专利名称：一种产碱杆菌及其在制备威兰胶中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种高产威兰胶(Welan gum)的微生物菌株产碱杆菌(Alcaligenes.sp.)NXG-3，本发明还涉及该菌在制备威兰胶中的应用。
背景技术：
半个世纪以来，微生物多糖获得了极大的发展，尤其是60年代，黄原胶产品第一次实现了商业化，引起了科学界和工业界的浓厚兴趣。随后新型的微生物多糖层出不穷。威兰胶是由微生物合成的异型多糖共聚物，它的单体组成为葡萄糖、葡萄糖醛酸、甘露糖和鼠李糖。威兰胶具有许多优良而独特的理化特性，可以作为增稠剂、悬浮剂、稳定剂等广泛用于石油、混凝土、涂料行业，也可用于油墨、食品、纺织印染、农药、化妆品、医药等行业。美国凯乐(Kelco)公司于20世纪80年代，实现了威兰胶的产业化生产，目前主要用于混凝土添加剂。日本也在制备自密实混凝土和自流平混凝土中使用了威兰胶，并于1994年批准威兰胶用于食品添加剂。
目前，威兰胶的生产主要是采用微生物发酵法，美国kelco公司筛选到一株威兰胶产生菌，保藏号ATCC31555，并以此菌为生产菌株实现了威兰胶的产业化生产，此外未见其他关于威兰胶生产的相关报道。
发明内容
本发明的目的是提供一株高产威兰胶的产碱杆菌。
本发明还有一个目的是提供该产碱杆菌在制备威兰胶中的应用。
本发明目的可以通过下列措施来达到本发明人实验室选育并保藏的微生物菌株产碱杆菌(Alcaligenes.sp.)NXG-3，目前该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，登记入册的编号是CGMCC No.1737，保藏日期是2006年6月15日。以此菌作为生产菌株。
CGMCC No.1737菌株具有下述性质(1)菌落形态学特征在营养琼脂上，30℃培养20h出现黄色小菌落，菌落呈圆形，表面光滑，粘状，中央凸起，不透明。适当延长培养，菌落颜色加深，细胞的尺寸和形状变化很小。
(2)生理与生化特性a.培养温度20～40℃，最适温度为30℃；b.在pH4～10范围内生长；c.色素产生产黄色素；d.耐NaCl浓度在6％浓度可以生长。
(3)抗生素敏感性试验NXG-3菌株对以下抗生素的最小抑菌浓度如下卡那霉素 30μg/ml新霉素30μg/ml氯四环素 5μg/ml红霉素15μg/ml四环素30μg/ml庆大霉素 10μg/ml(4)营养特征产碱杆菌NXG-3的培养基中不需要添加生长因子，可以利用多种化合物作为碳源，这些物质既可以单独使用，也可以适当的比例复配充当碳源。有机氮或无机氮都可以作为氮源使用。培养基中各组分用量按各组分与培养基重量体积百分比的计为碳源用量为培养基的2～7％(即每100ml培养基中含有碳源2～7克，下同)，氮源用量为培养基的0.1～1％，无机盐用量为培养基的0.01～1％，其余为水。碳源一般采用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖和淀粉水解液等，氮源可采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、棉子饼粉、尿素以及(NH4)2SO4、NH4Cl等，培养基中还包括钾盐、镁盐、磷酸盐、硫酸盐等常用的无机盐类。
所述的保藏号为CGMCC No.1737的菌株在制备威兰胶中的应用。
所述应用的具体方法为将保藏号为CGMCC No.1737的菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中，在合适生长的条件下进行通风、搅拌培养，生成的威兰胶发酵液经提取得到威兰胶。
所述的制备威兰胶的方法，其中培养基中各组分用量按各组分与培养基重量体积百分比的计为碳源用量为培养基的2～7％，氮源用量为培养基的0.1～1％，无机盐用量为培养基的0.01～1％，其余为水。
所述的制备威兰胶的方法，其中培养基的碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉水解液中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl中的一种或多种；无机盐为钾盐、镁盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、硫酸盐中的一种或多种。
所述的制备威兰胶的方法，其中合适生长的条件是初始pH为5.5～8.0、培养温度为25～35℃、培养时间为36～72小时。
所述的制备威兰胶的方法，其中提取方法包括以下步骤将发酵液进行粗滤，除去菌体；将经过粗滤处理的发酵液进行超滤，浓缩发酵液，去除小分子物质；将经过超滤处理的发酵液用有机溶剂分离，形成沉淀；对所得沉淀进行过滤；干燥、粉碎即可。
所述的制备威兰胶的方法，其中粗滤是在80～200目条件下进行。
