专利名称：高免疫原性猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5和gp6基因的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及表达猪繁殖与呼吸综合征病毒E、 M蛋白的 GP5和GP6基因的核苷酸序列。
技术背景猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus ， PRRSV)引起的严重危害养猪业的传染病之一。目前用于 预防PRRSV的主要有灭活苗和弱毒苗，但存在免疫保护效果不好或散毒等危险，因 此迫切需要更安全、更有效的新型疫苗。PRRSV是有囊膜的单股线性正链RNA病毒，其基因组全长约15kb，包括9个 开放阅读框(ORFla、 ORFlb、 ORF2-ORF7)(Deas et al，1996; Snijder et al，1998)其中由 ORF5编码的E蛋白和由ORF6编码的M蛋白为PRRSV的主要结构蛋白，E蛋白和M蛋白 可以二硫键相连的异源二聚体存在于PRRSV病毒粒子表面，是PRRSV病毒侵入耙 向组织和细胞的必要条件(deVriesetal，1995; Mardassi et a1，1996) ，E蛋白诱导的抗 体具有最强的中和病毒能力(Pirzadehetal,1997,1998; Zhang etal， 1998; Weiland et al,1999)， M可以诱导细胞免疫。因此GP5、 GP6成为研制猪繁殖与呼吸综合征疫苗的主要候选基因。目前试验研究表明，利用天然的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、 GP6 基因构建的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠或猪均能产生一定水平的中和抗体和细胞免疫, 但普遍存在免疫水平较低，不能有效预防猪繁殖与呼吸综合征之不足。
发明内容
本发明的任务是提供一种经人工改造的猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基 因，使其具有较高的免疫原性之特点，从而为制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗提供更好 的抗原基因。实现本发明的方案是对表达猪繁殖与呼吸综合征病毒E、 M蛋白的GP5和GP6 基因的核苷酸序列进行改造，以提高二者的免疫原性，达到更好的免疫效果。利用本 发明提供的抗原基因制备的疫苗将用于本体动物猪体内，故本发明是在保证猪繁殖与 呼吸综合征病毒GP5和GP6基因所表达蛋白的氨基酸序列不变的前提下，用猪的偏爱 密码子替代猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、 GP6基因的天然密码子。具体技术方案是 在保证猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6蛋白氦基酸序列不变的前提下，采用猪偏爱 密码子替代天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基因的相应密码子，从而改造天然 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基因，并采用基因合成仪合成改造后的基因，以便 将其用于制备猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5、 GP6的DNA疫苗。实施本发明的具体步骤是用猪偏爱密码子替代天然猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5和GP6基因的相应密码子改造天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基因，并 采用基因合成仪合成改造后的基因(命名为GP5A和GP6A)。将改造后的GP5A和GP6A基因分别克隆到真核表达载体pcDNA3. 1和JN-1中构 建DNA疫苗，(JN-1质粒的酶切图谱见图16， JN-1的构建是在pCI-neo的基础上改 造其多克隆位点和复制原点而成)。用构建的pcDNA3. 1—GP5A、 pcDNA3. 1—GP6A、 JN-1-GP5A和JN-1-GP6A的DNA疫苗免疫BALB/c小鼠，通过间接ELISA及病毒微量 中和试验检测其免疫效果。本发明将猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因和GP6基因改造为在猪体内具有更强 免疫效果的优化基因，并证实在BALB/c小鼠体内其具有优良的免疫原性，从而为制备 猪繁殖与呼吸综合征疫苗提供了更好的抗原基因。
经实验证实与现有技术相比，改造后的GP5A和GP6A基因所诱导的ELISA抗体有 明显提高；所产生的中和抗体的效价有显著提高，表明本发明提供的改造后的GP5A 和GP6A基因具有高免疫原性。
