专利名称：重组人粒细胞集落刺激因子的生产方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域。更具体地，本发明提供了一种高效生产重组人粒细 胞集落剌激因子的生产方法，包括有关的重组人粒细胞集落刺激因子编码序列、工程 菌的构建、重组人粒细胞集落刺激因子的表达和纯化工艺。背彔技术粒细胞集落刺激因子(G-CSF)是血管内皮细胞、单核细胞和成纤维细胞合成的 糖蛋白。G-CSF能促进中性粒细胞(ANC)成熟；刺激成熟的粒细胞从骨髓释出；增强中 性粒细胞趋化及吞噬功能，对巨噬细胞、巨核细胞影响很小。G-CSF主要作用于中性 粒细胞系(lineage)造血细胞的增殖、分化和活化。在体外G-CSF刺激骨髓造血祖细胞 中中性粒细胞集落的形成，延长成熟中性粒细胞的存活时间，活化中性粒细胞，促进 其ADCC，超氧阴离子的产生和碱性磷酸酶的合成。最近研究表明，单独G-CSF或与干细胞因子(SCF)协同可促进多能造血干细胞的增 殖、干细胞母细胞集落形成以及体内粒细胞集落形成单位(CFU-G)的形成。G-CSF还具 有对人粒细胞、单核细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞以及成肌纤维细胞的趋化作用。人类的G-CSF基因定位于17q21-22。 rhG-CSF有4种不同的形式filg rastim (Ne upogen)， nartograstim (Ro25-8315)， lenograstim(Granuocyte ), SD/01 (filgrastim sustained duration)。前两者在美国应用于临床，后两者在欧洲应用。lenograstim是惟 一糖基化的rhG-CSF。体外实验中，当pH及温度改变时，糖基化可增强GCSF的稳定性及抗 血清酶的分解作用P1。实际上，lenograstim与受体的亲和力是filgrastim的3倍前者 在刺激中性粒细胞克隆成熟方面所需的浓度为后者的1/16。重组人粒细胞集落刺激因子rhG-CSF,可作为针对肿瘤病人放、化疗后白细胞减 少，治疗用的现代基因工程蛋白质药物。特别是在新生儿败血症、HIV感染及AIDS感染， 自身免疫性粒细胞减少以及肿瘤放化疗中的应用有着积极的作用。因此，开发新的高效 生产重组人粒细胞集落刺激因子的方法很有必要。人类G-CSF成熟蛋白由174氨基酸组成，理论分子量为18.7kD 。本发明根据人 G-CSF的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则，人工合成重组人粒细胞集落 刺激因子(G-CSF)基因的全序列，将它克隆入质粒pET-30(+)，然后转化入大肠杆菌 BL21(DE3)，经表达筛选获得G-CSF高表达工程菌。表达产物经Western-blotting、质 谱分析及氨基酸N端测序等方法进行了结构确证，为重组人粒细胞集落刺激因子 (rhG-CSF)的大规模制备奠定了基础。发明内容本发明的目的就是提供一种高效和/或简便的生产重组人粒细胞集落刺激因子 的方法。本发明的另一目的就是提供优化的重组人粒细胞集落刺激因子的编码序列和用 于该方法的表达载体及工程菌株。在本发明的第一方面，就是提供了一种优化的编码重组人粒细胞集落刺激因子的 核苷酸序列。参见图l。在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，含有权利要求l所述的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的表达载体是pET30a(+)/rhG-CSF。在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，其特征在于，含有权利要求2所述 的表达载体。在另一优选例中，所述的工程细胞是大肠杆菌BL21(DE3)，是多个蛋白酶的基因 缺陷菌株，基因型为力s必卵7pc/"A57^^A&历7/^^7ac〃K5-7"堪因)，非常适合外 源基因的高效表达。在本发明的第四方面，提供了一种生产重组人粒细胞集落刺激因子的方法，该方 法包括歩骤a)在适合的表达条件下，培养如权利要求4所述的宿主细胞，从而表达出重 组人粒细胞集落剌激因子；较佳地，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞 BL21(DE3)。
b)分离纯化出表达的重组人粒细胞集落刺激因子。在本发明的另一优选例中，rhG-CSF在大肠杆菌中以包涵体形式存在，挑选T株 确证好的表达工程菌，用LB培养基进行培养及用lmMIPTG诱导表达，收集菌体，经过 压搾破菌、包涵体变性、复性、阳离子交换层析等纯化歩骤，终产物纯度达90%以上。
图l. rhG-CSF理论序列与rhG-CSF优化序列的同源性比较。Query:原来的rhG-CSF 基因序列；Sbjct:优化的rhG-CSF基因序列。图2. pET30a(+) /rhG-CSF表达质粒的构建路线图。
具体实施方式
