检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条及制备方法

专利名称：检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条及制备方法
技术领域：
本发明涉及动物细菌学与动物传染病学技术领域。具体涉及一种检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方法。
背景技术：
牛结核病是一种严重危害奶牛业的人兽共患传染病，由牛分枝杆菌感染所致。被国际动物卫生组织(OIE)定为B类动物传染病。牛结核给世界农业造成的损失大于牛的其他各种疾病的损失总和，每年超过30亿美元。牛分枝杆菌不但可以感染牛及其它多种哺乳动物，而且可感染人。国内外的人结核病原学调查均发现，牛分枝杆菌是人结核的重要病因之一。因此，世界卫生组织专家委员会第七次会议报告指出除非消灭牛结核，否则人类结核病的控制是不会成功的(王忠仁.牛结核病与人结核病的相互关系.中国防痨杂志，2005，27(5)123-125)。
由于目前为止尚未发现有效药物与疫苗用于牛结核病的防治，根除牛结核病主要采取检疫与扑杀阳性牛的国际通用政策。结核菌素(purified protein derivatives，PPD)又称为纯化蛋白衍生物，是结核分枝杆菌在液体培养基中生长时产生的代谢物质，含有多种抗原成分，用于检测结核病时敏感性较高。因此，结核菌素皮内变态反应是国际动物卫生组织与我国认可的法定检疫方法。但由于结核菌素可能包含有与其它分枝杆菌相同的非特异性抗原组份，检测时容易出现假阳性；结核菌素皮内变态反应对感染后期的开放性结核及全身性结核不敏感，而此阶段正是结核患者传播疾病的危险时期。以上原因使结核菌素皮内变态反应的特异性受到质疑。此外，结核菌素皮内变态反应只能进行活体试验，而不能对保存的样品进行回顾性分析，更不适用于野生动物和边远山区的牛结核病普查。
针对目前国内外普遍采用的牛结核病诊断方法——结核菌素皮内变态反应的缺陷，本申请人的农业微生物国家重点实验室动物病原分室研制出了一种用间接血凝方法检测牛结核抗体的试剂盒(专利申请号200510019996.1)。鉴于当时的技术，该试剂盒还有下列一些需要改进的地方，如该试剂盒中只用到MPB70单一抗原，检测的敏感度有待进一步提高；所用的1％致敏绵羊红细胞在4℃下保存期只有半年。
Greenwald证明MPB83和MPB70是牛分枝杆菌主要的特异性分泌抗原(Greenwald R，Esfandiari J，Lesellier S et al.Improved serodetection of Mycobacterium bovis infection in badgers(Meles meles)using multiantigen test formats.Diag Microbiol Infect Dis，2003，46197-203.)。MPB83是一种菌体表面相关脂蛋白，在体内不仅引发细胞免疫，而且引发体液免疫，具有免疫原性和免疫保护(Feng C G，Palendira U C，Demangel J M，et al.Priming by DNA immunizationaugments protective efficacy of Mycobacterium bovis bacille calmette-guerin againsttuberculosis[J].Infect Immun，2001，694174-4176.)。MPB83是早期分泌靶蛋白(O′Loan CJ，Pollock JM，Hanna J，Neill SD.Immunoblot analysis of humoral immune responses toMycobacterium bovis in experimentally infected cattleearly recognition of a 26-kilodaltonantigen[J].Clin Diag Lab Immunol，1994，1608-611.)，可被疾病早期的人和动物免疫系统识别，因而对结核病的早期诊断具有重要意义。
MPB70是牛分枝杆菌特异性分泌蛋白质，分泌量占毒力牛分枝杆菌培养基蛋白总量的10％，是牛分枝杆菌感染过程中重要的体液和细胞免疫目标抗原(Harboe M，Nagai S.MPB70，a unique antigen of Mycobacterium bovis BCG[J].Am Rev Resp Dis.1984，129444-452)，也是PPD的主要成分之一。在牛分枝杆菌中成熟的MPB70蛋白很稳定，是理想的检测抗原(MarkD.Carr，Marieke J.Bloemink，Ellen Dentten et al.Solution Structure of the Mycobacteriumtuberculosis Complex Protein MPB70[J].Biological Chemistry.2003，278(44)43736-43743.)。MPB83与MPB70有61％同一性的同源蛋白质(Nagai S，Matsumoto J，Nagasuga T.Specificskin-reactive protein from culture filtrate of Mycobacterium bovis BCG[J].InfectImmun.1981，31(3)1152-1160.)，本研究室分别用酶联免疫吸附法(ELISA)和琼脂扩散法证明了MPB70能与MPB83的抗血清反应，而MPB83也能与MPB70的抗血清反应，这说明MPB70与MPB83具有共同的抗原决定族。
胶体金免疫层析(gold-immunochromatography assay GICA)是20世纪80年代发展起来的一项新的免疫分析方法，是应用胶体金标记技术，以胶体金作为示踪物，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。它具有简便，快速，特异性强，灵敏度高，费用低的优点。
目前，将胶体金免疫层析技术应用于体外检测牛结核病抗体在国内仍属空白，国外商品化的试剂盒只有韩国Animal Genetics，Inc公司生产的“Anigen Rapid Bovine TB Ab TestKit”，该试剂盒是将MPB70蛋白作为检测抗原，特异性很好，但敏感性不高，会在临床上出现漏检。本申请人研发的“检测牛结核病抗体的免疫胶体金试纸条”同时应用MPB70和MPB83两个蛋白作为检测抗原在国内外尚属首例，具有高特异性和高敏感性。

