反应容器、反应容器处理装置及诊断装置的制作方法

专利名称：反应容器、反应容器处理装置及诊断装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种适于以化学反应为主、在现场进行各种自动分析例如 基因分析的研究或临床的反应容器，和使用其用于检测以人为主以及动物或植物的基因组DNA的多态性、特别是用于检测SNP (单碱基多态性) 的反应容器处理装置以及使用该基因多态性检测结果进行患病率的诊断、 给药的种类与效果及副作用的关系的诊断等的装置。
背景技术：
作为利用基因多态性来预测疾病的患病容易度等的方法或装置，提出 了如下所述的方法或装置。为了决定患者是否容易患上败血病及/或败血病是否快速进展，从患 者身上采集核酸样品，检测该样品中的2型(pattern)等位基因或与2型 等位基因连锁不平衡的标记基因，如果检测出2型等位基因或与2型等位 基因连锁不平衡的标记基因，则判断为该患者容易患败血病(参照在专利 文献1。)。为了诊断人的flt—l基因中的1或1以上的单核苷多态性，通过决定 人核酸的1或1以上的位置1953、 3453、 3888 (分别按照EMBL受理 编号X51602中的位置)、519、 786、 1422、 1429 (分别按照EMBL受理 编号D64016中的位置)、454 (按照序列编号3)及696 (按照序列编号5) 的序列，参照flt—1基因中的多态性，决定此人的体质(参照专利文献2。〉。有关于鉴别SNP位点的碱基即分型的很多手法的报道。下述手法为其中具有代表性的手法。为了使用较少量的基因组DNA，对涉及到数十万处的SNP位点，进行分型，使用基因组DNA及多对引物同时扩增至少包括一个单碱基多态 性位点的碱基序列，使用扩增后的多个碱基序列，利用分型工序辨别该碱 基序列中含有的单碱基多态性位点的碱基。作为该分型工序，使用侵入(invader)法或荧光定量PCR法(TaqmanPCR法)(参照专利文献3。)。 专利文献1:特表2002 — 533096号公报 专利文献2:特开2001 —299366号公报 专利文献3:特开2002—300894号公报 专利文献4:专利第3452717号公报非专利文献1: Hsu T. M.，Law S. M. Duan S, Neri B. P.， Kwok P. Y.，"利 用双色荧光偏振技术的侵入检测，对单核苷酸多态性进行的基因分型 (Genotyping single—nucleotide polymorphisms by the invader assay with dual-color fluorescence polarization detection ) " ， Clin. Chem.， 2001 Aug;47(8): 1373-7发明内容本发明的第1目的在于提供一种适于自动化化学反应的测定或基因 多态性检测的反应容器。本发明的第2目的在于提供一种使用本发明的反应容器来自动化化 学反应测定或基因多态性检测的装置。本发明的第3目的在于提供一种用于使用基于本发明的基因多态性 检测结果来自动地进行患病率的诊断或给药的种类与效果及副作用之间 的关系等的诊断的装置。用于实现第1目的的本发明的反应容器至少具备..在平板状的基板上 形成的使样品发生反应的至少一个反应部；和不挥发性液体储存部，其在 所述基板上形成为凹部，储存比重低于反应液的不挥发性液体并以薄膜密 封。本发明的反应容器也可以进而具备在同一基板形成为凹部，储存在样 品的反应中使用的试剂并用薄膜密封的至少一个试剂储存部，构成样品的 反应用试剂盒。用薄膜密封的试剂或不挥发性液体可以通过在本发明的反应容器处 理装置内穿透该薄膜并插入喷嘴，或者通过在剥下该薄膜之后插入喷嘴， 从而被该喷嘴吸入并移送至反应部等其他场所。
该反应容器以化学反应、生物化学反应为主，可以用于各种反应的测 定。作为将该反应容器用作反应用试剂盒时的一个用途，可以举出基因多 态性检测。作为基因多态性检测用的反应容器的情况下的第1方式是将作 为生物体样品已进行基因扩增反应的产物注入该反应容器来检测基因多 态性的反应容器。该第1方式的反应容器，作为试剂储存部，包括储存对 应多个多态性位点配制的分型试剂的分型试剂储存部，作为反应部，包括 分别保持对应所述各多个多态性位点并发出荧光的探针的多个探针配置 部，构成基因多态性诊断用试剂盒。形成基因多态性检测用反应容器的情况的第2方式是，在上述第1方 式的反应用试剂盒中，作为试剂储存部，迸而包括储存含有分别夹持结合 多个多态性位点的多个引物的基因扩增试剂的基因扩增试剂储存部，作为 反应部，进而包括对所述基因扩增试剂和样品的混合液进行基因扩增反应 的扩增反应部。在第2方式的基因多态性诊断用试剂盒中，优选扩增反应部的液体分 注用喷口 (port)具有对应分注喷嘴的顶端形状的开口形状，由能够贴紧 分注喷嘴的顶端的弹性原材料构成。