专利名称：：编码多小片段rna载体在基因干扰与基因激活中的应用的制作方法编码多小片段RNA载体在基因干扰与基因激活中的应用
技术领域：
本实用新型涉及生物技术，特别涉及RNA干扰和RNA激活技术。尤其涉及将编码多条(2条或以上)小片段RNA的载体中用于对同一或不同基因的激活，或是用于对不同基因分别进行基因干扰和基因激活的应用。技术背景RNA干扰技术1998年被发现，2001年5月被成功用于哺乳动物细胞，开始了RNA干扰技术的广泛应用。RNA干扰技术是利用21nt或29nt的双链RNA对目的基因进行封闭，达到干扰目的基因的作用。RNA干扰是生命最为古老的基因免疫监视机制。生命维持健康、抗御病毒侵入、抗肿瘤发生以及维持遗传稳定等等都可能是依靠RNA干扰实现的，所以，对RNA干扰的研究和RNA干扰技术的应用受到空前的瞩目。RNA干扰技术成功应用当年(2001年)就排在纳米技术之后被评为世界十大技术进步的第二位。2002年又被评为十大技术进步的第一位。RNA干扰技术正在飞速发展，2001年5月第一次哺乳动物细胞应用时是采用的化学合成的双链RNA，一年后推出了生物转录合成的双链RNA，2003年以后越来越多的人开始使用质粒载体表达的双链RNA。一直以来，科学家认为RNA分子只能引起RNA干扰现象，即抑制基因表达。我国科学家，现任美国加州大学旧金山分校助理研究员李龙承博士于2006年首次证实RNA分子在人细胞中还具有基因激活功能，它能命令细胞在短时间内大量生产某个"有利"基因，比如在癌细胞中的抑瘤基因，从而达到治疗疾病的目的。11月3日出版的美国著名《科学》周刊对该发现详细地做了介绍。同日，这一成果的论文发表在《美国科学院院刊》杂志上。《科学》周刊评价说"如果该研究得到进一步确认，这项技术将成为一种强有力的生物学研究工具，而且一些疾病将得到全新治疗方法，比如癌症治疗。用"RNA干扰"治疗某一肿瘤时需要有明确的致癌基因作为攻击目标，但不是所有的肿瘤能找到致癌基因；而"RNA激活"则可以通过选择性的激活或增强某个抑瘤基因的表达，来遏制肿瘤生长，但同样的问题则是并非所有的肿瘤能找到抑癌基因。所以具体采用哪一种方案，则要依问题的具体情况而定。此外在许多应用环境中仅针对单一位点或是单独应用的"RNA干扰"或"RNA激活"往往效果不理想或是作用有限，特别是在某些代谢途径中存在多个环节，或是多个替代途径时，对单一环节的调节或是仅仅对一个途径的调节往往不足以达到预期目的。在这些情况下，一种能够将这两种机制的效果加强或是将两种机制结合起来的方案，将更有利于将RNA的调节作用应用于科研及医疗领域。
发明内容本发明的目的是高效稳定地制备能够同时编码多条小片段RNA的载体，并将其(1)应用于同一或不同基因的激活，以期达到对关键基因表达的有效激活；或(2)用于对多个基因分别进行干扰或激活；(3)无论是针对单一基因或是多个基因，也无论是用于RNA干扰或是RNA激活在，对于每个目的基因都可以有多个小片段RNA与其作用来降低筛选周期或是增强调节效果。实现本发明的技术方案是(1)根据应用目的来确定目的基因的调节方案(干扰或激活)并设计每个基因所对应小片段RNA的数量，按照文献或经典设计原则选取各自的耙位点。(2)化学合成编码各小片段RNA所需的DNA模板并构建入多小片段RNA表达载体中。(3)将构建的多小片段RNA表达载体根据需要用合适的方式应用于实验对象(如细胞、组织或是活体)并测定应用结果。本发明的有益效果(1)本发明中对任意基因的调节作用既可以是干扰也可以是激活，从而更有利于利用现有的基因研究成果，将小片段RNA的调节机制应用于科研或临床，即当前只要已知一个或数个和研究或疾病相关的基因时，无论它们是有正面作用还是负面作用，用本发明方法都可以有效利用这些信息对有正面作用的进行激活，对有负面作用的进行干扰。(2)因当前RNA