发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种特异性强、灵敏度高，抗原蛋白便于贮存和携带的检测牛结核病的抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方法，为我国牛结核病防制提供一种简便的检测和诊断方法及工具。
本发明的总体技术路线图如附图1所示。
本发明通过以下技术方案实现为了实现本发明，申请人构建了一种能分泌牛结核分枝杆菌抗原MPB83的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET28a-mpb83，该菌株于2006年12月21日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NOM206142。利用该重组菌株分泌的MPB83作为胶体金标记抗原。
本发明所用到的另一个能分泌牛结核分枝杆菌抗原MPB70的重组大肠杆菌Escherichiacoli BL21/pET28a-mpb70，保藏编号为CCTCC NOM205135，利用该重组菌株分泌的MPB70作为检测线的包被抗原。
如附图2所示，本发明的检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条，它包括样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)和PVC背衬(7)，其具体结构是在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有MPB83蛋白-胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有由纯化的MPB70蛋白构成的检测线(5)和由纯化的兔抗MPB83蛋白IgG构成的质控线(6)。上述材料除抗原和抗体以外，均购自Millipore公司。
制备上述检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条的方法，其步骤包括1)克隆牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白MPB83，转化大肠杆菌，得到保藏编号为CCTCCNOM206142的重组大肠杆菌并使其表达；2)将步骤1)所述的MPB83蛋白和保藏编号为CCTCC NOM205135的MPB70蛋白进行纯化；3)将步骤2)制备的MPB83蛋白免疫健康家兔，得到兔抗MPB83 IgG抗体；4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；5)将步骤2)制备的MPB83蛋白加入步骤4)制备的胶体金中，得到MPB83蛋白-胶体金标记物；6)将步骤5)制备的MPB83蛋白-胶体金标记物包被在结合垫(2)上；7)将步骤2)制备的MPB70蛋白包被在硝酸纤维素膜(3)上构成检测线(5)；并将步骤2)制备的兔抗MPB83蛋白的IgG包被在硝酸纤维素膜(3)上构成质控线(6)；8)在所述的PVC背衬(7)上按顺序依次粘附所述的样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)，得到所述的检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条。
本发明克隆了牛分枝杆菌特异性抗原MPB83的编码基因，构建了原核表达载体，使其在大肠杆菌中表达，对MPB83蛋白进行纯，备用。同时对MPB70蛋白也进行纯化，备用。选用提纯的MPB70作为检测线的包被抗原，用提纯的MPB83作为胶体金标记抗原，利用双抗原夹心来检测待测样品(血清)中的相应抗体，根据检测线条带颜色深浅或有无来判断待测样品液中是否含有MPB83和MPB70抗原的抗体。如果质控线上没有红色条带出现，则该试纸条失效(使用方法具体参见实施例)。
与现有国内外牛结核抗体检测试剂盒相比，本发明具有以下突出的优点1、本发明的检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条同时用到两个牛结核分枝杆菌分泌的抗原蛋白即MPB83和MPB70，因此既具有高特异性又具有高敏感性。
2、本发明的检测试纸条检测时间短(20分钟)且不需要任何特殊仪器、设备，检测成本低。
3、本发明的检测试纸条操作简便，不需由专业人员操作。
4、本发明的检测试纸条储存方便，对温度要求不高，在4～8℃下有效保存期可达两年；在室温下可保存12个月。


