液体生长状态下，其胞内多糖向胞外多糖转化，从而使后期多糖的分离过程更加简单。发酵过程中，通过对培养液的更新，可使菌体在发酵过程中反复使用，对提高菌丝体的利用率和简化发酵工艺过程具有重要意义。该工艺使传统的对菌丝体多糖的提取转变为对发酵液多糖的分离，工艺简单，成本低。本发明的发酵提取工艺可应用于一般大型真菌的发酵生产。
文档编号C12P19/00GK1974753SQ20061007076
公开日2007年6月6日 申请日期2006年12月13日 优先权日2006年12月13日
发明者王宝琴, 徐泽平 申请人:滨州学院, 王宝琴, 徐泽平