所述的制备威兰胶的方法，其中超滤是在超滤膜截流分子量为105～106道尔顿，操作压力为0.06～0.6MPa，温度在20～90℃，发酵液膜面流速为2～6m/s的条件下进行。
所述的制备威兰胶的方法，其中有机溶剂为醇溶剂，醇溶剂加入量为超滤处理后发酵液体积的0.6～1.2倍。常用的醇溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇。
具体地说本发明提供的利用产碱杆菌NXG-3制备威兰胶的方法，是将CGMCC No.1737号菌株斜面活化一天后(斜面培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基)，在含有碳源、氮源和无机盐的培养基上培养36～72小时，可以生成浓度为10～30g/L的威兰胶发酵液，通常发酵条件还包括培养基为葡萄糖或玉米淀粉水解液2～7％，蛋白胨或豆饼粉0.1～1％，MgSO40.01～0.5％，K2HPO40.01～0.5％，各组分的含量均为各组分与培养基的重量体积百分比，即g/100ml，以下同。发酵温度25～35℃，较佳的为28～30℃；培养基的初始pH范围为5.5～8.0，较佳的为6.5～7.5；转速100-200r/min。这样的发酵条件既适用于摇瓶发酵，也可以放大至50L的发酵罐中使用。
本发明提供的提取威兰胶的生产方法，它包括步骤(a)发酵液进行粗滤粗滤作用是除去大颗粒菌体碎片及其它大分物质，粗滤通常在80～180目，较佳地是在100～140目的工业滤布条件下进行。粗滤时对于助滤剂没有特别要求，食品领域中用的各种助滤剂都可用于本发明。合适的助滤剂有(并不限于)硅藻土、珍珠岩，其用量按照助滤剂与发酵液的重量体积百分比计通常为0.4～3％，较佳地为0.8～2％。
(b)超滤浓缩对步骤(a)中经粗滤处理的发酵液在超滤器内进行超滤浓缩，以除去可溶性蛋白质、小分子物质和部分水，超滤膜截流分子量为105～106道尔顿较好，操作压力为0.06～0.6MPa，较佳的为0.1～0.5MPa，通常控制温度在20～90℃，较佳的为40～60℃，膜面速度2～6m/s。
(c)沉淀分离向(b)步骤中制成的威兰胶浓缩液中加入有机溶剂，如95％的乙醇，使胶沉淀，较佳的乙醇用量是经超滤浓缩后的发酵液体积的0.6～1.2倍。用常规方法将沉淀过滤、干燥即可。所得的威兰胶可根据需要粉碎成所需的粉末。
本发明制备的威兰胶具有如下的理化性质(1)产品易溶于水，1％的威兰胶水溶液粘度可达1800-3300cp，威兰胶不溶于乙醇、异丙醇等有机溶剂。
(2)产品具有很好的温度耐受性，在150℃下处理半小时，粘度不变；在pH2～13的范围内，性质稳定。
(3)产品经4mol/L硫酸水解、糖腈乙酸酯衍生化处理后，气相色谱检测得威兰胶的单糖组分为葡萄糖、甘露糖、鼠李糖；化学法测得该产品中还含有葡萄糖醛酸。结构式如下 (4)采用高碘酸氧化法，鉴定了本品的糖苷键类型主要为1→4键和1→3键。
本发明的优点(1)本发明筛选到一株威兰胶生产菌，该菌能利用多种碳源和氮源发酵生产威兰胶，操作方便简单，培养条件十分粗放。
(2)可以使用粗淀粉水解糖液(替代葡萄糖或蔗糖)和豆饼粉(替代酵母膏或蛋白胨)作为威兰胶发酵培养基的碳源和氮源，使发酵原料成本大幅下降。
(3)采用了粗滤、超滤浓缩、醇提取法替代传统的直接用醇沉淀脱水法从溶液中分离威兰胶，使产品蛋白质含量减少20％左右，使单位产品的醇溶剂消耗量下降50％左右。该方法不仅可获得高品质的威兰胶，而且将提取过程中的醇溶剂用量大幅减少。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明，但对本发明没有限制。
实施例1斜面培养基蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，pH7.2。
摇瓶培养基葡萄糖50g/L，豆饼粉4g/L，蛋白胨1g/L，K2HPO42g/L，MgSO40.1g/L，pH7.2。250ml容积的三角瓶中装液量50ml，121℃灭菌15分钟。
将保藏号为CGMCC No.1737的产碱杆菌NXG-3在斜面培养基上28～32℃培养72h，然后接一环此菌于摇瓶培养基中，30℃培养72h，摇瓶转速200r/min，最后得到的发酵液中威兰胶的含量为18g/L。
实施例2将葡萄糖175g，蛋白胨14g，K2HPO47g，MgSO40.35g，pH7.2，用水定容到3.5L，配成发酵液，装入一个7.5升玻璃搅拌发酵罐中，121℃蒸汽灭菌15分钟。配制种子培养基葡萄糖20g/L，蛋白胨4g/L，酵母膏1g/L，K2HPO42g/L，MgSO40.1g/L，pH7.2。将保藏号为CGMCC No.1737的产碱杆菌NXG-3接两环于种子培养基中，30℃培养16h得种子液，将种子液按发酵液体积10％的接种量接入冷却后的发酵液中，30℃培养(通风量1vvm，搅拌转速为600r/min)60h，发酵液中含威兰胶27g/L，粘度达8000cp。
