与降低对细胞凋亡诱导性死亡受体激动剂的抗性有关的试剂和方法

专利名称：：与降低对细胞凋亡诱导性死亡受体激动剂的抗性有关的试剂和方法
技术领域：
：公开的发明总体上涉及抑制对细胞凋亡诱导性死亡受体激动剂的抗性的试剂，和这样的试剂和激动剂和生物标记在治疗癌症和自身免疫病或炎性疾病中的用途。
背景技术：
：TNF-相关的细胞凋亡诱导性配体(TRAIL)是TNF超家族的成员，对癌细胞具有强细胞凋亡诱导性活性(Wiley,S.R.,等1995,Immunity3:673-682)。与TNF超家族的其它死亡谦导性配体(例如TNF-a和Fas配体)不同，TRAIL在癌症治疗剂的开发中具有特别意义，因为它优先诱导肿瘤细胞的细胞凋亡，对正常细胞具有微弱的作用或无作用(Walczak，H.,等1999.NatMed5:157-163)。已经鉴定了至少5种TRAIL受体，其中两种DR4(TRAIL-Rl)和DR5(TRAIL-R2)能够转导细胞凋亡信号(Walczak,H.,等1997.EmboJ16:5386-5397;Pan,G.，等1997.Science276:111-113;Chaudhary,P.M.,等1997,Immunity7:821-830),而其它三种(TRAIL-R3、-R4和OPG)用作阻断TRAIL-介导的细胞凋亡的诱斜受体(Pan,G"等1997.Science277:815-818;Marsters，S.A.，等1997.CurrBiol7:1003-1006;Emery,J.G.，等1998.JBiolChem273:14363-14367)。与Fas和TNFRl相似，DR4和DR5的胞内区段都含有死亡结构域，且通过FADD-和胱天蛋白酶8-依赖性的途径转导细胞凋亡信号(Walczak，H.,等1997.EmboJ16:5386-5397;Chaudhary,P.M.,等1997.Immunity7:821-830;K廳g，A.A.,等2000.JBiolChem275:25065-25068)。重组可溶形式的TRAIL在实验动物(包括小鼠和灵长类动物)中的施用，诱导显著的肿瘤退化，而无全身毒性(Walczak，H.,等1999.NatMed5:157-163)。但是，因为已经表明TRAIL在人类中引发副作用，例如肝毒性，所以已经开发了TRAIL受体的其它激动剂。用独特的激动性单克隆抗-DR5抗体TRA-8和它的人源化的或人版本选择性地耙向DR5,可以有效地且选择性地诱导肺瘤细胞的细胞凋亡。已经发现所有TRAIL-敏感的癌细胞易感TRA-8-介导的细胞凋亡。化疗剂可以体外和体内地协同增强TRAIL-介导的肿瘤细胞的细胞凋亡。例如，TRA-8和阿霉素的联合治疗，导致比单独任一种试剂明显更高的完全肺瘤退化速度(Buchsbaum,D.J.，等2003.ClinCancerRes9:3731-3741)。这些结果表明，化疗剂可能调节DR5的信号转导或诱导细胞凋亡所需的信号传导阈值。基于它的功效和安全性，已经选择TRA-8作为开发癌症治疗的候选物。临床前研究表明，TRA-8在人癌症的异种移植模型中具有非常强的抗癌功效，特别是在与化疗联合时(Buchsbaum,D.J"等2003.ClinCancerRes9:3731-3741)。其它迹象表明，猴能较好地耐受TRA-8的全身施用。TRA-8与猴DR5的结合，类似于与人DR5的结合，且猴耐受的剂量高达48mg/kg剂量。4旦是，l巴细胞对死亡受体的表达，并不一定足以4吏该细胞易感该受体的配体诱导的细胞凋亡。作为实例，尽管大多数癌细胞表达高水平的DR5,但它们不一定易感TRA-8诱导的细胞凋亡，所述TRA-8是对DR5特异性的，且不与诱何受体反应。另外，靶细胞例如癌细胞可以表现出对TRA-8或通过死亡受体(例如，DR4或DR5)诱导细胞凋亡的其它试剂的抗性。本领域需要预测抗性的生物标记，和降低靶细胞对死亡受体激动剂例如TRA-8的抗性的方法。发明概述根据本发明的目的，如本文体现和广泛描述的，本发明在一个方面涉及反转或阻止靶细胞对死亡受体激动剂的抗性的方法，其包含，使靶细胞接触含有CARD的蛋白的一种或多种活性的调节剂，其中所述调节反转或阻止对所述激动剂的抗性。本文提供了筛选细胞的对死亡受体激动剂抗性的生物标记的方法，其包含测定细胞的总DDX3或其同源物，其中高水平指示着对所述激动剂的抗性。本文提供了筛选细胞的对死亡受体激动剂抗'性的生物标记的方法，其包含测定所述死亡受体和含有CARD的蛋白的结合，其中高水平的结合指示着对所述激动剂的抗性。本文提供了筛选细胞的对死亡受体激动剂抗性的生物标记的方法，其包含，a)使细胞接触死亡受体激动剂，b)监控所述死亡受体和含有CARD的蛋白的分数结合，其中结合指示着对所述激动剂的抗性。另外提供了筛选细胞的对死亡受体激动剂抗'性的生物标记的方法，其包含，监控胱天蛋白酶或胱天蛋白酶的调节剂(例如cIAPl、cIAP2、XIAP、存活蛋白)与含有CARD的蛋白的结合，和与来自已知抗性和非抗性的对照细胞的样品比较结合水平，其中IAP以类似于抗性细胞的水平与含有CARD的蛋白的结合，指示着对所述激动剂的抗性。任选地，使待筛选的细胞预先接触死亡受体激动剂(例如激动性抗体)。本文提供了监控受试者中对死亡受体激动剂的抗性的方法，其包含，(a)从所述受试者获取生物样品，和(b)检测含有CARD的蛋白与样品中死亡受体的结合，结合指示着抗性。另外提供了监控受试者中对死亡受体激动剂的抗性的方法，其包含，(a)从所述受试者获取生物样品，和(b)检测胱天蛋白酶或胱天蛋白酶的调节剂与样品中含有CARD的蛋白的结合，结合指示着抗性。也提供了选择性地诱导表达死亡受体的靶细胞的细胞凋亡的方法，其包含下述步骤，(a)使靶细胞接触治疗量的特异性结合死亡受体的死亡受体激动剂，和(b)给靶细胞施用治疗量的含有CARD的蛋白的一种或多种活性的调节剂。提供了治疗患有癌症的受试者的方法，其包含，给所述受试者施用治疗量的(a)死亡受体激动剂，和(b)含有CARD的蛋白的一种或多种活性的调节剂，其中所述调节剂降低对死亡受体激动剂的抗性。也提供了治疗患有炎性疾病或自身免疫病的受试者的方法，其包含，给所述受试者施用治疗量的(a)死亡受体激动剂，和(b)调节含有CARD的蛋白的一种或多种活性的试剂，其中所述调节剂降低对死亡受体激动剂的抗性。本文提供了一种组合物，其包含，(a)死亡受体激动剂，和(b)调节含有CARD的蛋白的一种或多种活性的试剂，其中所述调节剂降低对死亡受体〗敫动剂的抗性。另外提供了包含shRNA的分离的核酸，其中所述shRNA抑制含有CARD的蛋白的表达。也提供了分离的多肽，其编码死亡受体的含有CARD的蛋白结合区，其中所述多肽包含少于25个氨基酸残基。另外提供了分离的多肽，其包含含有CARD的蛋白的死亡受体结合结构域。公开的方法和组合物的其它优点，将在下面的说明书中部分地描述，并可以乂人-说明书中部分地理解，或可以通过实践7>开的方法和组合物来学习。借助于在所附权利要求书中特别指出的元素和组合，可以实现和获得公开的方法和组合物的优点。应当理解，前面的一般描述和下面的详细描述都仅仅是示例性的和解释性的，且不限制要求保护的发明。附图简述附图解释了公开的方法和组合物的几个实施方案，它们引入本说明书中并构成说明书的一部分，且与说明书一起，解释了公开的方法和组合物的原理。图1显示了胂瘤细胞对TRA-8-介导的细胞凋亡的抗性的诱导。图(A)显示了TRAIL-R1和TRAIL-R2的细胞表面表达的流式细胞术分析。用CyChrome-缀合的抗-TRAIL-Rl(2E12)和PE-缀合的抗-TRAIL-R2(2B4)染色人乳A泉癌细胞系MDA-231和人卯巢癌细月包系UL-3C,并通过FACScan流式细胞仪进行分析。图(B)显示了MDA-231和UL-3C细胞对TRA-8、2E12或TRAIL-介导的细胞凋亡的易感性。在96-孔平板中培养细胞，每孔1,000细胞，一式三份，并与指示浓度的每种细胞凋亡诱导剂温育。对于2E12-诱导的细胞凋亡，加入2pg/ml山羊抗-小鼠IgGl，且对于TRAIL-诱导的细胞凋亡，加入抗-Flag抗体作为交联剂。过夜培养后，通过ATPLITE测定来测定细胞生存力。通过处理的孔计数相对于培养基对照的百分比，测得细胞生存力。每个点代表着一式三份的平均值，且代表着至少3个独立实验。图(C)显示了在诱导TRA-8抗性过程中，肿瘤细胞对TRA-8-介导的细胞凋亡的易感性。通过用1ng/ml的TRA-8处理细胞2天，开始诱导TRA-8抗性。TRA-8剂量每隔一天加倍，直到2,000ng/ml。在每个剂量周期，通过ATPLITE测定，测定在每个对应剂量处理下的未诱导的和诱导的细胞的细胞生存力。数据代表一式三份培养物的平均值。图2显示了MDA-231和UL-3C细胞中诱导的TRA-8抗性的选择性。图(A)显示了TRAIL-R2-诱导的MDA-231和UL-3C细胞中的细胞凋亡。亲本和抗性MDA231和UL-3C细^^都用指示浓度的TRA-8处理。图(B)显示了TRAIL-Rl-诱导的MDA-231和UL-3C细胞中的细胞凋亡。亲本和抗性MDA231和UL-3C细胞都用指示浓度的2E12处理。图(C)显示了TRAIL-诱导的MDA-231和UL-3C细胞的细胞凋亡。亲本和抗性MDA231和UL-3C细胞都用指示浓度的重组可溶TRAIL处理。如上所述，过夜培养后，通过ATPLITE测定来测定细胞生存力。