专利名称：：优化的小片段rna载体系统及其构建方法优化的小片段RNA载体系统及其构建方法
技术领域：
本实用新型涉及生物技术，特别涉及RNA干扰，尤其涉及一种RNA干扰用的优化(优化指为实现有益效果所进行的各项改造)型小片段RNA(100个bp以内的RNA)的载体系统及其构建方法。技术背景RNA—度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的"过渡"，但越来越多的证据清楚的表明，RNA在生命的进程中扮演的角色远比我们早前设想的更为重要。RNA干扰(RNAinterference)的发现使得人们对RNA调控基因表达的功能有了全新的认识。RNA干扰技术1998年被发现，2001年5月被成功用于哺乳动物细胞，开始了RNA干扰技术的广泛应用。RNA干扰技术是利用双链小片段RNA对目的基因进行封闭，达到干扰目的基因的作用。RNA干扰是生命最为古老的基因免疫监视机制。生命维持健康、抗御病毒侵入、抗肿瘤发生以及维持遗传稳定等等都可能是依靠RNA干扰实现的，所以，对RNA干扰的研究和RNA干扰技术的应用受到空前的瞩目。RNA干扰技术成功应用当年(2001年)就排在纳米技术之后被评为世界十大技术进步的第二位。2002年又被评为十大技术进步的第一位。RNA技术正在飞速发展，2001年5月第一次哺乳动物细胞应用RNAi时是采用的化学合成的双链RNA，一年后推出了生物转录合成的双链RNA，2003年以后越来越多的人开始使用质粒载体表达的双链RNA。但目前质粒载体存在着许多的技术缺陷及难点。当前主流的小片段RNA表达载体的构建方案中为了实现目的小片段RNA的模板DNA的在启动子3'端转录起始位点的准确插入大多是将启动子3'的部分碱基进行突变以引入一个酶切位点。此外，由于该模板DNA通常仅为六十个碱基左右，这为重组载体的酶切鉴定带来了困难，如在未经酶切鉴定的情况下直接进行DNA序列测定，过高的非重组率则会导致实验周期过长和经费的耗费。为了克服这一问题，在某些较新的方案中采用了在合成的DNA模板中引入额外的酶切鉴定位点，这在提供一个较好的鉴定方案的同时，却使得合成的DNA模板的碱基数超过了60个，从而导致DNA引物合成的成本及突变率有了较大程度的上涨。
发明内容本发明的目的构建一种高效稳定的编码小片段RNA的载体并提供其配套制备方案，以克服当前科研领域及市场中常规制备编码小片段RNA载体所面临的启动子3，端突变，构建过程中鉴定困难，合成模板DNA引物长，成本高等问题，同时以一种优化的结构使得转录小片段RNA的启动子有更高的转录效率。发明技术方案(1)以晶赛公司的编码多条shRNA质粒载体pEGFP6-1为骨架进行启动子序列，生物元件布局及筛选基因插入等一系列改造从而构建出优化的编码小片段RNA载体pGenesil-l.2。(2)化学合成编码各小片段RNA所需的DNA模板并构建入pGenesi1-1.2中，然后利用此系统中的双重筛选方案筛选克隆并经测序鉴定完成构建工作。(3)将构建成功的编码小片段RNA表达载体经多方面的有益性评价及实际应用效果测定。有益效果(1)本实用新型中利用BbsI,Esp3I,Bsal等限制性内切酶的消化位点在识别位点旁边且消化位点序列没有特异性的特性，在目的启动子的3'端用这些内切酶来引入插入编码小片段RNA的DNA模板所需的粘性末端，且末端碱基完全依照天然的启动子3'端序列，从而确保启动子3'端没有任何突变，这为启动子转录起始的稳定性和效率提供了保证；(2)本实用新型中利用BbsI,Esp3I，Bsal等限制性内切酶消化位点序列没有特异性的特点,在插入位点两侧设计为用同一种内切酶但消化出的粘性末端不同，从而在制备过程中只需用一种内切酶消化即可，从而减化载体消化步骤;(3)本实用新型的载体中在模板DNA插入位点中预先引入标签蛋白表达框，从而在很大程度上排除自身环化的非重组克隆，有效减少后期鉴定工作量；(4)本实用新型的载体中在DNA模板3'端的插入位点引入一种特殊设计，使得只有在化学合成的DNA模板成功插入载体形成正确的重组克隆后才会形成一个在原始模板对应位置所没有的位点，从而在未增加合成DNA模板碱基数的情况下提供了有效的酶切鉴定方案；(5)本实用新型的载体中对各功能元件进行了优化排布，从而在未增加任何功能元件的前提下，使CMV的增强子能为小片段RNA的启动子所用，提高其转录效率。