实施例3将1750克玉米淀粉与适量的水混合，加入适量的高温α-淀粉酶液，同时加入豆饼粉140g，K2HPO470g，MgSO43.5g，pH7.2，用水定容至35L，装入50升机械搅拌发酵罐中，90℃保温液化10分钟，再升温至121℃蒸汽灭菌10分钟。配制种子培养基，配方与培养方法同实施例2，将种子液按发酵液体积10％的接种量接入冷却后的发酵液中，30℃培养60小时，成熟的发酵液升温至80～90℃灭活15分钟，冷却后加入发酵液体积两倍的浓度为95％的乙醇，4℃保温过夜，过滤去除上清液，沉淀物在55℃真空干燥箱中烘干约3小时，即得威兰胶成品。
实施例4威兰胶的后提取工艺A.粗滤取50mL按实施例2得到的成熟发酵液，用HCl调节pH为6.5～7.5，进行粗滤，粗滤方式选用110目工业滤布，发酵液中加0.5g助滤剂(硅藻土)，抽滤。
B.超滤浓缩将经过粗滤的威兰胶发酵液在超滤器内进行浓缩，超滤膜截流分子量为106道尔顿，操作压力为0.2MPa，控制温度50℃，膜面速度4m/s。
C.醇析将超滤后的发酵液在不断搅拌下加入95％的工业乙醇，乙醇用量为威兰胶超滤浓缩液体积的1.2倍，静置形成沉淀。
D.烘干和粉碎将沉淀块搅碎，装入滤布中抽滤至无液体流出，沉淀物55℃真空干烘干3小时，粉碎即为产品。
权利要求
1.一株生产威兰胶的菌株，其分类命名为产碱杆菌NXG-3，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.1737。
2.权利要求1所述的菌株在制备威兰胶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于该应用的具体方法为将保藏号为CGMCC No.1737的菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中，在合适生长的条件下进行通风、搅拌培养，生成的威兰胶发酵液经提取得到威兰胶。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于培养基中各组分用量按各组分与培养基重量体积百分比计为碳源用量为培养基的2～7％，氮源用量为培养基的0.1～1％，无机盐用量为培养基的0.01～1％，其余为水。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于培养基的碳源为葡萄糖、蔗糖、果糖、麦芽糖、淀粉水解液中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4、NH4Cl中的一种或多种；无机盐为钾盐、镁盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、硫酸盐中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于合适生长的条件是初始pH为5.5～8.0、培养温度为25～35℃、培养时间为36～72小时。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述提取方法包括以下步骤将发酵液进行粗滤，除去菌体；将经过粗滤处理的发酵液进行超滤，浓缩发酵液，去除小分子物质；将经过超滤处理的发酵液用有机溶剂分离，形成沉淀；对所得沉淀进行过滤；干燥、粉碎即可。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于粗滤是在80～200目条件下进行。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于超滤是在超滤膜截流分子量为105～106道尔顿，操作压力为0.06～0.6MPa，温度在20～90℃，发酵液膜面流速为2～6m/s的条件下进行。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于有机溶剂为醇溶剂，醇溶剂加入量为超滤处理后发酵液体积的0.6～1.2倍。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于醇溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇。
全文摘要
本发明公开了一种产碱杆菌及其在制备威兰胶中的应用。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.1737。该菌株可用于制备威兰胶，利用该菌株制备威兰胶的方法是将此菌株接种于含碳源、氮源、无机盐和水的无菌培养基中，在合适生长的条件下进行通风、搅拌培养，发酵液经提取即得威兰胶。该菌株能利用多种碳源和氮源，培养条件粗放，操作方便简单，威兰胶产量高，质量好，生产成本低。
文档编号C12P19/02GK1888054SQ20061008835
公开日2007年1月3日 申请日期2006年7月13日 优先权日2006年7月13日
发明者徐虹, 李莎, 郭朝江, 欧阳平凯 申请人:南京工业大学