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的局限，要达到有效的RNA干扰或激活，往往需要设计多个靶位点进行筛选；而将本发明提供的编码多小片段RNA载体应用于RNA干扰或激活时，同时多片段的应用可以减少筛选难度，在大多数情况下甚至可以避免筛选过程而一次达到预期效果，这对于当前成本高昂的生物科研及应用而言，可以显著降低科研成本及周期。(3)当将多个筛选有效的RNA片段构建在同一载体时，其干扰或激活效果往往因协同作用而较之单一片段有所增强，特别是在几个片段单独作用效果都不是很高时这种增强效果尤其明显。(4)生物代谢途径是具有多组分性的，本实用新型可对同一途径链上的多个重要环节进行有针对性的干扰或激活，多基因协同作用，为更好的应用效果提供了空间。(5)许多的生物代谢途径中有多个替代路线，如果只对一个路线进行调节，因别的替代路线会在此时发挥作用，所以在些情况下很可能达不到应用目的或者是作用非常有限。而本发明则提供了一种方案可以对一个途径的不同路线进行全面的调控从而确保预期目标的实现。下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。图1为质粒载体pG4-template的示意图，该载体中带有PCR扩增所需要的模板Promoter2及Promoter3。图2为用PCR的方式将化学合成的DNA模板引物引入多小片段RNA表达框的流程。图3为编码多小片段RNA的载体pGenesi1-4的结构示意图。图4为用内切酶Bbsl消化第四轮PCR片段FRAG4及pGenesi1-4，并将需要片段连接起来的流程示意图。图5为用Apal酶切重组质粒pGenesi1-4-SVV12-ECD34后经1%Agarose凝胶电泳结果图，图中1:DL2000Marker:2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp;2:PGenesi1-4-SVV12-ECD34-1;3:PGenesi1-4-SVV12-ECD34-1Apal;4:PGenesi1-4-SVV12-ECD34-2;5:PGenesi1-4-SVV12-ECD34-2Apal;6:PGenesi1-4-SVV12-ECD34-3;7:PGenesi1-4-SW12-ECD34-3Apal。图6为RT-PCR检测Survivin基因及E-cadherin基因在mRNA水平表达情况的结果，图中1为空白转染对照；2为编码非特异小片段RNA的阴性对照；3为转染编码干扰Survivin的单一小片段RNA的pGenesil-1-SVV1;4为转染编码干扰Survivin的单一小片段RNA的pGenesil-1-SVV2;5为转染pGenesil-4-SVV12-ECD34;6为空白转染对照；7为编码非特异小片段RNA的阴性对照；8为转染编码激活E-cadherin的单一小片段RNA的pGenesil-1-ECD1;9为转染编码激活E-cadherin的单一小片段RNA的pGenesil-1-ECD2;10为转染pGenesil-4-SVV12-ECD34。图7为用Western杂交检测Survivin基因及E-cadherin基因在蛋白水平表达情况的结果，图中l为空白转染对照；2为编码非特异小片段RNA的阴性对照；3为转染编码干扰Survivin的单一小片段RNA的pGenesil-1-SVV1;4为转染编码干扰Survivin的单一小片段RNA的pGenesil-1-SVV2;5为转染pGenesil-4-SVV12-ECD34;6为空白转染对照；7为编码非特异小片段RNA的阴性对照；8为转染编码激活E-cadherin的单一小片段RNA的pGenesil-1-ECD1;9为转染编码激活E-cadherin的单一小片段RNA的pGenesil-1-ECD2;10为转染pGenesil-4-SVV12-ECD34。