图一为以pEGFP6-1为模板，用PCR的方法将CMV—EGFP—SV40表达框扩增出来的示意图，通过上游引物在此表达框5'端分别加入Asel，Bbs1②，EcoRI位点，并同时将CMV启动子5'端的AseI突变掉，通过下游引物在此表达框3'端加入Pstl位点。图二为通过Asel/Pstl双酶切线性化pEGFP6-1载体的示意图。图三为将线性化的pEGFP6-1及用Asel/Pstl消化的CMV—EGFP—SV40表达框连接起来构建新重组质粒载体PEGFP6-1-ml的示意图。图四为从人类基因组中扩增出U6启动子，通过上游引物在其5'端加入EcoRI位点，通过下游引物在此表达框3'端分别加入Bbs1①，SpeI,及SalI位点。然后用SalI，EcoRI位点将此启动子构建至pEGFP6-l-ml上，组成新的重组质粒载体pEGFP6-1-U6的示意图。图五为从pUC19simple中扩增出LAC启动子引导的LacZalpha表达框，通过上游引物在其5，端加入SpeI位点，通过下游引物在此表达框3'端加入SalI位点。然后用SpeI,SalI位点将此表达框构建至pEGFP6-1-U6上，组成新的重组质粒载体pGenesil-1.2的示意图。图六为用Bbsl消化pGenesil-1.2载体，因为在LacZ表达框两边各有一个Bbsl位点，故此表达框会从pGenesil-1.2上消化下来，由于此两个Bbsl设计的切割位点碱基不同，故载体两端的两个粘性末端是不同的，不会发生自身环化。图七为将退火好的编码shRNA的DNA引物通过两个与Bbsl粘性末端配对的末端连接入线性化的pGenesil-1.2中，构建成编码GAPDHshRNA的pGenesil-1.2-GAPDHsh。图八为在载体pGenesil-1.2及退火DNA模板原始位置处都无Bell位点，但两个配对的粘性末端结合后就组成了一个Bcll位点以用于重组子的鉴定。图九为用Bell酶切重组质粒后1%琼脂糖凝胶电泳图在pGenesil-1.2原始载体中位于EGFP3'端有一个唯一的BclI酶切位点，而当退火DNA模板插入后则会在插入DNA的3'端拼出一个新的Bell位点，这两个Bell位点之间的碱基数约为1.8kb。图中-1:DL2000Marker:2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、lOObp2:pGenesil-1.2-GAPDHsh-1Bell3:PGenesil-l.2-GAPDHsh-2Bell4:PGenesil-1.2-GAPDHsh-3Bell图十为RT-PCR检测GAPDH基因在mRNA水平表达情况的结果。图中1:空白转染对照2:编码非特异小片段RNA的阴性对照3:转染常规型编码干扰GAPDH的shRNA的pGenesil-1-GAPDHsh4:转染优化型编码干扰GAPDH的shRNA的pGenesil-1.2-GAPDHsh图十一为用Western杂交检测GAPDH基因在蛋白水平表达情况的结果。图中1:空白转染对照2:编码非特异小片段RNA的阴性对照3:转染常规型编码干扰GAPDH的shRNA的pGenesil-1-GAPDHsh4:转染优化型编码干扰GAPDH的shRNA的pGenesil-1.2-GAPDHsh图十二为使用常规突变型启动子的pGenesil-1与优化方案中使用完全天然启动子的pGenesil-1.2对十种细胞系中的GAPDH进行抑制的结果对比。具体实施方案下面通过具体的实施例进一步说明本实用新型是如何实现的，以下实例不用于限制本实用新型的范围。