图1为天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因序列；图2为利用猪偏爱密码子替代天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因相应的密 码子改造得到的GP5A序列；图3为天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP6基因序列；图4为利用猪偏爱密码子替代天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP6基因相应密码 子改造得到的GP6A序列；图5为GP5A PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图，其中M为DL2000Marker， 1为GP5A 序列片断；图6为重组质粒pcDNA3. 1—GP5A BamHI、 EcoRI双酶切鉴定结果，其中M为 DL2000Marker， 1和2分别为pcDNA3. 1—GP5A的两个克隆的酶切结果；图7为JN-1-GP5A的Nhel， Xbal双酶切鉴定结果，其中M为DL2000Marker， 1、 2、 3和4分别为JN-1—GP5A的四个克隆的酶切结果；图8为pcDNA3. 1—GP6AHindl11和EcoRI双酶切鉴定，其中M为DL2000Marker， 1、 2和3分别为JN-1--GP6A的三个克隆的酶切结果；图9为JN-1—GP6A Nhel和EcoRI双酶切鉴定的结果，其中M为DL2000Marker， 1为JN-1—GP6A的双酶切结果；图10为GP5相关重组质粒免疫小鼠的ELISA抗体；用GP5相关DNA疫苗免疫5 — 6周龄雌性BALB/c小鼠，分别于首免2、 4、 6周 尾静脉采血用于ELISA检测，Y轴表示各组小鼠产生的ELISA值(数值为各组小鼠的 算术平均值)，X轴表述免疫小鼠的组别。图11为GP6相关重组质粒免疫小鼠的ELISA抗体；用GP6相关DNA疫苗免疫5 — 6周龄雌性BALB/c小鼠，分别于首免2、 4、 6周 尾静脉采血用于ELISA检测，Y轴表示各组小鼠产生的ELISA值(数值为各组小鼠的
算术平均值)，x轴表述免疫小鼠的组别。图12为GP5相关重组质粒免疫小鼠的中和抗体；用GP5相关DNA疫苗免疫5 — 6周龄雌性BALB/c小鼠，分别于首免2、 4、 6周 尾静脉采血用于微量中和试验检测中和效价，Y轴表示各组小鼠产生的中和效价(数 值为各组小鼠中和效价的算术平均值)，X轴表述免疫小鼠的组别。图13为GP6相关重组质粒免疫小鼠的中和抗体；用GP6相关DNA疫苗免疫5 — 6周龄雌性BALB/c小鼠，分别于首免2、 4、 6周 尾静脉采血用于微量中和试验检测中和效价，Y轴表示各组小鼠产生的中和效价(数 值为各组小鼠中和效价的算术平均值)，X轴表述免疫小鼠的组别。图14为pUC57质粒的酶切图谱；图15为pcDNA3. 1质粒的酶切图谱；图16为JN-1质粒的酶切图谱；具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本说明是如何实现的，以下说明不用于 限制本发明的范围。实施例l.改造的GP5A和GP6A序列的合成。在保证猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6蛋白氨基酸序列不变的前提下，采用 猪偏爱密码子替代天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基因中相应密码子而改造 天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基因，改造后的基因分别相应称为GP5A和GP6A 基因，并采用基因合成仪合成改造后的基因，序列改造由本专利申请发明人完成，改造 后的优化GP5A和GP6A基因序列的合成工作委托GenScript公司完成，合成的序列克隆 在pUC57中。(pUC57的酶切图谱见图14)。GP5和GP6基因改造前后的序列分别见图1、图2、图3和图4。
实施例2. pcDNA3. 1—GP5A、 pcDNA3. 1—GP6A、 JN-1-GP5A和JN-1-GP6A重组质粒的构建质粒pcDNA3. 1购自invitrogen公司，酶切图谱见图15。JN-1的构建是在pCI-neo的基础上改造其多克隆位点和复制原点而成，酶切图 谱见图161. pcDNA3. 1—GP5A的构建 1) GP5A的PCR扩增以优化GP5A为基础，分别设计两对引物分别为GP5-AMN-f: 5'-CGGGATCCGCCACCATGGGCATGCTGGGCAAGTGCC-3'(划线部分为BamHI 酶切位点)GP5-AMN-r: 5' -GGAATTCTCACAGGCGGCCCCACTG-3，(划线部分为EcoRI酶切位点) 以GP5-AMN-f和GP5-AMN-r为引物，以pUC57-GP5A序列为模板进行PCR，反应体系为1 Ox LA PCR Buffer (Mg2+ plus)LATaq (Takara)dNTP(2.5mM)GP5-AMN-f(10" M)GP5-A画-r(10u M)pUC57-GP5AdH20反应参数为940C 940C 600C 720C 720C 40C5min 20 s 25 s 40s 3min2.50.2510.25 0.25 0.5Up to 2530cyclesPCR产物的W琼脂糖凝胶电泳结果表明扩增出约600bp的片段，与预期大小一致 (见图5)。2) pc腿3. 1一GP5A的构建将GP5A的PCR产物割胶回收后，连接到pMD-19T载体构建为pMD-19T—GP5A， 转化DH5a，挑取克隆进行酶切鉴定并测序,测序结果表明，GP5A序列完全正确。用BamHI和EcoRI将pMD-19T—GP5A及目的载体pcDNA3. 1 (+)两步法双酶切，然后进行连接。连接反应体系为pMD-19T simple vector 0.5 u 1GP5A (PCR) 4.5 ulLigation solution I 5^1Total 10ul反应条件16t ,过夜。将连接产物转化至DH5a中，挑取克隆进行酶切鉴定，结果表明酶切片段与预期 大小一致(见图6)，重:组质粒pcDNA3. 1一GP5A构建成功。2. JN-l-GP5A的构建用Nhel和EcoRI将pcDNA3. 1-GP5A及目的载体JN-1两步法双酶切然后进行连接， 连接反应体系为，10x T4 DNA Ligase Buffer 1T4 DNA Ligase 1pcDNA3.) (B/E) 0.7TS-GP5A (B/E) 7.3Total 10ul反应条件16°C ，过夜。 