图1本发明的总体技术路线2本发明检测试纸条的组装示意中1为样品垫，2为结合垫，3为硝酸纤维素膜，4为吸收垫，5为检测线，6为质控线，7为PVC背衬图3本发明检测试纸条结果判定示意中A为阳性标准品结果，B为阳性样品结果，C为阴性样品结果，D、E为试纸条失效。
图4是本发明的载体构建物理图。
图5mpb83基因PCR扩增结果。
图中1，2，3扩增出的目的基因；MDL 2000的分子量标准图6重组质粒pET28a-mpb83酶切鉴定结果图中M1DL15000的分子量标准(由上到下依次为15000bp、10000bp、7500bp、5000bp、2500bp、1000bp、250bp)；M2DL2000的分子量标准(由上到下依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)；pBL21/pET28a(+)；rpBL21/pET28a-mpb83注编号1-4为来自不同单菌落的转化子；2号为酶切后鉴定正确的重组质粒图7是本发明诱导表达的牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白MPB83的SDS-PAGE电泳图，图7显示在不同IPTG诱导浓度和诱导时间下MPB83蛋白表达情况图8纯化的MPB83蛋白的SDS聚丙烯酰胺凝胶变性电泳中M蛋白质分子量标准；1，2提纯的MPB83蛋白图9纯化的MPB83蛋白的Western blot分析中M蛋白质分子量标准；1纯化的MPB83蛋白与牛结核病阴性血清作用；2纯化的MPB83蛋白与牛结核病阳性血清作用图10纯化的兔抗MPB83蛋白IgG的SDS聚丙烯酰胺凝胶变性电泳中M蛋白质分子量标准；1，2提纯的MPB83蛋白IgG具体实施方式
实施例1(制备实施例)(一)牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白MPB83基因的克隆及其在重组大肠杆菌中的表达和纯化1牛型分枝杆菌特异性抗原基因mpb83 cDNA序列的克隆
(1)PCR引物设计与合成根据Genbank中mpb83基因序列(登录号GI31794050)设计上下游引物。上游引物引入EcoRI酶切位点(如引物中的下划线所示)，设计6个保护碱基，下游引物引入HindIII酶切位点(如引物中的下划线所示)，设计6个保护碱基。本发明的引物由北京奥科生物公司合成。
mpb83上游引物5’-AGTTCAGAATTCATGATCAACGTTCAGGCCAAAC-3’mpb83下游引物5’-ACGTCGAAGCTTTTACTGTGCCGGGGGCATCA-3’(2)MPB83蛋白质编码基因扩增与处理将牛型分枝杆菌标准株((Mycobacterium bovis AF2122/97，该菌株由湖北出入境检验检疫局郭明星研究员惠赠，其基因序列已经在Genebank登录，登录号为NC002945)细菌培养物加少量双蒸水煮沸10min裂解菌体，离心后取上清液作为PCR模板。PCR扩增反应体系为10×Taq Buffer5.0μl，25mmol/LMgCl21.0μl，2mmol/LdNTPs 1.5μl，20μmol/L上、下游引物各1.0μl，TaqDNA聚合酶1.0μl，模板3μl，无菌双蒸水加至50μl。PCR反应条件94℃变性4min，进入30个循环(94℃变性30sec，60复性30sec，72℃延伸2min)，最后72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳分析，一条大小％660bp的mpb83基因片段(如附图5)。使用DNA凝胶快速回收试剂盒(购自上海生物工程公司)纯化mpb83基因片段。
2牛型分枝杆菌特异性抗原基因mpb83原核表达载体的构建(1)重组大肠杆菌Escherichia coliDH5α/pET28a-mpb83的构建将PCR产物进行回收，纯化后，与克隆载体pMD18-T(一个商业质粒载体，购买自大连宝生物有限公司)连接，转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆子，小量提取质粒，用限制内切酶对重组质粒进行酶切鉴定，经0.8％琼脂糖凝胶电泳，证实其大小与预期符合；经测序证实该片段无碱基误配。
用EcoRI和HindIII双酶切pET28a(+)(购自invitrogen公司)和PCR产物，用DNA凝胶快速回收试剂盒(购自上海生物工程公司)纯化回收，然后用T4ligase连接进行粘术端连接，16℃水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37℃培养，挑菌，提取重组质粒，酶切鉴定(如附图6)。该重组表达质粒被命名为pET28a-mpb83。