图(D)显示了TRA-8抗性的维持。诱导TRA-8抗性后，撤除TRA-8。撤除TRA-8后，每周测定TRA-8抗性的维持。用1,000ng/mlTRA-8处理细胞过夜，且通过ATPLITE测定来测定细胞生存力。图3显示了TRA-8抗性细胞中的TRAIL-R2和相关的细胞凋亡调节表达。图(A)显示了蛋白表达的蛋白印迹分析。在SDS-PAGE上分离全细胞裂解物，并进行蛋白印迹。用1pg/ml第一抗体探测印迹过夜，随后用HRP-缀合的第二抗体探测。通过ECL化学发光，揭示蛋白。图(B)显示了MDA231亲本和抗性细胞的cDNA阵列分析。人细胞凋亡图(上图)和细胞信号传导相关基因图(下图)的膜cDNA阵列购自SuperArray，Inc,。32P标记的cDNA探针从MDA231亲本和抗性细胞的总RNA制备，并与印迹上的cDNA阵列杂交。用CyClone感光成像仪(Phosphor-Imager),分析基因表达概况。图4显示了TRA-8抗性细胞中胱天蛋白酶途径和JNK/p38激酶途径的激活。图(A)显示了TRAIL-R1和-R2-触发的胱天蛋白酶激活。用l,000ng/mlTRA-8(左图)或2E12(右图)处理MDA231亲本和抗性细胞指示的时间。用多克隆抗-胱天蛋白酶8(上图)、抗-胱天蛋白酶3(中图)或抗-PARP(下图)，探测全细胞裂解物的蛋白印迹。箭标指示着全长和切割的蛋白。图(B)显示了JUK/p38激酶途径的激活。以与上述相同的方式，处理细胞。用多克隆抗-磷酸化的JNK(上图)或抗-磷酸化的p38(下图)，探测全细胞裂解物的蛋白印迹。箭标指示着磷酸化的蛋白。图5显示了TRA-8抗性细胞中改变的DISC形成。图(A)显示了DISC形成的共免疫沉淀测定。用1,000ng/mlTRA-8(左图)或2E12(右图)处理MDA231亲本和抗性细胞指示的时间。用2E12或2B4-缀合的琼脂糖4B免疫沉淀TRAIL-R1和TRAIL-R2。用多克隆抗-FADD(上图)或抗-胱天蛋白酶8抗体(中图)或抗-cFLIP抗体(下图)，探测共免疫沉淀的蛋白和全细胞蛋白的蛋白印迹。图(B-E)显示了TRA-8抗性细胞的TRAIL-R2-相关蛋白的二维蛋白组学概况。用1,000ng/mlTRA-8处理MDA231亲本和抗性细胞4小时，或保持未处理作为对照。用2B4-缀合的琼脂糖4B将TRAIL-R2免疫沉淀后，通过二维电泳分离洗脱的蛋白，并用SYPRORuby染色緩沖液染色。通过PDQuest软件，识别出画圏的差异表达的蛋白点。重复实验至少3次，以得到可再现的结果。图6显示了化疗剂对TRA-8抗性的反转。图(A)显示了在有化疗剂存在下，TRA-8抗性细胞对TRA-8-诱导的细胞凋亡的易感性。在没有或有O.lCM紫杉醇、1VM阿霉素、100VM顺铂或5VMBisVin存在下，用可变剂量的TRA-8处理MDA231和UL-3C抗性细^^。过夜培养后，通过ATPLITE测定来测定细胞生存力。图(B)显示了阿霉素对TRA-8抗性细胞中胱天蛋白酶级联的激活。在培养基对照(泳道)中培养MDA231抗性细胞，或用1,000ng/mlTRA-8和1口M阿霉素处理1小时(泳道2)或4小时(泳道3)，或用单独的1VM阿霉素或单独的1,000ng/mlTRA-8处理(泳道5)。用单克隆抗-人胱天蛋白酶抗体探测全细胞裂解物的蛋白印迹。图(C)显示了TRA-8抗性细胞中FADD的TRAIL-R2募集。用2B4琼脂糖4B,免疫沉淀来自上面指出的不同处理的MDA231抗性细胞的TRAIL-R2。通过用抗-FADD抗体4采测的蛋白印迹，测定FADD与TRAIL-R2的共免疫沉淀。图7显示了与TRAIL-R2结合的DDX3。用重组全长DDX3转染MDA231亲本细胞和抗性细胞。转染后48小时，用500ng/mlTRA國8处理细胞指示的时间。用单克隆抗-His抗体探测全细胞蛋白(上图)。(3-肌动蛋白用作加载对照。使用抗-His抗体，进行与TRAIL-R2结合的重组DDX3的共免疫沉淀测定(下图)。为了分析与TRAIL-结合的内源DDX3，用500ng/mlTRA-8处理MDA231亲本细胞和抗性细胞指示的时间。用2B4-缀合的琼脂糖4B免疫沉淀TRAIL-R2。用单克隆抗-DDX3抗体3E2和5A6探测全细胞蛋白(上图)。用单克隆抗-DDX3抗体3E2和5A6探测共免疫沉淀的内源DDX3(下图)。通过抗-TRAIL-R2多克隆抗体的蛋白印迹，测定亲本细胞和抗性细胞中的TRAIL-R2。图8显示了DDX3和TRAIL-R2的相互作用区域的作图。图8A显示了缺失的DDX3的构建体。将编码全长和指示的缺失的DDX3的cDNA克隆进pcDNA3.1-HisA表达载体。用N-末端、C-末端缺失的DDX3和野生型DDX3,转染293细胞。转染后48小时，使用抗-His抗体，通过蛋白印迹，检测重组DDX3表达(上图)。使用抗-His单克隆抗体，通过蛋白印迹分析，测定TRAIL-R2-共免疫沉淀的重组DDX3(中图)。使用抗-TRAIL-R2多克隆抗体，通过蛋白印迹，测定TRAIL-R2(下图)。泳道1:未转染。泳道2-5:N-末端DDX3的A2-5。泳道6-9:C-末端DDX3的A3-6。泳道10:全长DDX3。图8B显示了DDX3与TRAIL-R2的相互作用不依赖死亡结构域。将编码全长和指示的缺失的TRAIL-R2的cDNA克隆进穿梭-CMV载体。用野生型或突变型TRAIL-R2和DDX3,共转染鼠3T3细胞。24小时后，使用TRA-8和PE-缀合的抗-mIgGl,通过流式细胞术分析，检查细胞表面表达。共转染后48小时，用TRA-8免疫沉淀细胞裂解物。使用抗-His抗体，通过蛋白印迹，检查总DDX3(上图)和TRAIL-R2结合的DDX3(中图)。泳道1:未转染；泳道2:单独的DDX3;泳道3:野生型TRAIL-R2和DDX3;泳道4-9:TRAIL-R2的Al-6和DDX3。使用抗-TRAIL-R2多克隆抗体，通过蛋白印迹，测定TRAIL-R2(下图)。图8C显示，将编码全长和指示的截短的TRAIL-R2的cDNA克隆进双启动子表达载体中，其中使用GFP作为报道蛋白。用野生型或突变型TRAIL-R2和DDX3共转染鼠3T3细胞。24小时后，使用TRA-8和PE-缀合的抗-mlgGl，通过流式细胞术分析，检查细胞表面表达。共转染后48小时，用TRA-8免疫沉淀细胞裂解物。使用抗-TRAIL-R2多克隆抗体，通过蛋白印迹测定TRAIL-R2(上图)。使用抗-His抗体，通过蛋白印迹检查总DDX3(下图)和TRAIL-R2结合的DDX3(中图)，泳道1:单独的DDX3;泳道2:ATRAIL-R2-300-330和DDX3;泳道3:AD330和DDX3;泳道4:AD340和DDX3;泳道5:野生型TRAIL-R2和DDX3。图8D显示了TRAIL-R2的DDX3结合区与DcR2和DR4的氨基酸比对。图8E显示了DDX3用作TRAIL-R2和cIAPl之间的连4妻。用500ng/mlTRA-8处理MDA231亲本细月包和MDA231-抗性细胞指示的时间。用2B4-缀合的琼脂糖4B,免疫沉淀TRAIL-R2。用3E4-缀合的琼脂糖4B,免疫沉淀DDX3。用3E4(单克隆抗-DDX3抗体)和1C12(单克隆抗-cIAPl抗体)，探测总DDX3、cIAPl的蛋白印迹(上图)，TRAIL-R2共免疫沉淀的DDX3、cIAPl的蛋白印迹(中图)，DDX3共免疫沉淀的DDX3、cIAPl的蛋白印迹(下图)。使用抗-TRAIL-R2多克隆抗体，通过蛋白印迹测定TRAIL-R2(中图)。图9显示了DDX3的下调反转对TRA-8-诱导的细胞凋亡的抗性。图9A显示了选择的有效的sRNAi-DDX3。用编码耙sRNAi-DDX3的U6-Entry载体，转染MDA231亲本细胞。转染后48小时，使用抗-DDX3抗体，通过蛋白印迹分析测定DDX3表达。P-肌动蛋白用作加载对照。图9B显示了用GFP表达载体和sRNAi-DDX3共转染MDA231-抗性细胞。转染后24小时，通过细胞计量术分选GFP-阳性细胞，并用各种浓度的TRA-8培养过夜。使用抗-DDX3抗体，通过蛋白印迹检测DDX3表达(上图)。用2B4-缀合的琼脂糖4B免疫沉淀TRAIL-R2。用3E4(单克隆抗-DDX3抗体)探测TRAIL-R2结合的DDX3(中图)。转染后24小时，用各种浓度的TRA-8处理细胞过夜。通过ATPLite测定，测定转染的细胞对TRA-8-诱导的细胞凋亡的易感性。图9D显示了通过TUNEL染色，测定经历细胞凋亡的转染的细胞。图9E显示了用对照或DDX3sRNAi寡核苷酸(oligo)转染的癌细胞的图。转染后48小时，使用抗-DDX3抗体，通过蛋白印迹检测减少的DDX3表达。(3-肌动蛋白用作加载对照。图9F显示了转染后24小时，用各种浓度的TRA-8处理细胞过夜。通过ATPLite观'j定，测定转染的细胞对TRA-8-诱导的细胞凋亡的易感性。图10显示了缺少DDX3结合基序的TRAIL-R2是促细胞凋亡的(pro-apoptotic)。使用AD340-TRAIL-R2和DDX3,野生型TRAILED和DDX3,AT300-330-TRAIL-R2和DDX3,共转染鼠3丁3细胞。转染后24小时，用500ng/mlTRA-8处理细胞过夜。使用流式细胞术分析，通过PE-缀合的抗-TRAIL-R2抗体，生物素-缀合的膜联蛋白V,在GFP-阳性细胞中测定细胞凋亡的细胞。