将连接产物转化至DH5a中，挑取克隆进行酶切鉴定，结果表明酶切片段与预期大小 一致(见图7)，重组质粒JN-1—GP5A构建成功。JN-1的构建是在pCI-neo的基础上 改造其多克隆位点和复制原点而成。3. pcDNA3. 1—GP6A的构建用HindiII和EcoRI将pUC57-GP6及目的载体pcDNA3. 1 (+)两步法双酶切，然后 进行连接。连接反应体系为- Reagent Volume( u I)1 Ox T4DNALigase Buffer 1T4 DNA Ligase 1pcDNA3.1 (H/E) 0.7pUC57-GP6 (H/E) 7.3Total 10ul反应条件16t ，过夜。连接产物转化至DH5a中，挑取克隆进行HindIII和EcoRI双酶切鉴定，结果表 明酶切片段与预期大小一致(见图8)，重组质粒pcDNA3. 1—GP6A构建成功。 4. JN-1-GP6A的构建用Nhel和EcoRI将pcDNA3. 1-GP6及目的载体JN-1两步法双酶切，然后进行连接。连接反应体系为Reagent Volume( u I)1 Ox T4 DNA Ligase Buffer 1T4 DNA Ligase 1JN-1 (廳) 0.7pcDNA3.!-GP6 (N/E) 7.3Total 10ul反应条件16°C ，过夜。将连接产物转化至DH5 a中，挑取克隆进行Nhel和EcoRI 双酶切鉴定，结果表明酶切片段与预期大小一致(见图9)，重组质粒JN-1—GP6A构 建成功。实施例3. pcDNA3. 1—GP5A、 pcDNA3. 1—GP6A、 JN-1-GP5A和JN-1-GP6A重组质 粒免疫BALB/c小鼠。分别将5 6周龄的雌性BALB/c小鼠随机分成pcDNA3. 1、 pcDNA3. 1—GP5、 pcDNA3. 1—GP5A及pcDNA3. 1—GP6、 pcDNA3. 1—GP6A 、 JN-1-GP5A， JN-1, JN-1-GP5 及JN-1-GP6A， JN-1-GP6十个免疫组，每组5只。以每只100ug (100 uL体积)的 量经后腿肌肉注射免疫小鼠，共免疫2次，间隔2周。于首免后第2、 4、 6周尾部负 压采血分离血清。实施例4.免疫小鼠血清抗体的检测
用ELISA方法检测血清中GP5及GP6特异性ELISA抗体。其中以pGEX-4T-2原核表达 的GST-GP5和GST-GP6融合蛋白作抗原包被酶标板， 一抗为待检血清，二抗为服P标记的 羊抗鼠IgG。以PRRSV疫苗免疫的小鼠血清作为阳性对照，先用棋盘滴定法确定最佳的 抗原包被浓度和血清稀释倍数。然后用建立的标准ELISA方法检测免疫组小鼠的ELISA 抗体(结果见图IO、图ll)。
用微量中和试验检测血清中针对PRRSV的中和抗体。其中将被检血清于56"C灭活 30min后，在96孔细胞培养板中将血清作连续2倍的倍比稀释，从l : 2至l : 128 ， 每孔50uL ; PRRSV病毒液为100TCID50 ,于37"€，5%(:02培养箱中作用1小时，再于每 孔中滴加2X105个/mL的Marc—145细胞悬液100uL ，继续培养4一5天，观察细胞 病变情况并记录中和效价，以能完全保护细胞不发生病变的血清最高稀释倍数为其中 和效价(结果见图12、图13)。
棋盘法确定的最佳抗原包被浓度为O. 1 u g/ml，血清稀释倍数为l: 200， ELISA结 果表明改造的DNA疫苗pcDNA3. 1—GP5A、 pcDNA3. 1—GP6A、 JN-1-GP5A禾口JN-1-GP6A 的免疫组诱导的ELISA抗体要明显高于未改造的DNA疫苗pcDNA3. 1 — GP5、 pcDNA3. 1 —GP6、 JN-1-GP5和JN-1-GP6免疫组(P 〈 0. 05) ; pcDNA3. 1—GP5A、 pcDNA3. l — GP6A与JN-1-GP5A和JN-1-GP6A抗体水平相差不大，空载体对照免疫组没有检测到抗 体，表明GP5A和GP6A具有更好的免疫原性。(见图10、图ll)。
微量中和试验表明在二免后2周各组鼠血清在Marc—145细胞上检测中和抗体 效价(结果见图12和图13)， pcDNA3.1—GP5免疫组可刺激小鼠产生中和抗体(平均值 为l : 20 )， pcDNA3. 1—GP5A可将中和抗体效价提高到1 : 32与pcDNA3. 1—GP5免疫 组差异显著；JN-l-GP5免疫组可刺激小鼠产生中和抗体(平均值为l : 19.2 )， JN-l-GP5A免疫可将中和抗体效价提高到l : 32，与JN-1-GP5组差异显著(P〈0.05); pcDNA3. 1—GP6免疫组可刺激小鼠产生中和抗体(平均值为l : 9.4 )， pcDNA3. l —
GP6A可将中和抗体效价提高到1 : 16，与pcDNA3. 1—GP6免疫组差异显著(P〈0.05); JN-1-GP6免疫组可刺激小鼠产生中和抗体(平均值为1 : 10.6 )， JN-l-GP6A免疫组 可将中和抗体效价提高到l : 16，与JN-1-GP6组差异显著(P〈0.05);空载体对照组 血清l : 2稀释时没有检测到中和抗体。以下为本发明专利申请所涉及的核苷酸序列和氨基酸序列的序列表 序列1为天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因序列；序列2为天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因编码的氨基酸序列；序列3为改造后的GP5A基因序列；序列4为改造后的GP5A基因编码的氨基酸序列；序列5为天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP6基因序列；序列6为天然猪繁殖与呼吸综合征病毒GP6基因编码的氨基酸序列；序列7为改造后的GP6A基因序列；序列8为改造后的GP6A基因编码的氨基酸序列。 