扩增反应部由于反复进行改变温度的 循环，所以基板的热传导性优选为高。所以，优选扩增反应部的基板壁厚 薄于其他部分。在此，如果表示多态性位点与引物的关系，则是为了扩增一个多态性 位点而必需夹持结合该多态性位点的一对引物。成为对象的生物体样品中 存在多种多态性位点，所以在这些多态性位点存在于彼此分离的位置的情 况下，必需多态性位点的种类的数目的2倍种引物。不过，2个多态性位 点接近的情况下，分别夹持这些多态性位点结合引物扩增本身也可以在这 2个多态性位点之间不结合引物，而只在2个多态性位点的序列的两侧结 合引物扩增。因而，必要的引物种类不一定需要为多态性位点的种类的数 目的2倍。本发明中的"分别夹持结合多个多态性位点的多个引物"不只 包括一对引物夹持结合一个多态性位点的情况，也包括夹持结合2或2以 上的多态性位点的情况，是指扩增多个多态性位点所必需的种类的引物。多态性包括变异、缺失、重复、转移等。具有代表性的多态性是SNP。生物体样品为血液、唾液、基因组DNA等。
基因扩增试剂的一例为PCR反应试剂。SNP的分型中，在进入扩增工序的阶段必须调整基因组DNA，其中 需要花费时间、人力和成本。如果只着眼于扩增DNA的PCR法，还提出 了不用进行前处理而从血液等样品直接进行PCR反应的方法。于是，在 扩增含有基因的样品中的目的基因的核酸合成法中，向基因扩增反应液中 添加含有基因的样品中的基因包含体或含有基因的样品本身，添加后的该 反应液的pH在为8.5 9.5 (25'C)下，扩增含有基因的样品中的目的基 因(参照专利文献4。)。已经构建的分型系统，为了用PCR法扩增需要进行分型的多个SNP 区域，虽然最初采集的DNA量很少即可，但在PCR法扩增之前，必需进 行预先从生物体样品中提取DNA的前处理。为此该前处理需要花费时间 和人力。在将直接PCR法与分型方法结合起来时，对需要进行分型的多个SNP 位点同时进行扩增的自动化系统尚未构建起来。分型工序可以使用侵入法或荧光定量PCR法。这种情况下，分型试 剂为侵入试剂或荧光定量PCR试剂。图11是概要地表示将本发明的反应容器用作基因多态性诊断用试剂 盒来检测基因多态性时的检测方法的图。在此，扩增工序使用PCR法、 分型工序使用侵入法进行说明。在PCR工序中，向血液等生物体样品2中添加PCR反应试剂4，或 相反，向PCR反应试剂4中添加生物体样品2。PCR反应试剂4被预先调整，含有用于需要测定的SNP位点的多个 引物，向其中添加用于调节pH的pH缓冲液、4种脱氧核糖核苷酸 (deoxyribonucleotide)类、热稳定性合成酶、及MgCl2、 KC1等盐类等必 需的试剂。此外，还可以根据需要添加表面活性剂或蛋白等物质。有时在 本发明中使用的扩增工序的PCR法是使目的多个SNP位点同时扩增的方 法。生物体样品可以是实施了核酸提取操作的样品，也可以是没有实施核 酸提取操作的样品。从没有实施核酸提取操作的生物体样品，直接利用 PCR法，使含有这些SNP位点的多个基因组DNA扩增的情况下，使含有 用于这些SNP位点的多个引物的基因扩增反应试剂作用于生物体样品，
在与样品2混合时使其在25°〇、pH8.5 9.5的条件下，发生PCR反应。除了三(羟甲基)氨基甲烷与盐酸、硝酸、硫酸等无机酸的组合以外， pH缓冲液还可以使用各种pH缓冲液。在PCR反应试剂中，优选以 10mM 100mM的浓度使用己调整pH的缓冲液。引物是指作为起到利用PCR反应合成DNA的开始点作用的寡核苷 酸。引物可以合成，也可以从生物界中分离。合成酶是通过附加引物来合成DNA用的酶，也包括化学合成系。作 为适当的合成酶，包括大肠杆菌(E.coli)的DNA聚合酶(polymerase) I、大肠杆菌(E. coli)的DNA聚合酶的Klenow片段(Klenow fragment)、 T4DNA聚合物、TaqDNA聚合酶、T. litoralis DNA聚合酶、TthDNA聚合 酶、PfoDNA聚合酶、Hot Start Taq聚合酶、KOD DNA聚合酶、EX TaqDNA 聚合酶、逆转录酶等，但不被这些所限定。"热稳定性"是指即使在高温 下、最好在65 95"下也可以保持其活性的化合物的性质。在PCR工序中，使生物体样品2与PCR反应试剂4的混合液，按照 规定的温度循环进行PCR反应。PCR温度循环包括变性、引物附着(退 火(annealing))及引物延伸的3个工序，通过反复进行该循环，使DNA 扩增。作为各工序的一例，变性工序为94'C下1分钟，引物附着工序为 55。C下1分钟，引物延伸为72'C下1分钟。生物体样品可以为实施了基 因组提取操作的样品，但在此也可以使用没有实施基因组提取操作的样 品。即使是没有实施基因组提取操作的生物体样品，也可以在PCR温度 循环的高温下，DNA从血细胞或细胞游离出来，PCR反应所必需的试剂 与DNA接触，反应进行。PCR反应结束后，添加作为分型试剂的侵入试剂6。侵入试剂6中含 有发出荧光的FRET探针及切割酶(cleavase:结构特异的DNA分解酶)。 FRET探针是具有与基因组DNA完全没有关系的序列的荧光标记寡核苷 酸，无论SNP的种类如何，序列大多共用。接着，向多个探针配置部8中添加已添加侵入试剂6的反应液，使其 反应。在各探针配置部8，分别对应各多个SNP位点保持侵入探针和报告 (reporter)探针，反应液与侵入探针反应，只要存在对应该报告探针的 SNP，就可以发出荧光。