通过柱条图，显示细胞凋亡的细月包。图11显示了DDX3用作连接cIAPl和TRAIL-R2的摊f接蛋白。图11A显示了结合DDX3的CARD的cIAPl的作图。用一系列指示的缺失的DDX3(N-末端氨基酸1-氨基酸50缺失的(泳道1)，N-末端氨基酸1-氨基酸100缺失的(泳道2)，N-末端氨基酸1-氨基酸150缺失的(泳道3)和C-末端氨基酸350-氨基酸662缺失的DDX3(泳道4))和全长(泳道5)转染293细胞(上图)。转染后48小时，用镍珠免疫沉淀重组DDX3。使用抗-cIAPl单克隆抗体，通过蛋白印迹分析，测定总cIAPl(中图)和共免疫沉淀的cIAPl(下图)。图11B显示了缺少CARD的DDX3反转TRA-8抗性。用编码全长DDX3(DDX3-FL)或CARD-截短的DDX3(ACARD-DDX3)的腺病毒载体，转染4个TRA國8-抗性肿瘤细胞系。转染后48小时，用TRA-8免疫沉淀细胞裂解物，然后对共免疫沉淀的DDX3(上图)和cIAPl(中图)进行蛋白印迹分析。使用抗-TRAIL-R2多克隆抗体，通过蛋白印迹，测定TRAIL-R2(下图)。图11C显示了通过ATPLite测定测得的细胞生存力。将转染的细胞与500ng/mlTRA-8温育过夜。图12显示了TRAIL-R2/DDX3/cIAPl蛋白复合物阻断TRA-8-抗性细胞中的胱天蛋白酶-8激活和DDX3切割。图12A显示了TRA-8-敏感和-抗性细胞中的TRAIL-R2/DDX3/cIAPl蛋白复合物。用500ng/mlTRA-8处理MDA231亲本(MDA231p)和诱导的抗性(MDA231r)细胞、UL-3C亲本(UL-3Cp)和诱导的抗性(UL-3Cr)细胞8小时。用2B4抗-TRAIL-R2抗体-缀合的琼脂糖4B免疫沉淀全细胞裂解物，并用甘氨酸-HClpH2.0洗脱，且立即用lMTris緩冲液中和。给ELISA平板包被2B4抗-TRAIL-R2抗体，并用3%BSAPBS封闭。与来自TRAIL-R2co-IP的蛋白复合物温育后，用生物素-缀合的多克隆抗-TRAIL-R2抗体检测TRAIL-R2,随后用HRP-缀合的链霉抗生物素蛋白检测。图12B显示了用生物素-缀合的3E2(抗-DDX3抗体)检测DDX3,随后用HRP-缀合的链霉抗生物素蛋白检测。图12C显示了用生物素-缀合的1C12(抗-cIAPl抗体)检测cIAPl，随后用HRP-缀合的链霉抗生物素蛋白检测。图12D显示了DDX3对胱天蛋白酶-介导的切割的不同易感性。使用2B4抗-TRAIL-R2抗体-缀合的琼脂糖4B,通过免疫沉淀，从指示的细胞分离DDX3,并与指示的胱天蛋白酶-2或胱天蛋白酶-8在37。C温育4小时。图12E显示了使用5A6作为捕获抗体和3E2作为检测抗体，通过夹心ELISA测量DDX3的量。将结果表示为切割后的DDX3相对于未切割的对照的百分比。图12F显示了DDX3/cIAPl复合物对胱天蛋白酶8活性的作用。使用2B4抗-TRAIL-R2抗体-缀合的琼脂糖4B，通过免疫沉淀，从指示的细胞分离DDX3，并在有胱天蛋白酶-8的荧光底物Ac-IETD-AMC存在下，与重组的有活性的人胱天蛋白酶-8温育2小时。通过降低的荧光强度，测量胱天蛋白酶8的抑制。将结果表达为对照孔中最大活性的百分比。图13显示了DDX3的富含丝氨酸的结构域在调节结合和切割中的作用。图(A)显示了GSK3底物的保守结构域。图(B)显示了GSK3a共免疫沉淀的DDX3(上图)。用或不用锂，用TRA-8处理TRA-8敏感MDA231细胞2小时。用抗-GSK3a珠免疫沉淀全细胞裂解物。使用抗-DDX3抗体，通过蛋白印迹，分析含有GSK3a的蛋白。GSK3磷酸化DDX3(B,下图)。重组DDX3和tau用作底物，与GSK(有或没有PKA)温育1小时。计数掺入的32P，并表达为cpm。(C)GSK3不石粦酸化Ser90突变型DDX3。(D)用野生型DDX3和Ser90突变型DDX3转染MDA231细胞。TRA-8处理后，测定DDX3从DR5的解离和DDX3的切割。发明详述参考下面具体实施方案和其中包含的实施例的详述，以及附图和它们在前面和后面的描述，可以更容易地理解7>开的方法和组合物。诱导死亡受体-介导的肿瘤细胞的细胞凋亡，是癌症治疗的特别有前途的方案。与在大多数(如果不是全部的话)治疗中一样，有些靶细胞是抗性的。作为实例，TRA-8(独特的激动性单克隆抗-DR5抗体)诱导人癌细胞的细胞凋亡，而没有肝细胞细胞毒性(Ichikawa，K.,等2001.NatMed7:954-960)，在动物模型中表现出强抗癌功效(Buchsbaum，DJ.,等2003.ClinCancerRes9:3731-3741)，且已经在非人灵长类动物的毒性研究中证实了安全性。因而，TRA-8用作本文的实例，但是逸过死亡受体(例如，DR4或DR5)激活来诱导细胞凋亡的其它试剂可以用于本文教导的方法中。尽管TRA-8和它的人源化的和人版本在临床开发中用作抗癌治疗，但有些胂瘤细胞系对TRA-8-介导的细胞凋亡是抗性的，尽管存在合理水平的DR5表达。这些观察表明，抗性与受体表达无关，而是与DR5-启动的信号传导机理有关。确定地，DR5-介导的细胞凋亡可以被普通化疗剂显著增强(Ohtsuka，T.,和T,Zhou.2002.JBiolChem277:29294-29303;Ohtsuka，T"D.等2003.Oncogene22:2034-2044)。公开了通过耙向含有CARD的蛋白的家族，抑制对死亡受体激动剂的抗性的组合物和方法，所述蛋白结合死亡受体，并抑制胱天蛋白酶激活。应当理解，除非另有说明，公开的方法和组合物不限于特定合成方法，特定分析才支术，或特定试剂，且同样可以变化。也应当理解，本文使用的术语仅仅用于描述特定实施方案的目的，而无意进行限制。公开了可以用于公开的方法和组合物的材料、组合物和组分，或者可以与其联合使用，可以用于其制备中，或是它们的产物。在本文中公开了这些和其它材料，且应当理解，当公开了这些材料的组合、子集、相互作用、组等时，尽管可能没有明确地公开这些化合物的每种不同的单个的和集合的组合和变换的具体参考，但各自在本文中特别地预期并予以描述。例如，如果公开和讨论载体，并讨论许多载体组分，包括启动子，则特别地预期启动子和其它可行载体组分和修饰的各自和每种组合和变换，除非特别地相反说明。因而，如果公开了一类分子A、B和C,以及一类分子D、E和F,并公开了组合分子的实例A-D,则即使没有单独指出每一种，也单个地和共同地预期每一种。因而，在该实例中，特别地预期每一种组合A-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E和C-F,并应当3见为由A、B和C;D、E和F;和示例组合A-D的公开内容所公开的。类似地，也特別地预期和公开了它们的任意子集或组合。因而，例如，特别地预期亚组A-E、B-F和C-E，并应当4见为由A、B和C;D、E和F;和示例组合A-D的/>开内容所公开的。该概念适用于本申请的所有方面，包括但不限于，制备和使用公开的组合物的方法的步骤。因而，如果可以进行许多额外步骤，则应当理解，每种这样的额外步骤可以用公开方法的任意特定实施方案或实施方案的组合来实现，且特别地预期每种这样的组合，且应当视作是公开的。本文提供了许多序列，且它们和其它序列可以参见Genbank，'www.pubmed.gov，。本领域技术人员理解如何分辨序列不一致和差异，并将与特定序列有关的组合物和方法调整为其它相关序列。已知本文公开和本领域已知的信息，可以为任意序列设计引物和/或探针。提供了反转或阻止靶细胞对死亡受体激动剂的抗性的方法，其包含，使靶细胞接触含有CARD的蛋白的一种或多种活性的调节剂，其中所述调节反转或阻止对所述激动剂的抗性。该方法可以用于细胞凋亡信号传导研究和疾病的治疗性处理，所述疾病例如癌症和自身免疫病和炎性病症。因而，可以体内或体外地进行该方法的接触步骤。在全文中使用的"反转"指改变成相反位置、方向或进程，例如使疾病进程从恶化变成好转。例如，在死亡受体抗性的情况下，反转靶细胞对死亡受体激动剂的抗性是指，使所述细胞对所述激动剂的抗性更低，因而，例如，反转100%抗性的把细胞的抗性，可以导致所述靶细胞对死亡受体激动剂是90%-0%抗性的，包括90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%和0%抗性的。在全文中使用的"阻止"指排除、防止、消除、抢先、停止或阻碍某事的发生，特别是通过预先计划或行为。例如，在死亡受体抗性的情况下，阻止靶细胞对死亡受体激动剂的抗性是指，使所述细胞变成对所述激动剂抗性的能力更低。因而，例如，阻止靶细胞的100%抗性，可以导致所述耙细胞对死亡受体激动剂仅仅是0%-90%抗性的，包括0%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%和90%抗性的。"反转"或"阻止"是指量级的变化或量级的任何变化的延迟。因而，在死亡受体抗性的情况下，"反转"或"阻止"包括降低增加抗性的20进程，或延迟抗性的增加。必须指出，本文和所附权利要求书中使用的单数形式"一个(a)"、"一种(an)"和"该(the)"包括复数形式，除非上下文另有清楚说明。因而，例如，"一种多肽"包括许多这样的多肽，"该多肽"指一种或多种多肽和本领域技术人员已知的等同物，等等。"