3重组大肠杆菌Escherichia coliBL21/pET28a-mpb83的构建(如附图4)将序列鉴定正确的重组表达载体pET28a-mpb83转化至大肠杆菌BL21(大肠杆菌菌株购自Stratagene公司)感受态细胞，涂布LB卡那霉素(至终浓度为50μg/mL)平皿，挑选平皿上单个阳性菌落(BL21/pET28a-mpb83)，接入LB液体培养基中37℃振荡培养至对数生长期(OD600＝0.6-0.8)，向培养基中加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达，然后进行SDS聚丙烯酰胺凝胶变性电泳和Western-blot检测(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主编，分子克隆实验指南，金冬雁，黎孟枫等译，第二版，科学出版社，北京，1992版)，同时将原载体pET28a同步转化至大肠杆菌BL21(DE3)细胞，作为空白对照菌(BL21/pET-28a)。
3牛型分枝杆菌特异性抗原蛋白MPB83的原核诱导表达(1)最佳诱导物浓度及最佳诱导时间的确定挑取单个重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET28a-mpb83菌落至5mL LB培养基，加卡那霉素至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养8小时后放4℃冰箱过夜。用含50μg/mL卡那霉素的LB培养基将该菌液按1∶100比例稀释后，分装至2支细菌培养瓶中(10mL/瓶)，置37℃摇床培养至对数生长期(OD600＝0.6-0.8)，加入诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度分别为0.4、0.8mol/L，分别在诱导后第0、1、2、3、4小时取1mL细菌培养物，12000r/min离心收集菌体，PBS漂洗沉淀并用50μL重悬，加入40μL2×SDS上样缓冲液和10uL DTT，100℃煮沸10min，取20μl进行SDS聚丙烯酰胺凝胶变性电泳分析(如附图7)(萨姆布鲁克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂斯T主编，《分子克隆实验指南》，第二版，北京科学出版社，1992版)。根据MPB83蛋白表达情况确定IPTG最佳诱导浓度为0.8mmol/L，最佳诱导时间为3小时。
(2)牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白MPB83的大量诱导表达和蛋白纯化从平皿上挑取单个菌落至5mL LB培养基，卡那霉素(Kan)至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养至混浊(约8小时)，放4℃冰箱过夜。取该菌液2mL加入200mLLB/Kan培养基中，置37℃摇床培养约3h至OD600＝0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.8mmol/L，继续诱导培养3h。
诱导的菌体经离心、超声波破碎后提取包涵体，经纯化、变性、复性和透析等处理后分装于-20℃保存备用。参照萨姆布鲁克J，弗里奇E F，曼尼阿蒂斯T主编，《分子克隆实验指南》，第二版，北京科学出版社，1992版报道的方法对纯化的蛋白(如附图8所示)进行westernblot分析，结果如附图9，证实该重组大肠杆菌可以特异性地表达牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白MPB83，表达的蛋白以包涵体的形式存在大肠杆菌BL21中，且具有免疫学活性。
(二)兔抗MPB83蛋白IgG的制备与提纯将纯化的MPB83蛋白免疫健康家兔，制备高特异性、高效价的兔抗MPB83蛋白高免血清，将含有MPB83抗体的兔血清4000r/min离心10分钟取上清按以下步骤提纯取10ml上清于4℃，12000r/min离心10分钟，弃杂质，然后加入40ml0.06M pH4.5的醋酸盐缓冲液，再在室温(25℃)下缓慢加入330μl辛酸，边滴加边搅拌。缓慢加入饱和硫酸铵至终浓度为45％，用0.01M PBS(pH7.4)溶解后透析过夜。SDS聚丙烯酰胺凝胶变性电泳分析(如附图10)显示有两条蛋白带，一条为IgG重链，一条为IgG轻链。用紫外分光光度汁测定纯化多抗在280nm和260nm波长时的光吸收值(OD)，按公式1.45×OD280-0.74×OD260计算多抗浓度。调整溶液体积，使其终浓度为10mg/ml。利用该抗体包被硝酸纤维素膜上的质控线。
(三)牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白MPB70基因的克隆及其在重组大肠杆菌中的表达和纯化牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白MPB70基因的克隆及其在重组大肠杆菌中的表达和纯化的方法步骤参见专利申请号为200510019996.1，发明名称为“一种适用于牛结核抗体检测的试剂盒及应用”说明书所公布的内容。
实施例2(制备实施例)牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白MPB83和MPB70抗体诊断试剂盒组装及制备方法1、试剂盒组装本发明的试剂盒组成如下样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)和PVC背衬(7)，具体结构和装配顺序是在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有MPB83蛋白-胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有纯化的MPB70蛋白构成的检测线(5)和纯化的兔抗MPB83蛋白IgG构成的质控线(6)。