序歹U表<110〉国营武昌造船厂<120>高免疫原性猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5和GP6基因 <130> 1 <160> 8〈170〉 Patentln version 3.1<210> 1<211〉 603<212> 腿<213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <220〉<221> CDS<222〉 (1).. (603) <223〉<400> 1atg ttg ggg , tgc ttg Met Leu Gly Lys Cys Leu 1 5ttg tgg tgt ate gtg ccg Leu Trp Cys lie Va] Pro 20aac aac age age tct cat Asn Asn Ser Ser Ser His 35gag ctg aat ggc aca gat Glu Leu Asn Gly Thr Asp 50gag act ttt gtc ate ttc Glu Thr Phe Val lie Phe 65 70gca etc acc acc age cat Ala Leu Thr Thr Ser Hisacc gcg ggc tgt tgc teg cga ttg ctt tct 48 Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser 10 15ttc tat ctt get gtg etc gtc aac gcc age 96 Phe Tyr Leu Ala Val Leu Val Asn Ala Ser 25 30att cag ttg att tat aac ttg acg eta tgt 144 lie Gin Leu lie Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 40 45tgg ctg gca aaa aat ttt aac egg gca gtg 192 Trp Leu Ala Lys Asn Phe Asn Arg Ala Val 55 60ccc gtg ttg act cac att gtt tec tat ggg 240 Pro Val Leu Thr His lie Val Ser Tyr Gly 75 80ttc ctt gac aca gtt ggt ctg gtc act gtg 288 Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95tcc acc gcc gga tat tat cac agg egg tat gtc ttg agt age att tac 336Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Arg Arg Tyr Val Leu Ser Ser lie Tyr100 105 110gca gtc tgt get ttg get gcg ctg att tgt Ut gtc att agg ctt gcg 384Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie Cys Phe Val lie Arg Leu Ala 115 120 125aag aac tgc atg tcc tgg cgc tac tct tgc acc aga tat acc aac ttc 432Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140ctt ctg gac act aag ggc aaa etc tat cgt tgg egg teg ccc gtc att 480Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val lie 145 150 155 160gtg gag a幼ggg ggt aag gta gag gtc gaa ggt cac ctg ate gac etc 528Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu lie Asp Leu 165 170 175aag aga gtt gtg ctt gat ggt tcc gtg gca acc cct tta acc aga gtt 576Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val180 185 190tea gcg gaa caa tgg ggt cgt ctt tag 603 Ser Ala Glu Gin Trp Gly Arg Leu 195 200<210> 2 <211> 200 〈212〉 PRT<213> Porcine reproductive and respiratory syndrome virus <400> 2Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser 15 10 15Leu Trp Cys lie Val Pro Phe Tyr Leu Ala Val Leu Val Asn Ala Ser 20 25 30 Asn Asn Ser Ser Ser His lie Gin Leu lie Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Lys Asn Phe Asn Arg Ala Val 50 55 60Glu Thr Phe Val lie Phe Pro Val Leu Thr His lie Val Ser Tyr Gly 65 70 75 80Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95Ser Thr Als Gly Tyr Tyr His Arg Arg Tyr Val Leu Ser Ser lie Tyr 100 105 110Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie Cys Phe Val lie Arg Leu Ala 115 120 125Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val lie 145 150 155 160Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu lie Asp Leu 165 170 175Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro Leu Thr Arg Val 180 185 190Ser Ala Glu Gin Trp Gly Arg Leu 195 200 <210> 3〈211〉 636<212> 腿 〈213〉人工序列<220〉〈221> CDS<222〉 (14).. (616)<223><400> 3gtttaaaccc acc atg ctg ggc卿tgc ctg acc gcc ggc tgc tgc tcc 49Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser 1 5 10egg ctg ctg tcc ctg tgg tgc ate gtg ccc ttc tac ctg gcc gtg ctg 97 Arg L>eu Leu Ser Leu Trp Cys lie Val Pro Phe Tyr Leu Ala Val Leu 15 20 25gtg aac gcc age aac aac age tcc tcc cac ate cag ctg ate tac aac 145 Val Asn Ala Ser Asn Asn Ser Ser Ser His lie Gin Leu lie Tyr Asn 30 35 40ctg acc ctg tgc gag ctg aac ggc acc gac tgg ctg gcc aag aac ttc 193 Leu Thr Leu Cys Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Lys Asn Phe 45 50 55 60aac cgc gcc gtg gag acc ttc gtg ate ttc ccc gtg ctg acc cac ate 241 Asn Arg Ala Val Glu Thr Phe Val lie Phe Pro Val Leu Thr His lie 65 70 75gtg age tac ggc gcc ctg acc acc tcc cac ttc ctg gac acc gtg ggc 289 Val Ser Tyr Gly Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly 80 85 90ctg gtg acc gtg age acc gcc ggc tac tac cac cgc cgc tac gtg ctg 337 Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Arg Arg Tyr Val Leu 95 100 105tcc tcc ate tac gcc gtg tgc gcc ctg gcc gcc ctg ate tgc ttc gtg 385 Ser Ser lie Tyr Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie Cys Phe Val 110 115 120ate cgc ctg gcc aag aac tgc atg tcc tgg cgc tac tcc tgc acc cgc 433 lie Arg Leu Ala Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg 125130135140tac acc aac ttc ctg ctg gac acc aag ggc aag ctg tac egg tgg cgc Tyr Thr Asn Phe Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg 145 150 155481tec ccc gtg ate gtg gag aag ggc ggc aag gtg gag gtg gag ggc cac Ser Pro Val lie Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His 160 165 170529ctg ate gac ctg aag cgc gtg gtg ctg gac ggc age gtg gcc acc ccc Leu lie Asp Leu l,ys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro 175 180 185577Ctg 3CC CgC gtg tCC gCC g3g C3g tgg ggC CgCLeu Thr Arg Val Ser Ala Glu Gin Trp Gly Arg 190 195ctg tga aaaaaaaaaaLeu200626aaggcgcgcc636<210> 4<211〉 200<212> PRT <213>人工序列<400> 4Met Leu Gly Lys Cys Leu Thr Ala Gly Cys Cys