图8为根据MTT的检测结果绘制的细胞生产曲线图，图中MK为空白转染对照；NC为编码非特异小片段RNA的阴性对照；Sl为转染编码干扰Survivin的单一小片段RNA的pGenesil-1-SVV1;S2为转染编码干扰Survivin的单一小片段RNA的pGenesil-l-SVV2;El为转染编码激活E-cadherin的单一小片段RNA的pGenesil-l-ECD1;E2为转染编码激活E-cadherin的单一小片段RNA的pGenesil-1-ECD2;G4为转染pGenesil-4-SVV12-ECD34。图9为流式细胞仪检测PI染色的PC-3细胞周期结果，图a为空白转染对照；图b为编码非特异小片段RNA的阴性对照；图c为转染编码干扰Survivin的单一小片段RNA的pGenesil-1-SVV1;图d为转染编码干扰Survivin的单一小片段RNA的pGenesil-1-SVV2;图e为转染多小片段RNA的重组质粒pGenesil-4-SVV12-ECD34。图10:根据流式细胞仪检测PI染色的PC-3细胞周期得出的细胞凋亡结果分析柱形图，图中MK为空白转染对照；NC为编码非特异小片段RNA的阴性对照；SI为转染编码干扰Survivin的单一小片段RNA的pGenesil-1-SVV1;S2为转染编码干扰Survivin的单一小片段RNA的pGenesil-1-SW2;G4为转染pGenesil-4-SVV12-ECD34。具体实施方式下面通过具体的实施例进一步说明本发明是如何实现的，以下实例不用于限制本发明的范围。实施例制备编码四条小片段RNA的质粒载体，并应用于同时对Survivin基因的干扰和对E-cadherin基因的激活。1.各基因RNA调节机制及靶位点设计本实例将应用编码四条小片段RNA的质粒载体应用于对前列腺癌细胞株PC-3中的Survivin及E-cadherin基因进行调节，因为对PC-3中Survivin基因的抵制会导致细胞凋亡且对E-cadherin基因的表达激活会抑制细胞增殖，本实例中对Survivin基因应用RNA干扰，对E-cadaherin应用RNA激活，从而以诱导PC-3细胞凋亡和抵制其增殖的双重手段来控制该癌细胞生长。每个基因各应用两个文献已经公布的靶位点进行攻击。shRNAl及shRNA2用于Survivin的干扰，shRNA3及shRNA4用于E-cadaherin的激活。各靶位点的序列为-shRNAl:5'-GGACCACCGCATCTCTACA-3，shRNA2:5GCATTCGTCCGGTTGCGCT-3'shRNA3:5AGAACTCAGCCAAGTGTM-3'shRNA4:5'-AACCGTGCAGGTCCCATAA-3'2.编码4条小片段RNA的载体构建-2.1合成编码小片段RNA的DNA模板各DNA模板的序列为Fl:5GGACAGCACACAGCGCAACCGGACGAATGCGGTGTTTCGTCCTTTC-3，Rl:5TAATCTCTTGAATTACACTTGGCTGAGTTCTGGGAAAGAGTGATC-3'F2:5GCTCAGCGGAGAAAAAGCATTCGTCCGGTTGCGCTGGACAGCACAC-3'R2:5TTCAGTCCGAGAAAAAAGAACTCAGCCAAGTGTAATCTCTTGAA-3，F3:5(_CTTCCTGTCATGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTTGCTCAGCGGAG-3，R3:5<-AATTGATATCCGTTATGGGACCTGCACGGTTTTTTTCAGTCCGAG-3'F4:5CGTGTAGAAGACAATTTGGGACCACCGCATCTCTACACTTCCTGTCA-3'R4:5GCAGTGAAGACTTCCTCAACCGTGCAGGTCCCATAATTGATATCCG-3,2.2用PCR的方式构建所有小片段RNA在一起的表达框，PCR过程详见附图2。