在专利文献3的段落

中有关于侵入法的详细记载。 各报告探针只要根据与其对应的SNP碱基准备2种，就可以辨别出 该SNP为纯合子还是杂合子。在分型工序中使用的侵入法是通过使等位基因特异寡核苷酸与含有 分型对象的SNP的DNA发生杂交(hybridyzation)，来分型SNP位点的 方法，是使用如下所述物质的方法，即含有分型对象的SNP的DNA， 具有对含有分型对象的SNP的各等位基因特异的2种报告探针及1种侵 入探针，和识别DNA结构并切断的具有特殊内切酶(endonuclease)活性 的酶(参照专利文献3。)。在本发明分反应容器中，所述薄膜优选可以用喷嘴穿透。 优选在反应部中，至少分注不挥发性液体的部分为能够保持该不挥发 性液体的凹部。也可以进而具备在同一基板形成为凹部的、用于注入样品的样品注 入部。优选至少反应部在使用前被可以剥离的密封材料覆盖。 分型试剂为侵入试剂或荧光定量PCR (TaqmanPCR)试剂。 用于实现第2目的的本发明的反应容器处理装置具备安装有至少具 备使样品发生反应的反应部及储存比重低于反应液的不挥发性液体的不 挥发性液体储存部的反应容器的反应容器安装部；和如图l所示，具备用 于利用喷嘴28吸引及喷出的机构并移送、分注液体的分注部112;和至 少对分注部112的分注动作进行控制的控制部118。该反应容器处理装置也可以进而具备控制反应部的温度的反应温度 控制部，控制部116也进行反应温度控制部的温度控制。在将该反应容器处理装置用作基因多态性检测装置的情况下，该第1 方式使用作为反应容器进而具备储存分型试剂的分型试剂储存部，作为所 述反应部具备分别保持对应各多个多态性位点并发出荧光的探针的多个 探针配置部的基因多态性诊断用反应容器。那么，如图1所示，作为反应 温度控制部，具备将探针配置部的温度控制在使样品和分型试剂的反应液 与所述探针反应的温度的分型反应温度控制部110，该反应容器处理装置 进而具备向各探针配置部照射激励光并检测荧光的荧光检测部64。控制
部118也控制分型反应温度控制部110的温度控制及荧光检测部64的检 测动作。作为分型反应使用侵入反应的情况下，分型反应温度控制部110成为 用于侵入反应的温调部。将该反应容器处理装置用作基因多态性检测装置的第2方式使用作 为反应容器进而具备储存含有分别夹持结合多个多态性位点的多个引物 的基因扩增试剂的基因扩增试剂储存部，作为反应部进而具备对基因扩增 试剂和样品的混合液进行基因扩增反应的扩增反应部的基因多态性诊断 用反应容器。那么，如图1所示，作为反应温度控制部，进而具备将扩增 反应部的温度控制在用于在样品与基因扩增试剂的反应液内使DNA扩增 的基因扩增的温度的扩增反应温度控制部120，控制部也进行扩增反应温 度控制部120的温度控制。作为基因扩增反应使用PCR反应的情况下，扩增反应温度控制部120 成为用于PCR反应的温度循环的温调部。为了从外部操作控制部118或显示检査结果，也可以使个人电脑(PC) 122与控制部118连接。作为喷嘴的一例，是一次性尖端装卸自如地安装于顶端的喷嘴。反应 容器的液体储存部被薄膜密封，在被该薄膜密封的状态下安装于反应容器 处理装置的情况下，利用该尖端穿透反应容器的薄膜进行液体的吸入。用于实现第3目的的本发明的诊断装置具备对本发明的反应容器中 的基因多态性诊断用反应容器进行处理的本发明的反应容器处理装置；和 记忆有特定的多态性或多个多态性的组合的诊断值的数据库；和显示装 置；和基于反应容器处理装置检测出的多态性分析结果，从数据库读取诊 断值，并显示于显示装置的诊断处理装置。本发明的反应容器由于在一个基板收容反应部和比重低于反应液的 不挥发性液体，所以利用在反应部处不挥发性液体覆盖反应液的表面，即 使反应液在反应部被加热，仍能够避免反应液蒸发。进而，也具备试剂储存部，所以成为样品的反应用试剂盒，没有分开 配制试剂的麻烦。将该反应容器用作基因多态性诊断用试剂盒的第1方式，由于一体具