一.载体改造1.以晶赛公司编码多shRNA载体pEGFP6-1为骨架，在CMV的5'端引入多克隆位点，并消除U6启动子引导的shRNA表达框。1.1以pEGFP6-1为模板，将CMV-EGFP-SV40表达框PCR下来，并通过引物在PCR产物两端引入所需的酶切位点且把CMV5'端的Asel位点突变掉。1.1.l引物序列CES-f:5'-CATTAATGATCCTTGTCTTCGTCGACGAATTCTAGTTATTCATAGTAATCAATTACG-3，CES-r:5AACTGCAGGTTTGGACAAACCACAACTAG-3，1.1.2分别以CES-f、CES-r为上下游引物，以质粒pEGFP6-1为模板，用PfuTurbo(Stratagene)来扩增CMV-EGFP-SV40表达框片段(PCR示意见图一)1.2用Pstl/Asel两步法消化pEGFP6-1，回收大片段(见图二)，用Pstl/Asel两步法消化上一步中的PCR产物。1.3将上步中的酶切片段连接(见图三)，并取10ul过夜连接产物转化感受态DH5a细胞，涂布于含Kana(终浓度为30ug/ul)抗性的LB平板上，37。C恒温箱培养过夜。1.4从平板上挑取3个单菌落接种于5ral含Kana(终浓度为30ug/ul)抗性的LB培养液中，37°。恒温摇床培养过夜。1.5用小规模质粒抽提试剂盒提取质粒，并分别用EcoRI/Pstl双酶切鉴定重组质粒,选取阳性克隆进行DNA测序，将序列完全正确的命名为pEGFP6-l-ml2.在pEGFP6-1-ml中CMV的5，端插入hU6启动子引导的shRNA表达框。2.1从人基因组DNA中用PCR扩增hU6启动子，并通过引物在PCR产物两端引入所需的酶切位点。2.1.1引物序列hU6-f:5GGAATTCAAGGTCGGGCAGGAAGAGG-3，hU6-r:5GCGTCGACCGACTAGTGAAGACTCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC-3，2.2.2分别以MJ6-f、hU6-r为上下游引物，以人基因组DNA为模板，用PfuTurbo(Stratagene)来扩增hU6表达框片段。2.2用EcoRI/Sa11两步法消化pEGFP6-l-ml及上一步的PCR产物，回收所需片段。2.3将上步中的酶切片段连接(见图四)，并取10ul过夜连接产物转化感受态DH5a细胞，涂布于含Kana(终浓度为30ug/ul)抗性的LB平板上，37'C恒温箱培养过夜。2.4从平板上挑取3个单菌落接种于5ml含Kana(终浓度为30ug/ul)抗性的LB培养液中，37"C恒温摇床培养过夜。2.5用小规模质粒抽提试剂盒提取质粒，并分别用EcoRI/Sa11双酶切鉴定重组质粒，选取阳性克隆进行DNA测序，将序列完全正确的命名为pEGFP6-1-U6。3.在pEGFP6-1-U6中hU6的3'端插入LAC启动子引导的LacZalpha片段表达框。3.1从晶赛公司的pUC19siraple(去除了pUC19的MCS)中用PCR扩增LacZalpha片段表达框，并通过引物在PCR产物两端引入所需的酶切位点3.1.1引物序列LacZ-f:5'-ACGCGTCGACGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGG-3，LacZ-r:5'-GGACTAGTTGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCC-3'3.2.2分别以LacZ-f、LacZ-r为上下游引物，以pUC19simple为模板，用PfuTurbo(Stratagene)来扩增hU6表达框片段。3.2用Spel/Sa11两步法消化pEGFP6-1-U6及上一步中的PCR产物，回收所需片段。