2胶体金的制备用超纯水将1％氯金酸稀释成0.01％，置磁力加热搅拌器上搅拌煮沸，按每100ml 0.01％氯金酸加入2.0ml 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈橙红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，有效期一年。
3MPB83蛋白-胶体金标记物制备磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至6.5，按每ml胶体金加入2μL 500μg/mLMPB83蛋白，继续搅拌混匀30min，加入10％BSA至终浓度为1％，静置30min。12000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用0.02M pH9.0的硼酸盐缓冲液(配方硼酸0.1237g，PEG-200001g，用超纯水定容至1000ml，调pH至9.0)洗涤两次，用二十分之一初始胶体金体积的0.02MpH9.0的硼酸盐缓冲液(配方硼酸0.1237g，PEG-20000 1g，用超纯水定容至1000ml，调pH至9.0)将沉淀重悬，置4℃备用，有效期60天。
4结合垫的包被将结合垫浸泡于0.01M pH7.4磷酸缓冲液(配方及制备20g BSA，25g蔗糖，3g聚乙烯基吡咯烷酮(PVP-10)，0.2gNaN3NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，用超纯水定容至1000ml)中30min后，于37℃烘干。然后用Biodot点膜仪将制备好的MPB83蛋白-胶体金标记物均匀包被在结合垫上，每厘米结合垫包被9μlMPB83蛋白-胶体金标记物，真空干燥，真空封装，置4℃备用。
5样品垫的处理将样品垫浸泡于0.01M pH7.4磷酸缓冲液(配方及制备20g牛血清白蛋白(BSA)，25g蔗糖，3gPVP-10，0.2gNaN3，NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KH2PO40.2g，用超纯水定容至1000ml)中30min后，于37℃烘干，真空封装，置4℃备用。
6硝酸纤维素膜的包被用Biodot点膜仪将纯化的牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白MPB70(浓度为3mg/mL)包被于硝酸纤维素膜作为检测线，包被量为0.6μl/cm，检测线靠近结合垫端，距结合垫垫端约8mm；用Biodot点膜仪将纯化的兔抗MPB83蛋白的IgG抗体(浓度2mg/ml)包被于硝酸纤维素膜作为质控线，包被量为0.6μl/cm，质控线靠近吸水垫，距吸收垫约8mm，两线距离5～8mm。37℃烘干，封装备用。
7试纸条的组装将样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)按图2所示的顺序依次粘附在PVC背衬(7)上，切成3mm宽的小条，真空封装。4～8℃保存，有效期2年；常温保存，有效期12个月。
实施例3(应用实施例)牛结核抗体的免疫胶体金试纸条使用方法1、血清样品的预处理取牛血清样品经4000rpm/min离心10min去掉血细胞，20℃长期保存，4℃短期保存。
2、检测步骤用吸管吸取150μl待检血清缓慢滴加在胶体金试纸条的加样孔上，20分钟后观察结果。
3、结果判定如图3所示，若待测样品试纸条检测线颜色明显深于阳性标准品试纸条检测线颜色，同时质控线上出现红色条带则判断为阳性样品，即待测样品中有牛结核分枝杆菌特异性分泌蛋白MPB83和MPB70的抗体，说明该牛为结核病牛；若待测样品试纸条检测线无颜色出现，同时质控线上出现红色条带则判断为阴性样品，即待测样品中没有牛结核分枝杆菌特异性分泌蛋白MPB83和MPB70的抗体，说明该牛为结核阴性牛；若待测样品试纸条检测线颜色介于阳性标准品和阴性标准品试纸条检测线颜色之间，同时质控线上出现红色条带则判断为可疑样品，说明该牛疑似结核病；如果质控线上没有红色条带出现，则该试纸条无效。
实施例4(应用实施例)本发明的应用效果举例本实施例中所指的检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸检测方法参照实施例3所述的操作步骤，其检测结果如表1、表2和表3。
1、特异性试验按实施例3所述方法进行试验，检测牛结核阳性和牛结核阴性血清(由本实验室保存，经PPD皮试、ELISA、病理学和细菌学检验)、副结核病牛血清、布病牛血清、弓形虫病牛血清和口蹄疫牛血清(均购自中国兽医监察所)。试验结果(见表1)表明，副结核病牛血清、布病牛血清、弓形虫病牛血清和口蹄疫牛血清样品检测线均无颜色出现，同时质控线上出现红色条带。本发明试纸条与牛的其他疾病无交叉反应，显示本发明试纸条具有好的特异性。
表1本发明的试纸条的特异性试验