备分型试剂储存部、不挥发性液体储存部及探针配置部，所以对于多个多态性位点已被扩增的DNA样品而言，可以同时对这些多态性位点进行分 型，可以以简单的工序在短时间内进行多态性的分型。另外，将该反应容器用作基因多态性诊断用试剂盒的第2方式，由于 进一步一体具备基因扩增试剂储存部乃至扩增反应部，所以在同时从生物 体样品扩增目的多个多态性位点之后，可以同时对这些多态性位点进行分 型，可以以简单的工序在短时间内进行多态性的分型。只要可以用喷嘴穿透密封试剂或不挥发性液体的薄膜即可，在反应容 器处理装置内进行液体的移送变得容易。反应部只要是成为凹部并能够保持不挥发性液体即可，可以更有效地 防止反应液在反应部的蒸发。只要用可以剥离的密封材料覆盖反应部即可，通过在使用前被密封材 料覆盖，在使用时剥离密封材料，可以防止在使用前尘埃或污物的附着。在具备扩增反应部的反应容器中，只要扩增反应部的液体分注用喷口 (port)具有对应分注喷嘴的顶端形状的开口形状，由能够贴紧分注喷嘴 的顶端的弹性原材料构成即可，可以容易地进行混合液向扩增反应部的注 入动作及反应液从扩增反应部的回收。在本发明的反应容器处理装置中，由于利用喷嘴进行液体的移送，所 以可以用简单的机构进行分注动作。在本发明的诊断装置中，可以自动地执行从多态性的分型到基于该分 型的诊断值的显示。


图1是概要地显示本发明的模块图。图2A是反应容器的第1实施例的主视图。图2B是反应容器的第1实施例的俯视图。图3A是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的前 半部分的主视图。图3B是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的前 半部分的俯视图。图4A是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的后 半部分的主视图。图4B是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的后 半部分的俯视图。图5A是反应容器的第2实施例的主视图。 图5B是反应容器的第2实施例的俯视图。图5C是表示反应容器的第2实施例的在图5B的X—X线位置的放 大截面图。图6A是作为在同一实施例中的扩增反应部被注入反应液的状态下在 图5B的Y—Y线位置的放大截面图表示的图。图6B是作为在同一实施例中的扩增反应部被回收反应液的状态下在 图5B的Y—Y线位置的放大截面图表示的图。图7A是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的前 半部分的主视图。图7B是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的前 半部分的俯视图。图8A是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的后 半部分的主视图。图8B是表示使用同一实施例的反应容器的SNP检测方法的工序的后 半部分的俯视图。图9是表示将本发明的反应容器用作试剂盒，用于检测生物体样品的 SNP的简易型反应容器处理装置的一个实施例的概要截面图。图IO是表示同一检测装置中的检测器的概要截面图。图11是概要地表示本发明相关的SNP检测方法的流程图。图12是概要地表示本发明的诊断装置的模块图。图中，2 —样品，4一PCR反应试剂，6 —侵入试剂，8 —探针配置部， 10、 10a—基板，12 —样品注入部，14一分型试剂储存部，16—矿物油储 存部，18—探针配置部，20—薄膜，22 —密封材料，28 —喷嘴，30—基因 扩增试剂储存部，31—PCR终止液注入部，32 —扩增反应部，34a、 34b 一扩增反应部的喷口， 36a、 36b —喷口的开口， 41一反应容器，60、 62 一加热模块，64—检测器，66 —送液臂，70 —尖端，200—反应容器处理 装置，202—数据库，204—显示装置，206—诊断处理装置。
具体实施方式
作为比重低于反应液的不挥发性液体，可以使用矿物油(石油)、植 物油、动物油、硅油及二苯醚等。矿物油是从凡士林蒸馏得到的液体的烃 混合物，也被称为流动石蜡、流动凡士林、白油等，也包括低比重的汽油。 作为动物油，可以使用鳕鱼肝油、狭鳞庸鲽油、鲱油、罗非鱼(Orange roughy)油或鲨鱼肝油等。另外，作为植物油，可以使用卡诺拉(canola) 油、杏仁油、绵子油、玉米油、橄榄油、花生油、红花油、芝麻油、豆油 等。图2A及图2B是反应容器的第1实施例，图2A为主视图，图2B为在平板状的基板10的同一侧，试剂储存部14及不挥发性液体储存部 16形成为凹部。将矿物油用作不挥发性液体，之后将不挥发性液体储存 部称为矿物油储存部。在基板10的同一侧，进而还形成反应部18。试剂 储存部14和矿物油储存部16被薄膜20密封，在用喷嘴吸入试剂和矿物 油并移送至其他场所时，去除该薄膜20用喷嘴吸入，或者可以用喷嘴穿 透该薄膜20时使喷嘴穿透该薄膜，用喷嘴吸入。这样的薄膜20例如为铝 箔、铝与PET (聚对苯二甲酸乙二醇酯)薄膜等树脂薄膜的层叠膜等，为 了不容易剥落，利用熔融或粘接贴附。从薄膜20上，用大小为覆盖试剂储存部14、矿物油储存部16及反 应部18的可以剥离的密封材料22覆盖基板10的表面。作为该反应容器的具体用途的一例，为注入利用PCR反应扩增DNA 的样品反应液并利用侵入反应检测SNP的基因多态性诊断用试剂盒。参 照图2A及图2B，详细说明该基因多态性诊断用试剂盒的实施例。在平板状的基板10的同一侧，样品注入部12、分型试剂储存部14 及矿物油储存部16形成为凹部。在基板10的同一侧，进而还形成多个探 针配置部18。样品注入部12是注入利用PCR反应扩增DNA的生物体样品反应液