任选的"或"任选地"指，随后描述的事件、情况或材料可能或可能不发生或存在，且该描述包括所述事件、情况或材料发生或存在的情况，和它不发生或不存在的情况。范围在本文中表达为从"约"一个特定值，和/或至"约"另一个特定值。当表达这样的范围时，也特别地预期且视作公开了从一个特定值和/或至另一个特定值的范围，除非上下文另有特别说明。类似地，当使用前缀"约"将值表达为近似值时，应当理解该特定值构成特别地预期的视作公开的另一个实施方案，除非上下文另有特别说明。还应当理解，每个范围的端点在与其它端点有关和独立于其它端点时都是重要的，除非上下文另有特別说明。最后，应当理解，也特别地预期且视作公开了在明确公开的范围内包含的所有单个值和值的子范围，除非上下文另有特别说明。无论在具体情况下，是否明确公开了有些或全部这样的实施方案，前述内容都适用。在全文中使用的"靶细胞"指携带靶向的死亡受体的细胞，包括，例如，表达DR5或DR4的纟田胞，且示例地包括异常生长的细胞和肿瘤细胞，例如乳头状瘤和疣；乳腺癌、结肠癌、肝癌、白血病、肺癌、黑素瘤、骨髓瘤、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、头和颈癌、甲状腺癌、子宫癌和脑肿瘤例如星形细胞瘤、活化的免疫细胞(如活化的淋巴细胞、淋巴样细胞和髓样细胞)、炎性细胞、类风湿性关节炎滑膜细胞和病毒感染的细胞。在体内，所述耙细胞是患有病理状况况，例如癌症和类风湿性关节炎。靶细胞包括人;、非人灵长类动物:猫、狗、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、山羊、绵羊、牛、马、鸡、猪、狨猴和雪貂细胞，或各种细胞系的细胞(例如，Jurkat纟田胞)。"死亡受体"是指一旦被配体结合后，诱导细胞的细胞凋亡的受体。死亡受体包括，例如，具有死亡结构域的肿瘤坏死因子(TNF)受体超家族成员(例如，TNFR1，Fas,DR3、4、5、6)和没有死亡结构域的TNF受体超家族成员LTbetaR、CD40、CD27、HVEM。通过例如DR5的信号转导，是控制DR5-介导的细胞凋亡的关键机理。TNFR超家族的死亡受体的共同特征是，它们在其胞质尾巴中都具有保守的"死亡结构域"(Zhou,T"等2002.ImmunolRes26:323-336)。非常确定的是，在死亡结构域处启动DR5-介导的细胞凋亡。TRAIL或激动性抗-DR5抗体与细胞表面上的DR5的交联，导致DR5的寡聚化，此后立即将FADD募集到DR5的死亡结构域(Bodmer，J丄.，等2000.NatCellBiol2:241-243;Chaudhary,P.M.,等1997.Immunity7:821-830;Kuang，A.A.，等2000.JBiolChem275:25065-25068;Schneider,P"等1997.Immunity7:831-836;Sprick,M.R.，等2000.Immunity12:599-609)。死亡结构域连接的FADD进一步募集起始物胱天蛋白酶原8和/或胱天蛋白酶原10，以通过嗜同性DD相互作用形成DISC(Krammer，P.I1.2000.Nature407:789-795)。激活的胱天蛋白酶8和10可以直接激活胱天蛋白酶3，或切割含有BH3的蛋白Bid,以通过细胞色素C的释放和胱天蛋白酶9激活，激活线粒体-依赖性的细月包凋亡途径(Desagher，S.,和丄C.Martinou.2000.TrendsCellBiol10:369-377;Scaffidi,C.，等1998.EmboJ17:1675-1687)。在形成死亡结构域复合物后，激活几个信号转导途径，例如胱天蛋白酶、NF-kB和JNK/p38。这些信号传导途径的激活，导致通过Bcl-2和IAP家族的蛋白，调节死亡受体-介导的细胞凋亡。"激动剂"是指物质(分子、药物、蛋白等)，它能组合细胞上的受体(例如死亡受体)，并启动一4殳地通过结合内源配体产生的相同反应或活性(例如，细胞凋亡)。本方法的激动剂可以是死亡受体配体。因而，激动剂可以是TNF、Fas配体或TRAlL。激动剂还可以是这些配体的片段，其包含死亡受体结合结构域，从而使得该片段能结合和激活死亡受体。激动剂还可以是融合蛋白，其包含死亡受体结合结构域，从而使得该融合蛋白能结合和激活死亡受体。激动剂还可以是融合蛋白，其包含死亡受体结合结构域，从而使得该融合蛋白能结合和激活死亡受体。激动剂还可以是这样的多肽，它的氨基酸序列与TNF、Fas或TRAIL具有至少85%同源性，从而使得同源物能结合和激活死亡受体。激动剂还可以是结合死亡受体的细胞凋亡诱导性抗体。"抗体"可22以是单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、人源化抗体、全人抗体或其任何Fab或F(ab')2片段。"细胞凋亡诱导性抗体"是指在使用本文提供的方法激活之前或之后，造成程序性细胞死亡的抗体。因而，本方法的激动剂可以是对Fas、TNFR1或TRAIL死亡受体特异性的抗体，从而使得该抗体激活死亡受体。激动剂可以是对DR4或DR5特异性的抗体。激动剂可以是与小鼠-小鼠杂交瘤具有相同表位特异性或由它分泌的DR5抗体，所述小鼠-小鼠杂交瘤具有ATCC登记号PTA-1428(例如，TRA-8抗体)、ATCC登记号PTA-1741(例如，TRA-1抗体)、ATCC登记号PTA-1742(例如，TRA-10抗体)。激动剂可以是与具有ATCC登记号PTA-3798的杂交瘤(例如，2E12抗体)具有相同表位特异性或由它分泌的抗体。本方法的抗体靶向的TRAIL受体可以是DR4或DR5。这样的受体记载在公开的专利申请WO99/03992、W098/35986、W098/41629、W098/32856、WO00/66156、W()98/46642、W098/5173、WO99/02653、WO99/09165、W099/11791、W099/12963和公开的美国专利号6,313,269中，它们都关于本文教导的受体，整体在本文中引作参考。使用本领域已知的方法，可以生成对这些受体特异性的单克隆抗体。参见，例如，Kohler和Milstein，Nature,256:495-497(1975)和Eur.J.Immunol.6:511-519(1976)，它们都关于这些方法，整体在本文中引作参考。也参见在公开的专利申请WO01/83560中教导的方法，它整体在本文中引作参考。本方法的抗体可以是本领域已知的抗体，包括，例如，与小鼠-小鼠杂交瘤具有相同表位特异性或由它分泌的DR5抗体，所述小鼠-小鼠杂交瘤具有ATCC登记号PTA-1428(例如，TRA-8抗体)、ATCC登记号PTA-1741(例如，TRA-1抗体)、ATCC登记号PTA-1742(例如，TRA-10抗体)。其它实例包括与具有ATCC登记号PTA-3798的杂交瘤(例如，2E12抗体)具有相同表位特异性或由它分泌的抗体。"含有CARD的蛋白"是指含有胱天蛋白酶-相关募集结构域(CARD)的蛋白的家族，且其特征在于，结合死亡受体的能力，其中结合任选地在死亡结构域的外面，并通过所述死亡受体的死亡结构域，调节细胞凋亡的激活。DDX3是该家族的代表成员。含有CARD的蛋白包括DEAI)(SEQIDNO:21)框蛋白家族的RNA解旋酶。公开的含有CARD的蛋白可以是，例如，DDX3(SEQIDNO:25,登记号gi:13514816)、mda-5(登记号gi:U344593)或RIG誦1(登记号gi:6048564)。含有CARD的蛋白还可以是这样的多肽，它的氨基酸序列与DDX3、mda-5或RIG-1具有至少85%同源性。DEAD-框蛋白家族的RNA解旋酶在细菌至哺乳动物之间是高度保守的，参与许多包含RNA的代谢过程，且是细胞存活至关重要的(Heinlein，U.A.1998.JPathol184:345-347)。该蛋白家族的所有成员都具有由特征性氨基酸序列D-E-A-D(Asp-Glu-Ala-Asp，SEQIDNO:21)组成的ATP酶基序，该家族由此得名。通常认为DEAD(SEQIDNO:21)框蛋白是翻译起始、RNA剪接、核糖体装配、RNA降解、mRNA稳定性和RNA编辑必需的RNA解旋酶，如核糖核酸结合蛋白。尽管有些这样的RNA解旋酶在特殊转录因子的翻译中起重要作用，但有些的超表达与癌发生有关。DDX1在成神经细胞瘤中与N-myc共扩增(George,R,E"等1996.Oncogene12:1583-1587;Godbout,R.,等1998.JBiolChem273:21161-21168)。与匹配的正常组织相比，RNA解旋酶p68在肿瘤中一贯地超表达。积累的p68似乎是多便在蛋白化的，从而表明这些肺瘤中在蛋白酶体-介导的降解中可能有缺陷(Causevic，M.,等2001.Oncogene20:7734-7743),从而表明在胂瘤发育过程的早期发生p68表达的调节异常。DEAD(SEQIDNO:21)框蛋白/RNA解旋酶家族的rck/p54,可能通过增加c-myc蛋白的合成，在翻译水平有助于人结直肠肺瘤发展中的细胞增殖和癌发生(Hashimoto,K"等2001.Carcinogenesis22:1965-1970)。DDX3是该家族的成员，尽管不知道DDX3的RNA解旋酶功能(Fu，J丄，等2002.ShengWuHuaXueYuShengWuWuLiXueBao(Shanghai)34:655-661)。