注“+”表示阳性，“-”表示阴性。
2、敏感性试验按实施例3所述方法进行试验，将10份牛结核阳性血清倍比稀释后用本发明研制的试纸条检测，并与本申请人在前研制出的间接血凝检测牛结核抗体的试剂盒(200510019996.1专利申请的试剂盒)和韩国同类试纸条进行比较(结果见表2)。比较结果显示本发明研制的试纸条敏感性明显高于200510019996.1专利申请的试剂盒(间接血凝)和韩国同类试纸条。
表2本发明试纸条与本申请人在前专利申请和韩国同类试纸条的敏感性试验结果

注表2中第1行的数字表示待检的从1份-10份阳性血清，表第2-4行的数字表示能检测到阳性最高稀释倍数。
3、与结核菌素皮内变态反应(TST)比较试验按实施例3所述方法进行试验，将61份临床牛血清样品用本发明研制的牛结核病抗体检测试纸条检测，并与TST方法做比较(结果见表3)。比较结果显示TST阳性牛9义，其中试纸条检测判断3头为阴性，阳性符合率为66.66％。TST阴性牛52头，其中试纸条检测判断43头为阴性，阴性符合率为82.69％。总符合率为80.33％。
表3本发明的试纸条与TST方法的比较

4、重复性试验按实施例3所述方法进行试验，将挑选的10份阳性和10份阴性样品使用5个不同批次(061201、061202、061203、061204、06 1205)的本发明研制的试纸条进行检测，结果显示该试纸条具有较好的重复性，变异系数＜10％(结果如表4-1和4-2所示)。
表4-1不同批次的本发明的试剂盒检测8份已知的阳性样品的结果

表4-2不同批次的本发明的试剂盒检测8份已知的阴性样品结果

5、保存期试验(1)高温条件下对本发明的试纸条的破坏作用将本发明研制的5批(批次号为060815、060930、061020、061112、061201)试纸条于37℃存放6天后，按实施例3所述方法进行试验，与保存在4℃的同批试纸条同时检测10份牛结核阴性血清和10份牛结核阳性血清。结果显示37℃作用6天对本发明的试纸条无破坏作用(如表5-1和5-2所示)表5-1高温(37℃作用6天)对本发明的试纸条破坏作用(阳性血清的检测结果)


表5-2高温(37℃作用6天)对本发明的试纸条的破坏作用(阴性血清的检测结果)