Ser Arg Leu Leu Ser 15 10 15Leu Trp Cys lie Val Pro Phe Tyr Leu Ala Val Leu Val Asn Ala Ser 20 25 30Asn Asn Ser Ser Ser His lie Gin Leu lie Tyr Asn Leu Thr Leu Cys 35 40 45Glu Leu Asn Gly Thr Asp Trp Leu Ala Lys Asn Phe Asn Arg Ala Val 50 55 60Glu Thr Phe Val lie Phe Pro Val Leu Thr His lie Val Ser Tyr Gly65 70 75 80Ala Leu Thr Thr Ser His Phe Leu Asp Thr Val Gly Leu Val Thr Val 85 90 95Ser Thr Ala Gly Tyr Tyr His Arg Arg Tyr Val Leu Ser Ser lie Tyr 100 105 110Ala Val Cys Ala Leu Ala Ala Leu lie Cys Phe Val lie Arg Leu Ala 115 120 125Lys Asn Cys Met Ser Trp Arg Tyr Ser Cys Thr Arg Tyr Thr Asn Phe 130 135 140Leu Leu Asp Thr Lys Gly Lys Leu Tyr Arg Trp Arg Ser Pro Val lie 145 150 155 160Val Glu Lys Gly Gly Lys Val Glu Val Glu Gly His Leu lie A印Leu 165 170 175Lys Arg Val Val Leu Asp Gly Ser Val Ala Thr Pro !Leu Thr Arg Val 180 185 190Ser Ala Glu Gin Trp Gly Arg Leu 195 200<210> <211〉 <212> <213><220> <221〉 <222> <223>5438 DNAPorcine reproductive and respiratory syndrome virusCDS(l).. (438)
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Gly Arg Lys Ala Val Lys Gin Gly Val Val Asn Leu Val Lys Tyr Ala 130 135 140Lys 14权利要求
1. 一种经改造的具有高免疫原性的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋白的GP5基因，具有序列表中序列3所述的核苷酸序列。
2. —种经改造的具有高免疫原性的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋白的GP6 基因，具有序列表中序列7所述的核苷酸序列。
3. 含有权利要求1所述的具有高免疫原性的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋 白的GP5基因的表达载体。
4. 含有权利要求2所述的具有高免疫原性的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋 白的GP6基因的表达载体。
5. 含有权利要求1所述的具有高免疫原性的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋 白的GP5基因的重组质粒pcDNA3. 1—GP5A或JN-1-GP5A。
6. 含有权利要求2所述的具有高免疫原性的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋 白的GP6基因的重组质粒pcDNA3. 1—GP6A或JN-1-GP6A。
7. 获取权利要求1所述的具有高免疫原性的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋 白的GP5基因的方法，其特征在于，在保证猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因所表 达蛋白的氨基酸序列不变的前提下，用猪的偏爱密码子替代猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP5基因的天然密码子。
8. 获取权利要求2所述的具有高免疫原性的表达猪繁殖与呼吸综合征病毒M蛋 白的GP6基因的方法，其特征在于，在保证猪繁殖与呼吸综合征病毒GP6基因所表 达蛋白的氨基酸序列不变的前提下，用猪的偏爱密码子替代猪繁殖与呼吸综合征病毒 GP6基因的天然密码子。
全文摘要
本发明在保证猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因或GP6基因所表达蛋白的氨基酸序列不变的前提下，用猪的偏爱密码子替代猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5或GP6基因的天然密码子，本发明将猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因和GP6基因改造为在猪体内具有更强免疫效果的优化基因，并证实在BALB/c小鼠体内其具有优良的免疫原性，从而为制备猪繁殖与呼吸综合征疫苗提供了更好的抗原基因。
文档编号C12N15/33GK101210249SQ20061016661
公开日2008年7月2日 申请日期2006年12月31日 优先权日2006年12月31日
发明者余铭恩, 孙永林, 封江南, 王忠德, 佳 魏 申请人:国营武昌造船厂