3.3将上步中的酶切片段连接(见图五)，并取10ul过夜连接产物转化感受态DH5a细胞，涂布于含Kana(终浓度为30ug/ul)抗性的LB平板上，37。C恒温箱培养过夜。3.4从平板上挑取3个单菌落接种于5ml含Kana(终浓度为30ug/ul)抗性的LB培养液中，37X:恒温摇床培养过夜。3.5用小规模质粒抽提试剂盒提取质粒，并分别用Spel/Sa11双酶切鉴定重组质粒，选取阳性克隆进行DNA测序，将序列完全正确的命名为pEGFP6-L2。二.编码用于RNA干扰的shRNA载体制备实例下面以针对人GAPDH的干扰用shRNA表达载体的制备来来进行说明1.序列设计。靶位点5，-GTATGACAACAGCCTCAAG-3'说明此靶位点文献报道位点，抵制效率大于60%。常规引物设计GAPDH1—1GAPDH1—2引物长度均为65bp。优化载体引物设计GAPDH2-15'-CACCGTATGACAACAGCCTCAAGTTCAAGACGCTTGAGGCTGTTGTCATACTTTTTT-3'GAPDH2-25'-GATCAAAAAAGTATGACMCAGCCTCAAGCGTCTTGAACTTGAGGCTGTTGTCATAC-3'引物长度均为57bp。2.DNA模板引物合成在上海英骏公司合成本实例所需的DNA模板引物。3.DNA模板引物退火用50ulannealingbuffer溶解上述合成20D单链目的基因片段，各取2ul+16ulannealingbuffer混匀，94。C水浴退火自然冷却至室温，各取lul退火产物+99ulH20做100倍稀释。4.载体消化(如图六所示)取1ulpGenesil-1.2载体用10UBbsll酶切3小时，1%琼脂糖凝胶回收大片段。5.将消化好的载体与退火产物连接(如图七所示)，并取10ul过夜连接产物转化感受态DH5a细胞，涂布于含Kana(终浓度为30ug/ul)抗性且涂有X—Gal及IPTG的LB平板上，37X:恒温箱培养过夜。6.蓝白斑筛选当载体自身环化则其菌落为蓝色，而当退火片段插入pGenesil-1.2后，载体上的LacZalpha表达框将会被置换掉，菌落为白色。7.从平板上挑取3个白色单菌落接种于5ml含Kana(终浓度为30ug/ul)抗性的LB培养液中，37'C恒温摇床培养过夜。8.用小规模质粒抽提试剂盒提取质粒，并分别用BclI鉴定重组质粒。在pGenesil-1.2原始载体中位于EGFP3'端有一个唯一的Bell酶切位点，而当退火DNA模板插入后则会在PolyA后的接口处拼出一个新的Bell位点(如图八所示)，这两个BclI位点之间的碱基数约为1.8kb，酶切结果见附图九酶切结果表明酶切片段与预期大小一致，三个克隆均为阳性克隆。9.选取阳性克隆进行DNA测序，将序列完全正确的命名为pEGFP6-1.2-GAPDHsh。三.优化的编码小片段RNA载体有益性评价及实际应用效果测定1.合成引物成本降低测定。DNA引物合成成本是当前构建编码小片段RNA载体的成本中除人力成本外占比重最高的成本，通常占总成本的70%以上。目前囿于DNA引物合成的技术限制，合成长片段引物(60bp-80bp)的成本要较小片段引物(8bp-59bp)高出许多。下面以目前主流的DNA引物合成商上海英骏生物技术公司的引物合成价格为基准对优化前后构建一个编码小片段RNA质粒载体的DNA引物合成成本进行对比。计算公式为合成弓I物成本==单条引物碱基数X2X每碱基价格常规方案合成引物成本二63X2X5.5(合成片段〉60个的价格)=715元优化方案合成引物成本二57X2X2(合成片段〈60个的价格)=228元成本下降率=(715—228)/715=68.1%即优化方案每制备一个编码单条shRNA的质粒载体可节省487元人民币，合成引物成本下降68.1%2.制备成功率提高测定本实用新型提供的优化方案对制备成功率的提高体现在两个方面，一是提供双重重组子筛选方案以减少非重组子的比率，二是合成引物长度下降到60个碱基以内后，有利于降低合成错误率。