已经寺艮道，DDX3能与HCV核心蛋白相互作用，并调节HCV病毒蛋白的翻译(Owsianka,A.M.,和A.H.Patel.1999.Virology257:330-3400)。有些RNA解旋酶含有保守的CARD(胱天蛋白酶募集结构域；Yoneyama,M.,等2004.NatImmunol5:730-737;Kang，D.C.,等2004.Oncogene23:1789-1800;Kang,D.C.，等2002.ProcNatlAcadSciUSA99:637-642)。消减式杂交鉴别出黑素瘤分化-相关基因-5(mda-5)作为在分化、癌反转和程序性细胞死亡(细胞凋亡)过程中诱导的基24因。该基因含有胱天蛋白酶募集结构域和推定的DExH组RNA解旋酶结构域。Mda-5可以起IFN-诱导的生长抑制和/或细胞凋亡的介质的功能(Kang,D.C.,等2002.ProcNatlAcadSciUSA99:637-642)。最近的研究表明，mda-5mRNA的水平在正常组织中低，然而IFN-卩在广泛的正常细胞和癌细胞中诱导表达。借助于无复制能力的腺病毒表达mda-5，Ad.mda-5，诱导HO-l细胞的凋亡，如通过形态学、生物化学和分子测定所证实的(Kang，D.C"等2004.Oncogene23:1789-1800)。视黄酸诱导型基因I(RIG-I)编码含有胱天蛋白酶募集结构域的DExD/H框RNA解旋酶，该基因是dsRNA-诱导的信号传导的重要调节剂，如通过功能筛选和测定所评价的。具有完整ATP酶活性的解旋酶结构域负责dsRNA-介导的信号传导。胱天蛋白酶募集结构域传递'下游'信号，从而导致转录因子NF-kB和IRF-3的激活。这些因子的随后基因激活诱导抗病毒功能，包括I型干扰素生产(Yoneyama,M.，等2004.NatImmunol5:730-737》已经将含有胱天蛋白酶-相关募集结构域(CARD)的蛋白视作细胞死亡的关键调节剂。CARD由在某些胱天蛋白酶的前结构域的N-末端中发现的保守a螺旋束组成。也可以在许多种其它蛋白中发现CARD。与死亡结构域蛋白相似，CARD起同型蛋白相互作用基序的功能，其允许通过CARD/CARD相互作用，进行蛋白通讯。具有CARD的蛋白可以是促细胞凋亡的或抗细胞凋亡的。促细胞凋亡的CARD蛋白包括某些胱天蛋白酶例如胱天蛋白酶2、4和9,和Apafl,它们在细胞凋亡的起始中起重要作用。代表性抗细胞凋亡的CARD蛋白包括cIAPl和cIAP2，它们与胱天蛋白酶的CARD相互作用，并通过它们的BIR结构域，抑制胱天蛋白酶激活。该蛋白家族的功能的许多方面指向它们作为治疗癌症的新药物靶的潜在应用。几种含有CARD的蛋白是保守的细胞死亡机器的关键组分，它们在调节异常时，促进肺瘤发生，并为肺瘤对化疗的抗性作出显著贡献。促细胞凋亡的蛋白Apafl(它在有些癌症中是未激活的)是线粒体-诱导的细胞凋亡不可缺少的CARD蛋白。其它抗细胞凋亡的CARD蛋白，例如IAP家族的蛋白，已经表明可保护肿瘤免于细胞死亡刺激，并在某些形式的癌症中超表达。因此，激活或抑制CARD蛋白的治疗剂，当与常规化疗耳关合使用时，可以用作化学敏化剂或细胞凋亡调节剂。25对死亡受体激动剂的抗性可以归因于公开的含有CARD的蛋白的活性。因此，本方法提供了组合物，其调节含有CARD的蛋白的一种或多种活性，以阻止所述抗性。"调节"是指形式或功能的上调、下调、激活、拮抗或以其他方式改变。蛋白的"活性"包括，例如，转录、翻译、细胞内易位、分泌、由激酶磷酸化、蛋白酶切割、与其它蛋白的嗜同性和嗜异性结合、遍在蛋白化。因为含有CARD的蛋白的活性部分地归因于死亡受体结合氨基酸处或附近的磷酸化，所以提供的调节剂可以是含有CARD的蛋白磷酸化的抑制剂。因而，调节剂可以是激酶或磷酸酶的抑制剂。作为实例，调节剂可以是糖原合酶激酶-3(GSK-3)活性的抑制剂。GSK-3是在许多种生物包括哺乳动物中发现的蛋白激酶。存在2种几乎相同形式的GSK-3:GSK-3a和GSK-3(3。抑制剂可以是任意已知的或新发现的GSK-3抑制剂。任选地，提供的方法的GSK-3抑制剂至少抑制GSK-3(3。从Genbank登记号P49841可以得到人GSK-3(3的氨基酸序列，且从登记号NM—002093可以得到对应的核苷酸序列。为了实验和筛选目的，可能需要使用动物模型。例如，可以从Genbank登记号P18266得到大鼠GSK-3P序列，且从Genbank登记号AAD39258得到小鼠的。本文使用的GSK-3抑制剂是直接或间接地降低细胞中GSK-3活性水平的化合物，这通过竟争性或非竟争性酶抑制；通过降低蛋白水平，例如通过耙向的遗传破坏，减少GSK-3基因的转录，增加蛋白不稳定性，等。抑制剂可以是小有机或无机分子、反义核酸、抗体或源自它们的片段等。通过筛选组合文库或其它化学文库对GSK-3活性的抑制，可以发现GSK-3的其它抑制剂。GSK-3蛋白的直接抑制剂的实例包括锂(Li+)(Klein等1996)，它有效地抑制GSK-3P活性(Kf2mM),但不是其它蛋白激酶的普通抑制剂。铍离子(Be^)是GSK-3的更强抑制剂，以微摩尔范围进行抑制。但是，该抑制作用的选择性不如锂，因为它在低剂量时也抑制CDK1。GSK-3^卩制剂也包^舌aloisine、aloisineA、kenpaullone。Aloisine(7-正丁基-6-(4-甲氧基苯基)[5H]吡咯并[2,3-b]吡嗪)是Cdkl/B(IC50=700nM)、Cdk5/p35(IC50=1.5uM)和GSK-3(IC50=920nM)的有效的、选择性的、细胞透性的和ATP-竟争性的抑制剂(MetteyY,等(200"JMedChem.46(2):222-36),在本文中整体引作关于与该分子有关的教导的参考。AloisineA(7-正丁基七-(肛羟基苯基)[5H]吡咯并[2,34]吡。秦)是细胞透性的化合物，其起细胞周期蛋白依赖性激酶、c-JunN-末端激酶(JNK)和糖原合酶激酶-3(GSK-3)(GSK-3a，IC50=500nM)(GSK-3p，IC50=1.5uM)的有效的、选择性的、可逆的和ATP-竟争性的抑制剂的作用(MetteyY,等(2003)JMedChem.46(2):222-36),在本文中整体引作关于与该分子有关的教导的参考。Kenpaullone(9-溴-7，12-二氢吲哚并[3,2-(1][1]苯并氮杂萆-6(5^-酮)是糖原合酶激酶-3b(GSK3b，IC50=230nM)、Lck和细胞周期蛋白依赖性激酶(Cdks)的有效的、细胞透性的抑制剂(SchultzC,等(19")J.Med,Chem.42(15):2909-19;ZaharevitzDW，等(1999)CancerRes.59(11):2566-9;KunickC,等(2004)J.Med.Chem.47(1):22-36),在本文中整体引作关于与该分子有关的教导的参考。已经发现许多其它化合物抑制GSK-3。大多数通过与ATP-结合位点的相互作用，抑制激酶活性。它们包括二吲咮-和苯胺基马来酰亚胺、Aldisine生物碱、Paullone、欷玉红和Pyraloquinoxalines。例如,Paullone和它们在GSK-3抑制中的应用，记载在，例如，KunickC,等JMedChem.2004Jan1;47(1):22-36,在本文中整体引作关于PauIlone的教导的参考。这样的化合物在体外在纳摩尔浓度是有效的，且在体内在低微摩尔是有效的。另外，尽管已经表明许多是有效的，但是它们对GSK-3不是非常特异性的，且通常会在类似水平抑制相关的CDK。但是，已经表明两种结构上不同的马来酰亚胺(SB216763和SB415286)是有效的，且对GSK-3具有高度特异性。在细胞研究中，它们可以有效地替代锂作为GSK-3抑制剂。还已经发现，称作剂的作用(国际:专利申请WO99/47522,在本文中引作关于这些化合物的教导的参考)。GSK-3的有些间接的抑制剂包括渥曼青霉素，它激活蛋白激酶B,从而导致GSK-3的磷酸化和抑制。主要通过J33-肾上腺素受体起作用的异丙基肾上腺素，将GSK-3活性降低到与胰岛素类似的程度(约50%)(Moule等1997)。p70S6激酶和p90rsk-l也磷酸化GSK-3(3，从而导致它的抑制。使用GSK-3-特异性的肽，也可以选择性地靶向GSK-3。例如，在晚期T-细胞淋巴瘤1中经常重排的(FRAT1)是GSK3-结合蛋白(GBP)的哺乳动物同源物。FRATtide(与FRAT1的残基188-226相对应的肽)结合GSK3,并阻断GSK3-催化的轴蛋白(Axin)和|3-联蛋白的磷酸化(ThomasGM，等FEBSLett.1999Sep17;458(2):247-51)。提供的方法的GSK-3抑制剂也可以是功能性核酸。功能性核酸是具有特定功能的核酸分子，所述功能例如结合靶分子或催化特定反应。功能性核酸分子可以分成下述类别，这不是限制性的。例如，功能性核酸包括反义分子、适体、核酶、三链体形成分子、RNAi和外部指导序列。功能性核酸分子可以起靶分子具有的特定活性的影响因子(affector)、抑制剂、调节剂和刺激物的功能，或者功能性核酸分子可以具有独立于任何其它分子的新生活性。因为在死亡受体-诱导的细胞凋亡过程中可以切割含有CARD的蛋白，所以本方法的调节剂可以通过促进含有CARD的蛋白的切割来起作用。