的部位，以在使用前的状态下尚未注入样品的空的状态提供。分型试剂储存部14储存10 300pL对应多个多态性位点配制的分型试剂，矿物油储 存部16储存20 300]iL用于防止反应液的蒸发的矿物油，这些分型试剂 储存部14和矿物油储存部16被喷嘴可以穿透的薄膜20密封。各探针配置部18分别保持对应各多个多态性位点并发出荧光的探 针，成为可以在从矿物油储存部16分注矿物油时保持该矿物油的凹部。 各探针配置部18的凹部的尺寸例如为直径100pm 2mm、深50pm 1.5mm的圆形。从薄膜20上，用大小为覆盖样品注入部12、分型试剂储存部14、矿 物油储存部16及探针配置部18的可以剥离的密封材料22覆盖基板10的 表面。该密封材料22也可以为铝箔、铝与树脂的层叠膜等，但贴附强度 比薄膜20弱，所以利用粘合剂等贴附成可以剥离的程度。为了从底面侧测定荧光，用低自荧光性(很少从其自身产生荧光的性 质)而且光透过性的树脂例如聚碳酸酯等原材料形成基板10。基板10的 厚度为0.3 4mm，优选为1 2mm。从低自荧光性的观点出发，优选基 板10的厚度薄。下面显示该实施例的反应容器的使用方法。如图3所示，使用时剥下密封材料22。密封分型试剂储存部14和矿 物油储存部16的薄膜20不被剥下而残留不变。利用吸量管(pipet) 26等向样品注入部12注入2 20pL己利用PCR 反应扩增DNA的样品反应液24。然后，将该反应容器安装于检测装置。在检测装置中，如图4所示，喷嘴28穿透薄膜20插入分型试剂储存 部14吸入分型试剂，分型试剂被该喷嘴28移送至样品注入部12。通过 在样品注入部12反复进行喷嘴28的吸入和喷出，使样品反应液与分型试 剂混合。然后，PCR反应液与分型试剂的反应液被喷嘴28分注到各探针配置 部18。从矿物油储存部16利用喷嘴28向各探针配置部18分注矿物油。 矿物油向探针配置部18的分注也可以在反应液向探针配置部18分注之 前。在各探针配置部18，各分注0.5 10jaL矿物油，该矿物油覆盖反应液 的表面，防止伴随着检测装置的分型反应温度控制部的加热而分型反应时
间中的反应液的蒸发。在各探针配置部18，反应液只要有与探针反应的规定的SNP，就会 从该探针发出荧光。通过从基板10的背面侧照射激励光来检测出荧光。 .图5A、图5B及图5C是反应容器的第2实施例。图5A是主视图， 图5B是俯视图，图5C是在图5B的X—X线位置的放大截面图。该反应容器将没有实施核酸提取操作的生物体样品作为样品注入，同 时进行利用PCR反应的DNA的扩增和利用侵入反应的SNP检测。其中， 也可以注入未实施核酸提取操作的生物体样品。与图2A及图2B的实施例同样，在平板状的基板10a的同一侧，形 成样品注入部12、分型试剂储存部14、矿物油储存部16及多个探针配置 部18。在该反应容器中，进而在基板10a的同一侧形成基因扩增试剂储 存部30、 PCR终止液注入部31及扩增反应部32。基因扩增试剂储存部30也在基板10a形成为凹部，储存含有分别夹 持结合多个多态性位点的多个引物的基因扩增试剂。基因扩增试剂储存部 30与分型试剂储存部14及矿物油储存部16 —起用可以被喷嘴穿透的薄 膜20密封。在基因扩增试剂储存部30中储存2 300pLPCR反应试剂。 与图2A及图2B的实施例同样，在分型试剂储存部14储存10 30(HiL分 型试剂，矿物油储存部16中储存20 300nL的矿物油。PCR终止液注入部31是用于混合在扩增反应部32终止PCR反应的 反应液与分型试剂的部位，在基板10a形成为凹部，以使用前的状态为空 的状态提供。扩增反应部32是对PCR反应试剂和样品的混合液进行基因扩增反应 的部位。图6表示放大扩增反应部32的部分截面。图6是在图5B的Y—Y线 位置的截面图。如图6所示，扩增反应部32的液体分注用喷口34a、 34b 具有对应喷嘴28的顶端形状的形状的开口36a、 36b，为了可以与喷嘴28 的顶端贴紧而用PDMS(聚二甲基硅氧垸)或硅酮橡胶等弹性原材料构成。扩增反应部32为了使热传导系数很好而该部分的基板10a的下面侧 如图5C、图6所示，壁厚变薄。该部分的壁厚例如为0.2 0.3mm。样品注入部12在该实施例中被注入没有实施核酸提取操作的生物体