2.2.1分别以F1、Rl为上下游引物，以质粒PG4-te卿lete(载体结构详见图1)为模板，用PfuTurbo(Stratagene)来扩增FRAG1片段反应体系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>反应条件950C950C600C5min30s30s、>25乂cycles68t50s720C5min4('C"/Agarose凝胶电泳，切胶回收FRAG1片段2.2.2以回收的FRAG2为模板，分别以F2、R2为上下游引物，用PfuTurbo(Stratagene)来扩增FRAG2片段，PCR反应条件一样;2.2.3同样依次以F3、R3、F4、R4为上下游引物，以回收的FRAG2、FRAG3为模板，用PfuTurbo(Stratagene)来扩增，最后得到FRAG4片段。2.3pGenesi1-4-SVV12-ECD34载体的构建2.3.1质粒pGenesi卜4(载体结构详见图3)、FRAG4片段的Bbsl酶切。2.3.2"^Agarose凝胶电泳，切胶回收所需酶切片段。2.3.3用胶回收质粒纯化试剂盒回收纯化并连接。2.3.4取10ul过夜连接产物转化感受态DH5a细胞，涂布于含Kana(终浓度为30ug/ul)抗性的LB平板上，37。C恒温箱培养过夜。2.3.5从平板上挑取3个单菌落接种于5ml含Kana(终浓度为30ug/ul)抗性的LB培养液中，37t:恒温摇床培养过夜。2.3.6用小规模质粒抽提试剂盒提取质粒，并分别用Apal做酶切鉴定酶切结果见附图5:结果表明酶切片段与预期大小一致，重组多小片段RNA质粒载体pGenesi1-4-SVV12-ECD34构建成功。3.对上述载体针对SURVIVIN基因的干扰及E-cadherin基因的激活的应用及效果检3.1将pGenesil-4-SVV12-ECD34载体及各对照载体用德国biontex公司的METAFECTENEPRO按照说明书所述转染PC-3细胞，培养48小时后用流式细胞仪通过载体上带的绿色荧光蛋白标签分选出转染入载体的细胞，将分选出的细胞用于后续实验。3.2用RT-PCR在mRNA水平来测定SURVIVIN基因及E-CADHERIN基因的表达情况。3.2.1按Invitrogen公司的产品说明用Trizol提取样品的总RNA。3.2.2进行逆转录反应反应体系ReagentVolume(ti1)10*AMVBuffer2AMVRTase(Takara)0.5HPR(Takara)0.5d證(10mM)1Oligo-dT1画5dH20(RNasefree)叩to20反应条件42°C45min，95°C5min3.2.3针对目的基因及内参基因进行PCR反应引物序列SurvivinForward:5ATGGGTGCCCCGACGTTG-3，SurvivinReverse:5'-CTCAATCCATGGCAGCCAGC-3，E-cadherinForward:5'-CCTGGGACTCCACCTACAGA-3'E-cadherinReverse:5GGATGACACAGCGTGAGAGA-3，GAPDHForward:5'-TCCCATCACCATCTTCCA-3，GAPDHReverse:5'-CATCACGCCACAGTTTCC-3，反应体系ReagentVolume(ii1)10*Buffer2.5T叫HS(Takara)0.25dNTP(2.5mM)1ForwardPrimer(10jiM)0.25ReversePrimer(10tiM)0.25c腿2dH20Upto25反应条件950C950C560C72C72')C4"C3.2.41%Agarose凝胶电泳PCR结果见附图6。5min30s30s30s5min、一32cycles图中结果表明单条pGenesil-4-SVV12-ECD34在mRNA水平对SURVIVIN有显著抑制同时对E-cadherin有显著激活，且较之编码单条小片段MA载体的调节效果有不同程度的增加。3.3Western杂交在蛋白质水平测定SURVIVIN基因及E-CADHERIN基因的表达情况。3.3.1提取细胞总蛋白将收集的细胞2000rpm离心lOmin，弃去大部分上清吹散重悬混匀。