图十为晶赛公司实际制备中有关情况的统计数据。图十<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>图中数据表明，在优化方案中的双重筛选方案筛选后送交测序的阳性克隆的重组子率从62%提高到了100%，而合成引物的正确率从73%提高到了97%。图十为常规制备方案及优化制备方案的测序结果对比分析将克隆送交测序为验证重组子的最可靠方案，测序的结果可能为(1)非重组子，即为载体自身环化产生的克隆；(2)重组子，但插入的合成DNA模板有错误，由于RNA干扰对序列有非常高的要求，通常不能包含任何突变，所以有任何碱基的突变即为失败的克隆；(3)合成碱基完全正确的重组子。重组子比率为重组子占所有送交测序的样品中的比率，合成引物序列完全正确比率为合成序列完全正确的重组子的数量占重组子总数的比率。3.将步骤二中构建出的pGenesil-1.2-GAPDHsh应用于针对HEK293细胞中GAPDH基因的干扰的效果检测。3.l将pGenesi1-1.2—GAPDHsh载体及各对照载体用德国biontex公司的METAFECTENEPRO按照说明书所述转染HEK293细胞，培养48小时后用流式细胞仪通过载体上带的绿色荧光蛋白标签分选出转染入载体的细胞，将分选出的细胞用于后续实验。3.2用RT-PCR在mRNA水平来测定GAPDH基因的表达情况。3.2.1按Invitrogen公司的产品说明用Trizol提取样品的总RNA。3.2.2进行逆转录反应反应体系ReagentVolume(ii1)10氺AMVBuffer2層RTase(Takara)0.5HPR(Takara)0.5dNTP(lOmM)1Oligo-dT1腿5,(RNasefree)upto20反应条件42°C45min,95°C5rain3.2.3针对目的基因及内参基因进行PCR反应引物序列GAPDHForward:5'-TCCCATCACCATCTTCCA-3'GAPDHReverse:5CATCACGCCACAGTTTCC-3'Beta-actinForward:5'-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3'Beta-actinReverse:5'-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3'反应体系Reagent.Volume(yl)10*Buffer2.5T叫HS(Takara)0.25dNTP(2.5mM)ForwardPrimer(10uM)ReversePrimer(lOyM)cDNAdH20反应条件950C95。C56。C72C72°C40C3.2.41%Agarose凝胶电泳PCR结果见附图十一图中结果表明pGenesil-1.2-GAPDH在mRNA水平对GAPDH有明显抵制效果且较之传统方案的pGenesil-:L-GAPDH抵制效果有显著提高。3.3Western杂交在蛋白质水平测定水平来测定GAPDH基因的表达情况。3.3.1提取细胞总蛋白将收集的细胞2000rpm离心10min，弃去大部分上清吹散重悬混匀。各取20u1样品，加入10ul3XloadingBuffer,混匀，沸水浴10min，15000rpm离心5min。3.3.2配制SDS-PAGE电泳胶3.3.3进行垂直板凝胶电泳用微量注射器将蛋白样品等体积加入上样孔中，连接电源进行电泳。积层胶90V，当电泳至溴蓝从积层胶进入分离胶时，将电压调至140V。3.3.4电转移3.3.4.1从电泳装置上取下凝胶，去掉积层胶，浸入电转缓冲液平衡5分钟。3.3.4.2剪两张滤纸和一张PVDF膜，大小与凝胶吻合。将滤纸浸入电转液中，PVDF膜浸入100%甲醇5秒，去离子水漂洗一下，再放入电转缓冲液中平衡5分钟。