样品，但以使用前的状态尚未注入样品的空的状态提供。与图2A及图2B的实施例相同，分型试剂储存部14储存对应多个多 态性位点配制的分型试剂，矿物油储存部16储存用于防止反应液的蒸发 的矿物油。各探针配置部18也与图2A及图2B的实施例相同，分别保持对应各 多个多态性位点发出荧光的探针，成为在从矿物油储存部16分注矿物油 时可以保持该矿物油的凹部。从薄膜20上，用大小为覆盖样品注入部12、 PCR终止液注入部31、 分型试剂储存部14、矿物油储存部16、基因扩增试剂储存部30、扩增反 应部32及探针配置部18的可以剥离的密封材料22覆盖基板10a的表面。 薄膜20与密封材料22的材质及其贴附方法与图2A及图2B的实施例木目 同。为了从底面侧测定荧光，也用低自荧光性而且光透过性的树脂例如聚 碳酸酯等原材料形成基板10a。基板10的厚度为1 2mm。 下面显示该实施例的反应容器的使用方法。如图7A及图7B所示，使用时剥下密封材料22。密封分型试剂储存 部14、矿物油储存部16及基因扩增试剂储存部30的薄膜20不被剥下而 残留不变。利用吸量管26等向样品注入部12注入0.5 2pL样品25。在图2A 及图2B的实施例中，注入的样品为在外部利用PCR反应扩增DNA的样 品反应液，但在该实施例中注入的样品为没有实施核酸提取操作的生物体 样品例如血液。样品也可以为实施了核酸提取操作的生物体样品。注入样 品之后，将该反应容器安装于检测装置。在检测装置中，如图8A及图8B所示，喷嘴28穿透薄膜20插入基 因扩增试剂储存部30吸入PCR反应试剂，5 20pL PCR反应试剂被该喷 嘴28移送至样品注入部12。通过在样品注入部12反复进行喷嘴28的口及 入和喷出，使样品反应液与PCR反应试剂混合，成为PCR反应液。接着，如图6A所示，该PCR反应液被喷嘴28分注到扩增反应部32。 即，喷嘴28插入扩增反应部32的一方的喷口 34a，注入该PCR反应、液 38，接着，为了防止在扩增反应部32的反应中PCR反应液38蒸发，利
用喷嘴38向喷口34a、 34b注入矿物油40，用矿物油40覆盖在喷口 34a、 34b的PCR反应液38的表面。PCR反应终止后，利用喷嘴28回收PCR反应液，但此时为了容易回 收，如图6B所示，从扩增反应部32的一方喷口 34a注入矿物油40。反 应完成后的PCR反应液38a被压向另一方喷口 34b。因此，插入该喷嘴 28， PCR反应液38a被吸入到喷嘴28。喷口 34a、 34b形成为其开口 36a、 36b的形状与喷嘴28的形状一致，而且用弹性原材料形成，所以喷嘴28 与喷口34a、 34b贴紧，防止液体漏出，容易进行PCR反应液的注入和回 收的操作。利用喷嘴28，从扩增反应部32回收的反应终止后的PCR反应液38a 被移送至PCR终止液注入部31 。接着，喷嘴28穿透薄膜20插入分型试剂储存部14，吸入分型试剂， 分型试剂被该喷嘴28移送至并被注入PCR终止液注入部31。在PCR终 止液注入部31，通过反复进行利用喷嘴28的吸入和喷出，混合PCR反应 液和分型试剂。然后，各0.5 4pL的PCR反应液与分型试剂的反应液被喷嘴28分 注到各探针配置部18。从矿物油储存部16利用喷嘴28向各探针配置部 18分注矿物油。矿物油向探针配置部18的分注也可以在反应液向探针配 置部18分注之前。在各探针配置部18，矿物油覆盖反应液的表面，防止 伴随着检测装置的分型反应温度控制部的加热而分型反应时间中的反应 液的蒸发。在各探针配置部18，反应液只要有与探针反应的规定的SNP，就会 从该探针发出荧光。通过从基板10的背面侧照射激励光来检测出荧光。以下显示各反应试剂的组成，详细说明本发明，但本发明的技术范围 不限于这些实施例。PCR反应试剂为已知的试剂，例如可以使用如专利文献3的段落
中记载的含有引物、DNA聚合酶及TaqStart (CLONTECH Laboratories 公司制)的反应试剂。另外，也可以在PCR反应试剂中混入AmpDirect (岛津制作所制)。引物例如可以使用在专利文献3的表1中记载的SNP ID1 20、序列编号1 40等。
作为分型试剂使用侵入试剂。作为该侵入试剂，使用侵入检测试剂盒(invader assay kit) (Third Wave Technology公司制)。例如，将信号缓 冲液(signal buffer) 、 FRET探针、结构特异DNA分解酶及等位基因特 异探针配制成如专利文献3的段落