各取20y1样品，加入103XloadingBuffer,混匀，沸水浴lOmin，15000rpm离心5min。3.3.2配制SDS-PAGE电泳胶3.3.3进行垂直板凝胶电泳用微量注射器将蛋白样品等体积加入上样孔中，连接电源进行电泳。积层胶90V,当电泳至溴蓝从积层胶进入分离胶时，将电压调至140V。3.3.4电转移3.3.4.l从电泳装置上取下凝胶，去掉积层胶，浸入电转缓冲液平衡5分钟。3.3.4.2剪两张滤纸和一张PVDF膜，大小与凝胶吻合。将滤纸浸入电转液中，PVDF膜浸入100%甲醇5秒，去离子水漂洗一下，再放入电转缓冲液中平衡5分钟。3.3.4.3安装孔板，并与转移槽正负极相对，放入槽中，加入l*TransferBuffer电转缓冲液，接通电源，100mA恒流，转膜1.5小时.3.3.5杂交3.3.5.1将转好的PVDF膜浸入封闭液(l+TBST+5y。脱脂奶粉)，4。C过夜；3.3.5.21*TBST洗膜5minX4次；3.3.5.3加入一抗，室温摇床孵育2h;3.3.5.41*TBST洗膜5minX4次；3.3.5.5加入二抗室温摇床孵育lh;3.3.5.61*TBST洗膜5minX4次;3.3.6曝光3.3.6.1将PVDF膜置于S叩erSignal化学发光试剂中反应2min;3.3.6.2暗室中使X光片曝光，常规方法显影定影。结果见附图7。图中结果表明单条pGenesil-4-SVV12-ECD34在蛋白质水平对SURVIVIN有显著抑制，同时对E-cadherin有显著激活，且较之编码单条小片段RNA载体的调节效果有不同程度的增加。3.4用MTT实验来检测对SURVIVIN基因干扰及对E-Cadherin基因激活导致的对PC-3细胞生长情况的影响。3.4.1接种细胞:用完全培养液配成单层培养细胞悬液，以每孔103-104个细胞接种于96孔板中，每孔200"1;37度C02箱陪养24h。3.4.2培养细胞37度CC^箱陪养不同时间段.12h，24h，36h，48h,72h。3.4.3呈色每孔加入ratt溶液20yl(5mg/ml)，37度继续孵育4h，终止培养，小心吸弃孔中培养液上清。每孔加入150ulDMSO，震荡10niin，使甲臢产物充分溶解。3.4.4比色490nm波长，在酶标仪上测定吸光值。以时间为横轴，以吸光值为纵轴绘制细胞生长曲线。结果见表a、表b和附图8表a、表b为用MTT法检测pGenesil-4-SVV12-ECD34对PC-3细胞增殖情况的影响，其中表a为酶标仪的原始读值，表b中为两个重复样品的平均值。表a_时间12h24h36h4872样品SI+0176，+0243，+0332,+0399+0526,+0533+0706，+0701+1506,+薩S2+0205，+0224+0385+0304+0460+0473+0590+0583+1390+1233El+0222,+0231+0305，+0252+0510，+0507+0710，+0680+1410,+1480E2+0137,+0128+0258，+0249+0451，+0448+0610，+0591+1231,+1128G4+0102，+0!05+0235,+0241+0419，+0423+0534，+0546+0923,+0934NC+0204，+0220,+0410,+0407+0712，+0727+0852,+0867+1657，+1647MK+0322,+0293，+0720，+0550+0920,+08卯+1220，+1140+1866,+1851表bSlS2ElE2G4HKHC0h10810810810810810810812h209.5214.5226.5132.5103.5212307.524h365.5344.5278.5253.5238.5408.563548h529.5466.5508.5449.5421719.590536h703.5586.5695600.5535859.5118072h1553.5131L51445179.5928,516521858.5表中MK为空白转染对照；NC为编码非特异小片段RNA的阴性对照；Sl为转染编码干扰Survivin的单一小片段RNA的pGenesil-1-SVV1;S2为转染编码干扰Survivin的单一小片段RNA的pGenesil-1-SVV2;El为转染编码激活E-cadherin的单一小片段RNA的pGenesil-1-ECD1;E2为转染编码激活E-cadherin的单一小片段RNA的pGenesil-1-ECD2;G4为转染pGenesil-4-SVV12-ECD34。