3.3.4.3安装孔板，并与转移槽正负极相对，放入槽中，加入HTransferBuffer电转缓冲液，接通电源，100mA恒流，转膜1.5小时.3.3.5杂交3.3.5.1将转好的PVDF膜浸入封闭液(WTBST+5呢脱脂奶粉)，4。C过夜；3.3.5.21*TBST洗膜5minX4次;3.3.5.3加入一抗，室温摇床孵育2h;3.3.5.41HcTBST洗膜5minX4次；3.3.5.5加入二抗室温摇床孵育lh;3.3.5.6l氺TBST洗膜5minX4次;3.3.6曝光3.3.6.1将PVDF膜置于S叩erSignal化学发光试剂中反应2min;3.3.6.2暗室中使X光片曝光，常规方法显影定影。结果见附图十二图中结果表明pGenesil-1.2-GAPDH在蛋白水平对GAPDH有明显抵制效果且较之传统方案的pGenesil-1-GAPDH抵制效果有显著提高。3.4优化方案在多种细胞系中的稳定性检测虽然对启动子3'的少量的突变在大多数细胞中不会引起显著的启动效率变化，但其对于启动子的启动效率还是存在潜在影响，这种影响在特定细胞中是显著的。而本优化方案中用于引导shRNA转录的启动子完全依照天然系列，没有任何突变，则彻底根除了这种影响。下面通过对十种细胞系中分别运用突变型和天然启动子对GAPDH的抑制效果对比来检测优化方案在多种细胞系中的稳定性。检测结果见图十三图中结果表示本优化方案中的天然启动子较之突变型启动子在大多数细胞系中保持相同或略高的抵制率，在少量细胞中较突变型的抵制率有显著增高。权利要求1.一种优化的小片段RNA载体系统及其构建方法，其特征在于包括以下步骤(1)以晶赛公司的编码多条shRNA质粒载体pEGFP6-1为骨架进行启动子序列，生物元件布局及筛选基因插入等一系列改造从而构建出优化的编码小片段RNA载体pGenesil-1.2；(2)化学合成编码各小片段RNA所需的DNA模板并构建入pGenesil-1.2中，然后利用此系统中的双重筛选方案筛选克隆并经测序鉴定完成构建工作；(3)将构建成功的编码小片段RNA表达载体经多方面的有益性评价及实际应用效果测定。2.根据权利要求1所述的一种优化的小片段RNA载体系统及其构建方法，其特征在于利用BbsI,Esp3I,Bsal等限制性内切酶的消化位点在识别位点旁边且消化位点序列没有特异性的特性，在引入插入模板DNA片段的酶切位点时确保了启动子3'端没有任何突变。3.根据权利要求1所述的一种优化的小片段RNA载体系统及其构建方法,其特征在于在载体的插入模板DNA的位置预先插入标签基因表达框，以在菌落水平提供一种筛选机制。4.根据权利要求1所述的一种优化的小片段RNA载体系统及其构建方法，其特征在于提供一种设计使得只有模板DNA片段插入时才会形成一个载体中原始位置所没有的酶切位点，从而提供一种有效的重组子鉴定手段。5.根据权利要求1所述的一种优化的小片段RNA载体系统及其构建方法，其特征在于载体的元件排布上将CMV增强子和hU6启动子紧邻排布，从而有效利用CMV的增强子来提高hU6启动子的启动效率。全文摘要本发明提供了一种优化的小片段RNA载体的改造方案及该载体的配套制备方法，包括以下步骤1.以晶赛公司的编码多条shRNA质粒载体pEGFP6-1为骨架进行启动子序列，生物元件布局及筛选基因插入等一系列改造，从而构建出优化的编码小片段RNA载体pGenesil-1.2；2.化学合成编码各小片段RNA所需的DNA模板并构建入pGenesil-1.2中，然后利用此系统中的双重筛选方案筛选克隆并经测序鉴定完成构建工作；本发明有效克服了当前科研领域及市场中常规制备小片段RNA载体所面临的启动子3＇端突变、构建过程中鉴定困难、合成模板DNA引物长和成本高等问题，同时以一种优化的结构使转录小片段RNA的启动子有更高的转录效率。文档编号C12N15/66GK101210253SQ20061016661公开日2008年7月2日申请日期2006年12月31日优先权日2006年12月31日发明者俊严,孙永林,封江南,康德娇,云张,超李,俊黄,黄映雪申请人:国营武昌造船厂