本发明人通过深入而广泛的研究，通过优化设计rhG-CSF基因编码序列，将优化 后的rhG-CSF编码序列构建入合适表达载体，转化宿主细胞，获得高表达菌株，并'逋 过优化发酵、纯化工艺，实现了rhG-CSF高效表达，并且表达出的rhG-CSF保持生物学 活性。在此基础上完成了本发明。本发明根据rhG-CSF天然氨基酸序列，按密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的 条件下，优化其核苷酸序列，全基因合成经优化的rhG-CSF蛋白的目的基因序列，将 该基因克隆到pET3(+)中测序验证后，用分子克隆的常规方法，构建表达载体，转入 大肠杆菌，通过施加抗生素筛选出表达工程细胞。试管筛选获得高表达工程细胞。在本发明的一个实例中，构建了生产rhG-CSF的大肠杆菌表达工程细胞，IPTG诱 导，高水平包涵体表达。在本发明的另一个实例中，经过发酵工艺的优化，进一步提高了rhG-CSF的表达量。在本发明的另一个实例中，由于蛋白包涵体表达，菌体经匀浆、洗涤获得包涵 体，再经一系列纯化歩骤后可得到纯品120mg/L。纯化后原液加入适当辅料，制成rhG-CSF的注射用粉针剂。初步稳定性试验表明， 该粉针剂稳定。
中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵液 可获得rhG-CSF纯品120mg,适合产业化生产。本发明的优点在于(1) 选用的是大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞，通过施加抗生素筛选出多拷贝转化 细胞，进而筛选出高表达工程细胞。(2) 优化后的rhG-CSF基因非常适合在大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中表达，具 有高表达、高稳定的特点。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按 照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例l表达质粒的构建和髙表达工程菌株的获得根据人G-CSF的氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性原则，人工合成重组人 粒细胞集落刺激因子(G-CSF)基因的全序列，根据人G-CSF天然氨基酸序列，按照大肠杆菌密码子偏爱性，在不改变氨基酸序 列的条件下，全基因合成重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)基因的全序列，该 基因全长525bp。优化序列和原始序列的比较见图l。将它克隆入质粒pET-30(+)中并 测序验证。表达载体构建方法见图2。用/Wel和fco/ I双酶切分别处理基因rhG-CSF的PCR回收产物和质粒pET-30a(+)， 37'C酶切3小时，回收相应的片段用T4 DNA连接酶在16'C连接过夜。连接产物转化进 入大肠杆菌DH5a，在含有卡那霉素(50 g/mL)的LB平板上挑选阳性克隆并进行质 粒酶切鉴定抽提的质粒DNA用限制性内切酶/Wel和&oRI在37'C反应3小时，得到在 pET-30a(+)中插入了rhGCSF基因的重组质粒pET-30a(+) /rhG-CSF，构建线路见图1 。通过PCR扩增得到目的rhG-CSF基因，用AWe I和I双酶切分别处理基因 rhG-CSF的PCR回收产物和质粒pET30a(+)，酶切后回收相应的片段用T4 DNA连接酶在16t连接过夜。连接产物转化大肠杆菌DH5a ，在含有卡那霉紊的LB平板上挑选抗性 阳性的克隆，将构建好的表达质粒pET-30a(+)/rhG-(〕SF转化进入已制备好的大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞，涂布含卡那霉素(30 g/mL)的LB平板，然后在转化平板上挑取 单克隆。用碱裂解法抽提并检测质粒。抽提质粒DNA，并进行质粒酶切鉴定。得到在 pET30a(+)中插入了rhG-CSF基因的重组质粒pET30a(+)/rhG-CSF。实施例2重组人粒细胞集落刺激因子的表达及表达形式的确定挑选一株确证好的表达工程菌BL21 (DE3) /pET30a(+)/rhG-CSF，用LB培养基进 行培养及用IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳检测是否有目的条带的出现，并分析其表达 量。取一部分发酵后的菌液离心，重悬于pH8. 0, 20mMTris缓冲液，在冰浴下超声 破菌，离心收集超声上清和超声沉淀，SDS-PAGE电泳检测，确定其表达形式。分析，其 超声上清和超声沉淀，目的蛋白绝大部分在沉淀中，表明目的蛋白是以包涵体形式表 达。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单 独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技 术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。