表及图中结果表明pGenesil-4-SVV12-ECD34对PC-3细胞的增殖有显著的负面影响，且较之编码单条小片段RNA载体的影响效果大。3.5用PI染色测PC-3细胞周期的方法来检测对SURVIVIN基因干扰及对E-CADHERIN基因激活后对PC-3细胞凋亡情况的影响。3.5.1取细胞样品5X105个，900rpmX5min离心，弃去培养液。3.5.2各管加入3mlPBS洗细胞一次。3.5.3900rpmX5min离心去PBS，加入预冷的70%的无水乙醇固定4度lh。3.5.4.900rpmX5min离心去固定液，3mlPBS重悬细胞5min。3.5.5.400目筛网过滤一次，1000rpmX5min离心，弃去PBS。3.5.6lmlPI染液重悬细胞，4度避光30min。3.5.7流式细胞仪检测PI用氩离子激发荧光，激发光波为488nm，发射光波长大于630nm，产生红色荧光。3.5.8记录及分析结果见附图9及附图10图中结果表明pGenesil-4-SVV12-ECD34显著诱导了PC-3细胞的凋亡，且较之编码单条小片段RNA载体的诱导效果大。权利要求1.一种将编码多条小片段RNA载体用于基因激活或同时用于基因干扰和基因激活的方法，包括以下步骤(1)根据应用目的来确定目的基因的调节方案，选择干扰或激活，并设计每个基因所对应小片段RNA的数量，按照文献或经典设计原则选取各自的靶位点；(2)化学合成编码各小片段RNA所需的DNA模板并构建入多小片段RNA表达载体中；(3)将构建的多小片段RNA表达载体应用于细胞、组织或动物及人体。2.根据权利要求1所述的一种将编码多条小片段RNA载体用于基因激活或同时用于基因干扰和基因激活的应用方案,其特征在于可将编码多条的小片段RNA载体应用于针对同一基因的多靶位点激活，或是针对不同基因同时进行激活，且在针对不同基因的同时激活时，对其中的任意基因也可以应用多条小片段RNA对其进行协同加强激活。3.根据权利要求1所述的一种编码多条小片段RNA载体用于基因激活或同时用于基因干扰和基因激活,其特征在于可将编码多条的小片段RNA载体应用于针对不同基因的调节，而且针对每个基因的调节既可以是干扰也可以是激活，即可同时针对A基因干扰，B基因激活，诸如此类，同时对其中的任意基因可以有多条小片段RNA来用于实现协同加强调节作用。4.根据权利要求1所述的一种编码多条小片段RNA载体用于基因激活或同时用于基因干扰和基因激活,其特征在于编码多条小片段RNA的载体上所用的启动子为完全不具有同源性或是同源性非常低的启动子，从而避免该载体在细胞内的同源重组。全文摘要本发明提供了一种将同时编码多小片段RNA的载体用于对同一或不同基因的激活，或是用于同时对不同基因分别进行基因干扰或基因激活的应用方法，包括以下步骤(1)根据应用目的确定目的基因的调节方案并设计每个基因所对应小片段RNA的数量，选取其靶位点；(2)合成编码各小片段RNA所需的DNA模板并构建入多小片段RNA表达载体中；(3)将构建的多小片段RNA表达载体根据需要用合适的方式应用于实验对象。本发明为将小片段RNA的特异性调节机制应用于科研及临床提供了一种方便有效的应用方案。文档编号C12Q1/68GK101210267SQ20061016661公开日2008年7月2日申请日期2006年12月31日优先权日2006年12月31日发明者俊严,余铭恩,吴琼杉,孙永林,封江南,廖桂红,超李,俊黄申请人:国营武昌造船厂