作为实例，DDX3与DR5解离，并在TRA-8-诱导的细胞凋亡的过程中被切割(图9A和C),同时募集FADD(图9E)。DDX3的一个切割位点是氨基酸残基132-135之间的相对保守的DEDD(SEQIDNO:7)基序，它可以被胱天蛋白酶2、3、7或10切割。因而，调节剂可以是切割含有CARD的蛋白(例如DDX3)的胱天蛋白酶或胱天蛋白酶衍生物。因为含有CARD的蛋白的活性依赖于它与死亡受体的结合，所以本方法的调节剂可以是含有CARD的蛋白和死亡受体之间的相互作用的抑制剂。在一种情况下，调节剂是在死亡受体-结合位点结合含有CARD的蛋白的物质(药物、分子、多肽等)。因而，调节剂可以是多肽，它包含与含有CARD的蛋白的结合位点相对应的死亡受体的氨基酸。例如，调节剂可以是包含DR5(SEQIDNO:22,登记号gi:3721878)的氨基酸250-340的多肽。因而，调节剂可以包含氨基酸序列SEQIDNO:23。调节剂还可以是包含氨基酸序列SEQIDNO:23的片段的多肽，从而使得该片段能结合DDX3。作为实例，调节剂可以是包含DR5(SEQIDNO:22,登记号gi:3721878)的氨基酸280-310的多肽。因而，调节剂可以包含氨基酸序列SEQIDNO:24。作为另一个实例，调节剂可以是包含DR5(SEQIDNO:22，登记号gi:3721878)的氨基酸300-330的多肽。因而，调节剂可以包含氨基酸序列SEQIDNO:36。或者，调节剂可以是结合死亡受体的含有CARD的蛋白的结合位点但不抑制细胞凋亡的物质(药物、分子、多肽等)。调节剂可以是多肽，它包含与含有CARD的蛋白的死亡受体-结合位点相对应的氨基酸。本方法的调节剂可以影响含有CARD的蛋白阻止激活胱天蛋白酶-依赖性的细胞凋亡的能力。含有CARD的蛋白的CARD结构域参与募集细胞凋亡的抑制剂(IAP)，其抑制病毒感染过程中宿主细胞的细胞凋亡(Crook,N.E.，等1993.JVirol67:2168-2174)。IAP家族通过与成熟胱天蛋白酶相互作用并抑制它的酶活性，拮抗细胞死亡。已经鉴别出8种不同的哺乳动物IAP，包^舌XIAP、c-IAPl、c-IAP2和ML-IAP/Liuin(参见,例如，Ashhab,Y.,等2001.FEBSLett495:56-60;Kasof,G.M"和B.C.Gomes.2001.JBiolChem276:3238-3246;Vucic，D.,等2000.CurrBiol10:1359-1366，它们都在本文中整体引作参考，与这些IAP分子相关)。所有IAP都含有1-3个杆状病毒IAP重复(BIR)结构域，且具有同源序列(CX2CX16HX6C)。通过BIR结构域，IAP分子结合并直接抑制胱天蛋白酶(Deveraux,Q丄.，和J.C.Reed.1999.GenesDev13:239-252;Deveraux，Q丄"等1997.Nature388:300-304;Deveraux,Q丄.,和J.C.Reed.1999.GenesDev13:239-252,它们都在本文中整体引作参考，与IAP和胱天蛋白酶的相互作用有关)。线粒体蛋白Smac/DIABLO能结合和拮抗IAP(Suzuki，Y.,等2001.JBiolChem276:27058-27063),以抑制IAP功能(Wieland,I.，等2000.OncolRes12:491-500)(引用的文献都在本文中整体引作参考，与IAP的抑制有关)。因而，本方法的调节剂可以是CARD-依赖性的结合的抑制剂。调节剂可以影响含有CARD的蛋白募集胱天蛋白酶或胱天蛋白酶调节剂(如IAP)的能力。调节剂可以是结合含有CARD的蛋白的物质(药物、分子、多肽、融合蛋白、抗体、抗体片段等)，从而使得含有CARD的蛋白具有降低的IAP结合和募集。调节剂可以是含有CARD的蛋白-结合片段，例如，它属于胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-4或胱天蛋白酶-5、cIAPl、cIAP2、XIAP或存活蛋白。调节剂还可以是靶细胞中IAP或含有CARD的蛋白基因表达的抑制剂。存在各种已知的抑制细胞中蛋白表达的方法，包括三链体形成分子、核酶、外部指导序列、反义分子和RNAi分子。反义分子被设计成，通过规范的或非规范的碱基配对，与靶核酸分子相互作用。反义分子和靶分子的相互作用被设计成，促进靶分子的破坏，这通过例如，RNA酶H介导的RNA-DNA杂交体降解实现。或者，反义分子设计用于中断通常在靶分子上发生的加工功能，例如转录或复制。可以基于靶分子的序列，设计反义分子。存在许多最优化反义效率的方法，其通过发现靶分子的最易接近的区域实现。示例方法是体外选择实验和使用DMS和DEPC的DNA修饰研究。优选地，反义分子以小于或等于10-6、10-8、10-10或10-12的解离常数(Kd)结合靶分子。辅助设计和使用反义分子的方法和技术的代表性实例可以参见，美国专利号5,135,917、5,294,533、5,627,158、5,641,754、5,691,317、5,780,607、5,786,138、5,849,903、5,856,103、5,919,772、5,955,590、5,990,088、5,994,320、5,998,602、6,005,095、6,007,995、6,013,522、6，017，898、6,018,042、6，025，198、6,033,910、6,040,296、6,046,004、6,046,319和6,057,437，它们在本文中整体引作关于反义分子的方法和技术的参考。适体是能与靶分子相互作用的分子，优选地以特异性的方式。通常，适体是长度为15-50个碱基的小核酸，所述核酸折叠成确定的二级和三级结构，例如茎-环或G-四集体。适体可以结合小分子，例如ATP(美国专利号5,631，146)和茶碱(theophiline)(美国专利号5,580,737)，以及大分子，例如逆转录酶(美国专利号5,786，462)和凝血酶(美国专利5,543,293)。适体可以以小于l(T12M的Kd,非常紧密地结合靶分子。优选地，适体以小于1(T6、10—8、IO"Q或10—12的Kd,结合靶分子。适体可以以非常高度的特异性，结合靶分子。例如，已经分离出这样的适体，它与靶分子的结合亲和力比与另一种仅在分子上一个位置处不同的分子的结合亲和力有大于10,000倍的差异(美国专利号5,543,293)。优选地，适体与靶分子的Kd为与背景结合分子的Kd的至少1/10、1/100、1/1000、1/10,000或1/100,000。优选地，当例如，对比多肽时，背景分子是不同的多肽。如何制备和使用适体来结合许多不同的靶分子的代表性实例，可以参见美国专利号5,476,766、5,503,978、5,631,146、5,731,424、5,780,228、5,792,613、5，795,721、5，846，713、5,858,660、5,861,254、5,864,026、5,869,641、5,958,691、6,001,988、6,011,020、6,013,443、6,020,130、6,028,186、6,030,776和6,051,698,它们在本文中整体引作关于适体的方法和技术的参考。核酶是能分子内地或分子间地催化化学反应的核酸分子。核酶因而是催化性的核酸。优选地，核酶催化分子间反应。存在许多不同类型的核酶，它们催化核酸酶或核酸聚合酶类反应，这基于在天然系统中发现的核酶，例如锤头核酶(美国专利号5,334,711、5，436，330、5,616,466、5,633,133、5,646,020、5,652,094、5,712,384、5,770,715、5,856,463、5，861，288、5,891,683、5,891,684、5,985,621、5，989，908、5,998,193、5,998,203;Ludwig和Sproat的国际专利申请号WO9858058、Ludwig和Sproat的WO9858057禾口Ludwig禾口Sproat的WO9718312)发夹型核酶(例如，美国专利号5，631，115、5,646,031、5,683,902、5,712,384、5,856,188、5,866,701、5,869,339和6,022,962)和四膜虫核酶(例如，美国专利号5,595,873和5,652,107)。也存在许多在天然系统中未发现、但是已经从头工程改造来催化特定反应的核酶(例如，美国专利号5,580,967、5,688,670、5,807,718和5,910,408)。优选的核酶切割RNA或DNA底物，且更优选地切割RNA底物。核酶通常通过识别和结合耙底物，随后进行切割，来切割核酸底物。该识别经常是主要基于规范的或非规范的碱基对相互作用。该性质使得核酶成为靶特异性的核酸切割的特别良好的候选物，因为靶底物的识别是基于靶底物序列的。如何制备和使用核酶来催化许多不同反应的代表性实例，可以参见美国专利号5,646,042、5,693,535、5，731，295、5,811,300、5,837,855、5,869,253、5,877,021、5,877,022、5,972,699、5,972,704、5,989,906和6,017,756。形成三链体的功能性核酸分子是可以与双链或单链核酸相互作用的分子。