中记载的浓度。图9是表示将本发明的反应容器用作试剂盒，用于检测生物体样品的 SNP的简易型反应容器处理装置的一个实施例的图。在装置内上下配置一 对加热模块60和62，构成反应容器安装部，在下侧加热模块60上平行 地并列设置5张向本发明的反应容器41中注入样品的反应容器。这些加 热模块60、 62可以向箭头所示的Y方向移动。在上侧加热模块62设置在利用喷嘴28移送或吸入、喷出液体时可以 开闭地打开盖的窗。下侧的加热模块60具备将扩增反应部32的温度控制成规定的温度循 环的扩增反应温度控制部和将探针配置部18的温度控制成使DNA和探 针反应的温度的分型反应温度控制部。扩增反应温度控制部的温度例如被 设定成在94。C、 55'C及72'C的3个阶段依次变化，重复进行该循环。分 型反应温度控制部的温度例如被设定成63°C 。作为反应容器41使用如图2A及图2B的实施例的不具备扩增反应部 的反应容器的情况下，不需要控制扩增反应部的温度的扩增反应温度控制 部。另外，在加热模块60的下部设置进行荧光检测的检测器64，检测器 64向图的箭头X方向移动，检测来自探针配置部18的荧光。为了检测荧 光而在加热模块60设置开口 。利用反应容器安装部的探针配置部18的Y 方向移动和检测器64的X方向移动，进行在各探针的荧光检测。为了进行利用喷嘴28的移送或吸入、喷出液体，作为分注部设置送 液臂66，送液臂66具备喷嘴28。喷嘴28在其顶端装卸自如地安装一次 性尖端70。为了控制加热模块60、 62、荧光检测部64及送液臂66的动作，在 它们的附近配置控制部118。控制部118具备CPU，保持用于动作的程序。 控制部118控制利用加热模块60、62实现的分型反应部110或扩增部120 的温度控制、荧光检测部64的检测动作及分注部112的送液臂66的分注动作。在作为反应容器41使用图2A及图2B的反应容器之类的不具备基因 扩增反应部的反应容器的情况下，不需要控制基因扩增反应部的温度的扩 增部，扩增部118也不需要具备用于控制扩增部的温度的功能。图10是具体地表示检测器64的图。检测器64具备发出473nm的激 光的激光二极管(laser diode) (LD)或发光二极管(LED) 92作为激励 光源，具备使该激光聚光、照射于反应容器41的探针配置部的底面的一 对透镜94、 96。透镜94使来自激光二极管92的激光聚光成为平行光， 透镜96是使变为平行的激光会聚、照射于反应容器41的底面的物镜。物 镜96还起到使从反应容器41产生的荧光聚光的透镜的作用。在一对透镜 94、 96之间设有分色镜(dichroic mirror) 98，分色镜98的波长特性被设 定为使激励光透过、使荧光反射。在分色镜98的反射光(荧光)的光程 上进一步设置分色镜100。分色镜100的波长特性被设定为反射525nm的 光、透过605nm的光。在利用分色镜100的反射光的光程上配置有检测 525nm的荧光的透镜102和光检测器104，在利用分色镜100的透过光的 光程上配置有检测605nm的荧光的透镜106和光检测器108。通过利用此 两个检测器104、 108检测2种荧光，检验对应固定于各探针配置部位置 的侵入探针的SNP的有无，和该SNP为纯合子还是杂合子。作为标记荧 光体，可以使用例如FAM、 ROX、 VIC、 TAMRA、 Redmond Red等。图10的检测器64构成为在利用光源的激励光下激发，测定2波长的 荧光，但为了测定2波长的荧光而可以用不同的激发波长激发，作为检测 器64也可以构成为使用2个光源。如图12所示，本发明的诊断装置具备处理本发明的反应容器中的 基因多态性诊断用反应容器的反应容器处理装置200;和由光盘装置或磁 鼓装置等记忆装置构成，记忆有特定的多态性或多个多态性的组合的诊断 值的数据库202;和液晶显示器或CRT等显示装置204;和基于反应容器 处理装置200检测出的多态性分析结果，从数据库202读取诊断值，显示 于显示装置204的计算机构成的诊断处理装置206。产业上的可利用性本发明除了各种化学反应的测定以外，例如可以在基因分析的研究或 临床领域用于各种自动分析，例如可以用于检测以人为主以及动物或植物的基因组DNA的多态性、特别是SNP (单碱基多态性)，进而可以用于 使用该结果进行患病率的诊断、给药的种类与效果及副作用的关系的诊断 等，此外还可以用于动物或植物的品种判定、传染病诊断(感染菌的型判 定)等。
权利要求
1.一种反应容器，其特征在于，至少具备在平板状的基板上形成的使样品发生反应的至少一个反应部；和不挥发性液体储存部，其在所述基板上形成为凹部，储存比重低于反应液的不挥发性液体并以薄膜密封。
2. 根据权利要求1所述的反应容器，其中，还具备在所述基板上形成为凹部、储存在所述样品的反应中使用的试 剂并以薄膜密封的至少一个试剂储存部，从而构成样品的反应用试剂盒。
3. 根据权利要求2所述的反应容器，其中，作为所述试剂储存部，包括储存与多个多态性位点对应地配制的分型 试剂的分型试剂储存部，作为所述反应部，包括对与所述各多个多态性位点分别对应、并发出 荧光的探针进行保持的多个探针配置部，并构成基因多态性诊断用试剂盒。
4. 根据权利要求3所述的反应容器，其中，作为所述试剂储存部，还包括对含有分别夹持结合多个多态性位点的 多个引物的基因扩增试剂进行存储的基因扩增试剂储存部，作为所述反应部，还包括对所述基因扩增试剂和样品的混合液进行基 因扩增反应的扩增反应部。