序列表<110> 上海新生源医药研究有限公司 上海新生源生物医药有限公司 〈120>重组人粒细胞集落刺激闪子的生产方法 <160〉 2<210> 1<211> 525<212> DNA〈213〉 人工序列<221> misc一feature<222> (1)..(525)<223>优化的重组人粒细胞集落剌激因子基因<400> 13tgactccgttaggtCCdgcc3gCteactgcagagetttctg犯atgcttag3ggtgcgta犯attcagggcgatggcgcagcgttaC￡lg犯eictgtgtgcc3CC3犯ctgtgtcatCC￡Lg3g柳ctggtgctgttscattctctgggc3ttCC3tgggetCtgagctgt3gCcaggccctgcagctgggctgcttgageC33tt3catageggcCttttcetctaccagggtttactgC3ggccctggaaggtattteaCCElg3gttgggtccattggatctgcagctggatgtcgcctugcc3CCtggCSLgcagatggaag犯ctggga3tggcccctgccctgcagggtgcc￡LtgccggccttcgcctctgetttcC￡lgcgccgtgca柳ggtgtcctggttgccteacatctgC￡Lg￡lgCttcCtggaggtgteatatcgcgttctgcgccatCttgccC3gtga<210> 2<211> 175〈212〉 PRT<213〉 智人<400〉 2Met Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Val Arg Lys lie Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr LysLeuCysHisProGluGluLeuValLeuLeuGlyHisSerLeuGlylieProTrpAlaProLeuSerSerCysProSerGinAlaLeuGinLeuAlaGlyCysLeuSerGinLeuHisSerGlyLeuPheteuTyrGinGlyLeuLeuGinAlaLeuGluGlylieSerProGluLeuGlyProThrLeuAspThrLeuGinLeuAspValAlaAspPheAlaThrThrlieTrpGinGinMetGluGluLeuGlyMetAlaProAlaLeuGinProThrGinGlyAlaMetProAlaPheAlaSerAlaPheGinArgArgAlaGlyGlyValLeuValAlaSerHisLeuGinSerPheLeuGluValSerTyrArgValLeuArgHisLeuAlaGinPro
权利要求
1.一种重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的生产方法，其特征在于，它包含以下步骤a.获得优化的重组人巨噬细胞集落刺激因子的DNA序列；b.构建合适表达载体；c.转化宿主细胞，筛选获得高表达的工程细胞。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的优化的重组人粒细胞集 落刺激因子(rhG-CSF)的DNA序列编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。较佳地，该 DNA序列如SEQ ID N0:1所示。
3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述的表达载体含有权利要求 1所述的DNA序列。较佳地，所述的表达载体是pET30a(+)/rhG-CSF。
4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述的工程细胞，含有权利要 求3所述的表达载体。较佳地，所述的工程细胞是大肠杆菌。
全文摘要
本发明提供了一种重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的编码序列、生产该重组人粒细胞集落刺激因子的方法，以及用于该方法的表达载体和宿主细胞。采用了pET30a(+)表达rhG-CSF，获得了高水平的表达菌株；通过控制发酵条件，达到了较高蛋白表达率；进一步表达形式分析发现其为包涵体表达。在此基础上对分泌表达的重组人粒细胞集落刺激因子的纯化进行了大量的摸索和研究后，得到了一套重组人粒细胞集落刺激因子纯化方法。用本法，可得到高得率、高纯度的重组人粒细胞集落刺激因子蛋白，并能满足临床需要。本发明可高效、简便、低成本地获得重组人粒细胞集落刺激因子纯品。
文档编号C12N15/09GK101153278SQ20061011676
公开日2008年4月2日 申请日期2006年9月29日 优先权日2006年9月29日
发明者军 任, 孙九如, 翊 张, 张继岗, 梁光军, 黄阳滨 申请人:上海新生源医药研究有限公司