当三链体分子与靶区域相互作用时，形成称作三链体的结构，其中存在3条DNA链，其形成依赖于Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对的复合物。三链体分子是优选的，因为它们可以高亲和力和特异性地结合靶区域。优选地，三链体形成分子以小于10-6、10-8、IO-IO或10-12的Kd结合靶分子。如何制备和使用三链体形成分子来结合许多不同靶分子的代表性实例，可以参见美国专利号5,176,996、5,645,985、5,650,316、5，683，874、5,693,773、5,834,185、5,869,246、5,874,566和5,962,426。外部指导序列(EGS)是结合靶核酸分子从而形成复合物的分子，且该复合物被RNA酶P识别，该RNA酶P切割所述靶分子。EGS可以设计成特异性地靶向选择的RNA分子。RNA酶P辅助加工细胞内的转移RNA(tRNA)。通过使用形成靶RNA:EGS复合物以模仿天然tRNA底物的EGS,可以募集细菌RNA酶P来事实上切割任何RNA序歹'J(Yale的WO92/03566，和Forster和Altaian,Science238:407-409(1990》。类似地，真核EGS/RNA酶P-指导的RNA切割可以用于切割真核细胞内的所需靶(Yuan等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:8006-8010(1992);Yale的WO93/22434;Yale的WO95/24489;Yuan和Altaian,EMBOJ14:159-168(1995),和Ca歸a等，Proc.Natl,Acad.Sci.(USA)92:2627-2631(1995))。如何制备和使用EGS分子来促进切割许多不同耙分子的代表性实例，可以参见美国专利号5,168,053、5,624,824、5,683,873、5,728,521、5,869,248和5,877,162。通过RNA干扰(RNAi)，也可以以高度特异性的方式，有效地沉默基因表达。该沉默最初通过添加双链RNA(dsRNA)观察到(Fire，A.，等(1998)Nature,391:806-11;Napoli，C.,等(1990)PlantCell2:279-89;Hannon,G丄(2002)Nature,418:244-51)。一旦dsRNA进入细月包，它就被RNA酶III-样酶切酶(Dicer)切割成双链小干扰RNA(siRNA),其长度是21-23个核苷酸，在3'末端含有2个核苷酸的突出端(Elbashir，S.M.，等(2001)GenesDev.,15:188-200;Bernstein,E.，等(2001)Nature,409:363-6;Hammond,S.M.，等(2000)Nature,404:293-6)。在ATP依赖性的步骤中，siRNA变为整合进多亚基蛋白复合物中，通常称作RNAi诱导的沉默复合物(RISC)，它引导siRNA到靶RNA序列(Nyka羅，A"等(2001)Cell,107:309-21)。在有些点上，siRNA双链体解旋，且反义链似乎保持结合在RISC上，并通过内切和外切核酸酶的组合，指导互补mRNA序列的降解(Martinez,J.，等(2002)Cell,110:563-74)。但是，iRNA或siRNA的作用或它们的应用不限于任何类型的机理。短干扰RNA(siRNA)是双链RNA，它可以诱导序列特异性的转录后基因沉默，从而降低或甚至抑制基因表达。在一个实例中，siRNA触发siRNA和靶RNA之间序列同一性区域内同源RNA分子(例如mRNA)的特异性降解。例如，W002/44321公开了当与3'突出端石威基配对时，能序列特异性地降解靶mRNA的siRNA,其在本文中引作关于制备这些siRNA的方法的参考。使用模仿酶切酶生成的siRNA的合成的、短双链RNA，可以在哺乳动物细胞中实现序列特异性的基因沉默(Elbashir，S.M.,等(2001)Nature,411:494498)(Ui-Tei，K.,等(2000)FEBSLett479:79-82)。siRNA可以是化学地或体外-合成的,或可以是在细胞内加工成siRNA的短双链发夹-样RNA(shRNA)的结果。通常使用算法和常规的DNA/RNA合成仪，设计合成的siRNA。供应商包括Ambion(Austin,Texas)、ChemGenes(Ashland,Massachusetts)、Dharmacon(Lafayette,Colorado)、GlenResearch(Sterling,Virginia)、MWBBiotech(Esbersberg,Germany)、Proligo(Boulder,Colomdo)和Qiagen(Vento,TheNetherlands)。也可以使用试剂盒，例如Ambion的SILENCERsiRNA构建试剂盒，体外合成siRNA。本文公开了基于c-Kit或SCF的序列，如上所述设计的任意siRNA。例如，沉默c-Kit的基因表达的siRNA可以商业上得到(SURESILENCINGTM人c-KitsiRNA;ZymedLaboratories,SanFrancisco,CA)。更常见地，通过短发夹RNA(shRNA)的转录，从载体生产siRNA。可以得到生产包含shRNA的载体的试剂盒，例如，Imgenex的GENESUPPRESSOR构建试剂盒和Invitrogen的BLOCK-ITTM谦导型RNAi质粒和慢病毒载体。本文公开了基于本文公开的炎性介质的序列，如上所述设计的任意shRNA。因而，本方法的调节剂可以包含siRNA或shRNA。调节剂可以是cIAPl(登记号gi:41349435、cIAP2(登记号gi:33946283、XIAP(登记号gi:1184319)、存活蛋白(登记号gi:2315862)、DDX3(SEQIDNO:25，登记号gi:13514816)、mda-5(登记号gi:U344593)或RIG-1(登记号gi:6048564)基因表达的抑制剂。因而，调节剂可以包含源自DDX3的核酸序列(SEQIDNO:25，登记号gi:13514816)的shRNA。作为实例，调节剂可以包含核酸序列SEQIDNO:10、12、14或16编码的shRNA。有几种转染试剂可以用于将siRNA递送给细胞，例如，Invitrogen的Lipofectamine2000、Minis的TransIT-TKO和Novagen的RiboJuicesiRNA转染试剂。但是，转染试剂通常不会在体内发挥作用。可以将棵siRNA直接递送进受试者的脉管系统，这具有不递送或表达其它蛋白的优点，这是至关重要的，因为核酸不是免疫原性的。也存在经上皮屏障(例如皮肤)递送核酸的方法，其中使用某些形式的能量来破坏上皮，例如超声波导入术(sonophoresis)(美国专利号5,421,816、美国专利号5,618,275、美国专利号6,712,805和美国专利号合物的参考)。、、3、，'"、提供了筛选细胞的对死亡受体激动剂抗性的生物标记的方法，其包含测定细胞的总DDX3，或其同源物。同样，提供了筛选细胞的对死亡受体激动剂抗性的生物标记的方法，其包含测定所述死亡受体和含有CARD的蛋白的结合，其中高水平的结合指示着对所述激动剂的抗性。死亡受体和含有CARD的蛋白之间的结合指示着对所述激动剂的抗性。任选地，使待筛选的细胞预先接触死亡受体激动剂(例如激动性抗体)。因而，提供了筛选细胞的对死亡受体激动剂抗性的生物标记的方法，其包含，使细胞接触死亡受体激动剂，和监控所述死亡受体和含有CARD的蛋白的分数结合，其中结合指示着对所述激动剂的抗性。任选地，在包含检测结合的各种方法中，人们可以测量解离，并从总量减去解离的量，以计算结合的量。本方法的接触步骤可以体内或体外地进行。监控死亡受体和含有CARD的蛋白之间的结合，可以包含使用特异性的抗体(例如通过免疫沉淀)，从细胞分离蛋白片段(例如死亡受体)。该方法还可以包含，通过标准的免疫检测方法，例如蛋白印迹、放射免疫测定(RIA)或ELISA,分析蛋白片段的结合蛋白(例如DDX3)。这些基于抗体的方法是本领域熟知的，且可以容易地使其适合每种目标死亡受体、含有CARD的蛋白、胱天蛋白酶和胱天蛋白酶调节剂。作为示例，本方法可以包含，用TRA-8抗体处理来自受试者的细胞，从细胞裂解物分离蛋白，免疫沉淀DR5蛋白，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离DR5(还原或非还原条件)，将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，和使用标准的蛋白印迹技术来检测与DR5结合的DDX3,其中所述结合是该细胞中TRA-8抗性的证据。也提供了筛选细胞的对死亡受体激动剂抗性的生物标记的方法，其包含，监控胱天蛋白酶或胱天蛋白酶的调节剂(例如cIAPl、cIAP2、XIAP、存活蛋白)与含有CARD的蛋白的结合，和将结合水平与来自已知抗性和非抗性的对照细胞的样品进行对比。IAP以类似于抗性细胞的水平结合含有CARD的蛋白，指示着对所述激动剂的抗性。任选地，使待筛选的细胞预先接触死亡受体激动剂(例如激动性抗体)。