5. 根据权利要求4所述的反应容器，其中，所述扩增反应部的液体分注用喷口 (port)具有与分注喷嘴的顶端形 状对应的开口形状，并以能够贴紧分注喷嘴的前端的弹性原材料构成。
6. 根据权利要求4或5所述的反应容器，其中， 所述扩增反应部的基板壁厚薄于其他部分。
7. 根据权利要求1 6中任一项所述的反应容器，其中， 所述薄膜可以用喷嘴穿透。
8. 根据权利要求1 7中任一项所述的反应容器，其中， 在所述反应部中，至少分注所述不挥发性液体的部分为能够保持该不 挥发性液体的凹部。
9. 根据权利要求1 8中任一项所述的反应容器，其中， 还具备在所述基板形成为凹部、并用于注入样品的样品注入部。
10. 根据权利要求1 9中任一项所述的反应容器，其中， 至少所述反应部在使用前被可以剥离的密封材料覆盖。
11. 根据权利要求1 10中任一项所述的反应容器，其中， 所述不挥发性液体为从矿物油、植物油、动物油、硅油及二苯醚构成的组中选择的液体。
12. 根据权利要求3 U中任一项所述的反应容器，其中， 成为对象的多态性为单碱基多态性。
13. 根据权利要求8 12中任一项所述的反应容器，其中，所述样品为未实施核酸提取操作的生物体样品。
14. 根据权利要求8 12中任一项所述的反应容器，其中， 所述基因扩增试剂为PCR反应试剂。
15. 根据权利要求3 14中任一项所述的反应容器，其中， 所述分型试剂为侵入(invader)试剂或荧光定量PCR (TaqmanPCR)试剂。
16. —种反应容器处理装置，其中，具备反应容器安装部，其安装有至少具备使样品发生反应的反应部及储存比重低于反应液的不挥发性液体的不挥发性液体储存部的反应容器；分注部，其具备用于利用喷嘴吸引及喷出的机构，并移送、分注液体;和至少对所述分注部的分注动作进行控制的控制部。
17. 根据权利要求16所述的反应容器处理装置，其中，还具备对所述反应部的温度进行控制的反应温度控制部，且 所述控制部也进行所述反应温度控制部的温度控制。
18. 根据权利要求17所述的反应容器处理装置，其中， 所述反应容器是基因多态性诊断用反应容器，所述反应容器还具备储存分型试剂的分型试剂储存部，且作为所述反应部，具备对与各多个多态性位点分别对应、并发出荧光的探针进行保持的多个探针配置部，且作为所述反应温度控制部，具备将所述探针配置部的温度控制在使所 述样品和所述分型试剂的反应液与所述探针发生反应的温度的分型反应 温度控制部，该反应容器处理装置还具备向所述各探针配置部照射激励光并检测 荧光的荧光检测部，所述控制部也控制所述分型反应温度控制部的温度控制及所述荧光 检测部的检测动作。
19. 根据权利要求18所述的反应容器处理装置，其中， 所述反应容器是基因多态性诊断用反应容器，所述反应容器还具备储存含有分别夹持结合多个多态性位点的多个引物的基因扩增试剂的基因 扩增试剂储存部，且作为所述反应部还具备对所述基因扩增试剂和样品的 混合液进行基因扩增反应的扩增反应部，作为所述反应温度控制部，还具备将所述扩增反应部的温度控制在用 于在所述样品与基因扩增试剂的反应液内使DNA扩增的基因扩增的温度的扩增反应温度控制部，所述控制部也进行所述扩增反应温度控制部的温度控制。
20. 根据权利要求16 19中任一项所述的反应容器处理装置，其中， 所述喷嘴是在前端可装卸地安装可一次性使用的尖端(tip)的喷嘴，所述反应容器的液体的储存部被薄膜密封，且在被该薄膜密封的状态下安 装于该反应容器处理装置，并利用所述尖端穿透该薄膜进行液体的吸入。
21. —种诊断装置，其中， 具备权利要求18 20的任一项所述的反应容器处理装置；数据库，其存储有特定的多态性或多个多态性的组合的诊断值；显示装置；和诊断处理装置，其基于利用所述反应容器处理装置检测出的多态性分 析结果，从所述数据库读取诊断值，并显示于所述显示装置。
全文摘要
本发明提供一种适于自动化各种测定的反应容器。其优选方式为在平板状的基板(10)的同一侧作为凹部形成样品注入部(12)、分型(typing)试剂储存部(14)及矿物油储存部(16)，进而还形成多个探针配置部(18)。分型试剂储存部(14)和矿物油储存部(16)被薄膜(20)密封，从薄膜(20)上，用大小为覆盖样品注入部(12)、分型试剂储存部(14)、矿物油储存部(16)及探针配置部(18)的可以剥离的密封材料(22)覆盖基板(10)的表面。用喷嘴(nozzle)进行液体的移送。
文档编号C12N15/09GK101151370SQ20068001075
公开日2008年3月26日 申请日期2006年3月29日 优先权日2005年3月29日
发明者今川僚子, 佐藤里佳, 此下龙, 绪方是嗣, 花房信博, 黑木广幸 申请人:株式会社岛津制作所;凸版印刷株式会社