(2)室温保存期试验将同一批制备的本发明的试纸条，分别在4℃和室温保存1至12个月，于0个月、3个月、6个月、9个月和12个月取出，按实施例3所述方法进行试验，检测1份倍比稀释的阳性血清进行保存期敏感性试验，检测10份已知的阳性和阴性血清进行保存期特异性试验，观察其敏感性、特异性和稳定性，以确定试纸条的保存期。结果显示本发明的试纸条经室温保存12个月以上其特异性、敏感性均不发生改变(试验结果如5-3所示)。
表5-3不同保存期限内本发明的试纸条敏感性试验结果

表5-4不同保存期限内本发明的试纸条特异性试验结果

6、临床样品的检测按实施例3所述方法进行试验，对来自不同试验地区1004份牛血清进行检测，结果见表6。检测样品阳性率为5.26％-70.5％。临床应用证明本发明的试剂盒准确性、重复性、敏感性、特异性良好，适合临床大量血清抗体检测和疾病诊断，在清除牛结核病传染源和控制牛结核病的临床推广应用中具有重要的意义。
表6本发明的试纸条的临床应用情况

尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。
权利要求
1.表达牛分枝杆菌MPB83蛋白的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET28a-mpb83保藏在CCTCC，保藏编号CCTCC NOM206142。
2.包含权利要求1的检测试纸条。
3.权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述的试纸条是用于检测牛结核抗体的试纸条。
4.权利要求3所述的试纸条，包括样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)和PVC背衬(7)，其特征在于，在PVC背衬(7)上按顺序依次粘附有样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)；所述的结合垫(2)上包被有MPB83蛋白-胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜(3)上分别包被有纯化的MPB70蛋白构成的检测线(5)和纯化的兔抗MPB83蛋白的IgG构成的质控线(6)。
5.一种适用于检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条的制备方法，其步骤包括1)克隆牛型分枝杆菌特异性分泌蛋白MPB83，转化大肠杆菌，得到保减编号为CCTCCNOM206142的重组大肠杆菌并使其表达；2)将步骤1)所述的MPB83蛋白和保藏编号为CCTCC NOM205135的MPB70蛋白进行纯化；3)将步骤2)制备的MPB83蛋白免疫健康家兔，得到兔抗MPB83 IgG抗体；4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；5)将步骤2)制备的MPB83蛋白加入步骤4)制备的胶体金中，得到MPB83蛋白-胶体金标记物；6)将步骤5)制备的MPB83蛋白-胶体金标记物包被在结合垫(2)上；7)将步骤2)制备的MPB70蛋白包被在硝酸纤维素膜(3)上构成检测线(5)；并将步骤2)制备的兔抗MPB83蛋白的IgG包被在硝酸纤维素膜(3)上构成质控线(6)；8)在所述的PVC背衬(7)上按顺序依次粘附所述的样品垫(1)、结合垫(2)、硝酸纤维素膜(3)、吸水垫(4)，得到所述的检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条。
6.权利要求1所述的重组大肠杆菌在制备牛结核抗体检测试纸条中的应用。
全文摘要
本发明属于动物细菌学与动物传染病学技术领域。具体涉及一种检测牛结核抗体的免疫胶体金试纸条及其制备方法。本发明的试纸条是由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC背衬组装而成。在PVC背衬上按顺序依次粘附有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫；所述的结合垫上包被有MPB83蛋白－胶体金标记物；所述的硝酸纤维素膜上分别包被有由纯化的MPB70蛋白构成的检测线和由纯化的兔抗MPB83蛋白IgG构成的质控线。本发明还公开了牛分枝杆菌特异性抗原MPB83的制备。用于试纸条的特异性抗原之一的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/pET28a－MPB83保藏在CCTCC，保藏编号CCTCC NOM206142。本发明的试纸条具有特异性强，灵敏度高，可应用于牛结核抗体的检测。
文档编号C12R1/19GK1995332SQ20061016655
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月30日 优先权日2006年12月30日
发明者郭爱珍, 张书环, 陈焕春, 谭亚娣, 晁彦杰, 陈颖钰, 钦博, 吕文, 匡有吉 申请人:华中农业大学