作为示例，本方法可以包含用TRA-8抗体处理来自受试者的细胞，从细胞裂解物分离蛋白，免疫沉淀DDX3蛋白，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离DDX3(还原或非还原条件)，将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，和使用标准的蛋白印迹技术来检测与DDX3结合的胱天蛋白酶(例如胱天蛋白酶-l、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-4、胱天蛋白酶-5)和IAP(例如cIAPl、cIAP2、XIAP、存活蛋白)，其中检测到与DDX3结合的IAP，是该细胞中TRA-8抗性的证据。结合水平可以与对照水平相比较。对照水平可以基于无抗性的细胞。如果测试水平高于无抗性的对照细胞，则指示着抗性。对照水平可以基于抗性细胞，从而测试水平和对照水平之间的相似性指示着抗性。也提供了筛选含有CARD的蛋白的调节剂的方法。具体地，本文提供了这样的筛选方法，其中所述调节剂反转或阻止靶细胞对死亡受体激动剂的抗性。筛选方法的步骤包括，使含有CARD的蛋白接触候选试剂，和一全测与没有候选试剂存在时相比，有候选试剂存在时含有CARD的蛋白的一种或多种活性的变化(例如降低)，其中所述一种或多种活性与靶细胞对死亡受体激动剂的抗性相关联。含有CARD的蛋白的一种或多种活性的降低，指示着候选试剂调节含有CARD的蛋白。可以修改该方法，以利用修饰的含有CARD的蛋白，包括例如，天然存在的修饰或非天然存在的修饰。这样的修饰可以包括截短、突变、嵌合蛋白等。例如，DDX3的核酸序列如SEQIDNO:25所述。DDX3突变的实例包括在SEQIDNO:25的位置1842和2493处腺苦至鸟苷的置换。在本文所述的筛选方法中，可以评价含有CARD的蛋白的任意数目的活性。例如，含有CARD的蛋白的活性可以是磷酸化，包括例如，在死亡受体结合氨基酸处或附近的磷酸化。因而，本方法可以包含检测含有CARD的蛋白的磷酸化。用于检测蛋白磷酸化的基于细胞的和无细胞的测定是本领域熟知的，且包括使用抗体，包括例如，抗-磷酸丝氨酸(ChemiconAB1603)(Chemicon，Temecula,CA)、抗画磷酸苏氨酸(Chemicon㊣AB1607)和抗-磷酸酪氨酸(ChemiconAB1599)。也可以产生对磷酸化形式的DDX-3特异性的位点特异性的抗体。产生和使用所述抗体的方法是本领域熟知的。可以在本文所述筛选方法中评价的另一种含有CARD的蛋白活性是结合活性。例如，含有CARD的蛋白的活性可以是结合死亡受体。因而，本方法可以包含才企测含有CARD的蛋白和死亡受体之间的相互作用。含有CARD的蛋白的活性可以是CARD-依赖性的结合。因而，本方法可以包含检测CARD-依赖性的结合，例如，结合cIAPl、cIAP2、XIAP或存活蛋白。4全测蛋白结合的方法是本领域熟知的，且包括例如，与酶联免疫吸附测定(ELISA)或蛋白印迹结合的共免疫沉淀。在另一个实例中，可以使用夹心测定，其中第一抗体捕获死亡受体，且其中第二抗体检测含有CARD的蛋白。在另一个实例中，可以使用夹心测定，其中第一抗体捕获含有CARD的蛋白，且其中第二抗体才全测死亡受体。本文还提供了筛选测定，其中评价的含有CARD的蛋白的活性是切割，包括例如，在死亡受体-诱导的细胞凋亡过程中发生的切割。因而，筛选方法可以包含检测含有CARD的蛋白的切割。检测蛋白切割的方法是本领域熟知的，且包括例如，蛋白印迹。筛选方法的接触步骤可以在体内或体外进行。筛选方法可以是基于细胞的或无细胞的。因而，在一个方面，含有CARD的蛋白是在靶细胞中的。含有CARD的蛋白可以是在细胞中天然存在的，或可以基因工程改造细胞，来生产含有CARD的蛋白。在无细胞的方法中，可以将含有CARD的蛋白修饰成附着底物或形成嵌合蛋白。任选地，筛选方法还可以包含，使包含死亡受体的耙细胞或非细胞系统接触死亡受体激动剂一次或多次，并片企测对死亡受体激动剂的抗性水平。可以4全测对死亡受体激动剂的抗性水平，例如通过测量细胞凋亡，重复暴露于死亡受体激动剂后细胞凋亡的下降，指示着抗性的增加。检测细胞凋亡的方法是本领域熟知的，且包括例如，用于检测末端dUTP切口-末端标记(TUNEL)、有活性的-胱天蛋白酶3、膜联蛋白V的细胞表面磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)的试剂。用于检测细胞凋亡的这些和其它方法的试剂可以商业上得到。通常，根据本领域已知的方法，可以从天然产物的大文库或合成的(或半合成的)提取物或化合物文库中鉴别候选试剂。药物发现和开发领域的技术人员将理解，试验提取物或化合物的准确来源对于本发明的筛选操作不是至关重要的。因此，使用本文所述的示例方法，实际上可以筛选任意数目的肽、化学提取物或化合物。这样的肽、提取物或化合物的实例包括但不限于，基于植物、真菌、原核生物或动物的提取物，发酵培养液，和合成化合物，以及现有化合物的修饰。也可以得到许多方法，以用于生成任意数目的化合物的随机的或定向的合成(例如，半合成或全合成)，所述化合物包括但不限于，基于糖、脂质、肽、多肽和核酸的化合物。合成化合物文库可以商业上得到，例j口,乂人BrandonAssociates(Merrimack,NH)详口AldrichChemical(Milwaukee,WI)得到。或者，细菌、真菌、植物和动物提耳又物形式的天然化合物文库，可以从许多来源商业上得到，包括Biotics(Sussex,UK)、Xenova(Slough,UK)、HarborBranchOceangraphicsInstitute(Ft.Pierce,Fla.)禾口PharmaMar,U.S.A.(Cambridge,Mass.)。另夕卜，3口果需要，根据本领域已知的方法，生产天然的和合成生产的文库，例如，通过标准的提取和分级分离方法。而且，如果需要，使用标准的化学的、物理的或生化的方法，可以容易地修饰任意文库或化合物。另外，药物发现和开发领域的技术人员容易理解，只要可行，应该采用将已知它们对含有CARD的蛋白的活性的作用的材料去复制(dereplication)(例如，分类学去复制、生物学去复制和化学去复制，或其任意组合)或消除它们的复制或重复的方法。当发现粗提取物具有所需的活性时，进一步分级分离阳性前导(lead)提取物是必要的，以分离负责观察到的作用的化学组分。因而，提取、分级分离和纯化方法的目的是，小心地表征和鉴别粗提取物中具有刺激或抑制含有CARD的蛋白的活性的活性的化学实体。本文所述4企测化合物混合物的活性的相同测定，可以用于纯化活性组分和测试其衍生物。分级分离和纯化这样的异种提取物的方法是本领域已知的。如果需要，根据本领域已知的方法，化学地修饰经表明是有用的治疗剂的化合物。使用需要调节或模仿含有CARD的蛋白的活性的疾病或状况的动物模型，可以随后分析鉴别为具有治疗价值的化合物。提供了监控受试者中对死亡受体激动剂的抗性的方法，其包含，从所述受试者获取生物样品，和检测含有CARD的蛋白与样品中死亡受体的结合，结合指示着抗性。如上所述，结合水平可以与对照水平相比举交。作为示例，本方法可以包含，从受试者分离生物样品，其中所述受试者已经用治疗性抗-DR5抗体(例如TRA-8)治疗过，从生物样品分离蛋白，免疫沉淀DR5蛋白，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离DR5(还原或非还原条件)，将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，和使用DDX3的抗体和标准的蛋白印迹技术，检测与DR5结合的DDX3，其中结合是该细胞中TRA-8抗性的证据。提供了监控受试者中对死亡受体激动剂的抗性的方法，其包含，从所述受试者获取生物样品，和检测胱天蛋白酶或胱天蛋白酶的调节剂与样品中含有CARD的蛋白的结合，结合指示着抗性。作为示例，本方法可以包含，从用治疗性抗-DR5抗体(例如TRA-8)治疗的受试者分离生物样品，从生物样品分离蛋白，免疫沉淀DDX-3蛋白，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离DDX-3(还原或非还原条件)，将分离的蛋白转移至硝酸纤维素膜上，和使用标准的蛋白印迹技术来检测与DDX3结合的胱天蛋白酶(例如，胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-4、胱天蛋白酶-5)和IAP(例如，cIAPl、cIAP2、XIAP、存活蛋白)，例如，其中4企测到与DDX3结合的cIAPl,是该细胞中TRA-8抗性的证据。提供了监控受试者中对死亡受体激动剂的抗性的方法，其包含，从所述受试者获取生物样品，和检测DDX3的磷酸化。检测蛋白的磷酸化的方法是本领域熟知的，且包括使用抗体，包括例如，抗-磷酸丝氨酸(ChemiconAB1603)、抗-磷酸苏氨酸(Chemicon⑧AB1607)和抗-磷酸酪氨酸(ChemiconAB1599)。也可以产生对磷酸化形式的DDX-3特异性的位点特异性的抗体。产生和使用所述抗体的方法是本4页i或熟^口的。提供了选择性地诱导表达死亡受体的靶细胞的细胞凋亡的方法，其包含下述步骤，使靶细胞接触治疗量的特异性结合死亡受体的死亡受体激动剂，和给靶细胞施用治疗量的含有CARD的蛋白的一种或多种活性的调节剂。通过在已添加试验样品的培养基中培养细胞，例如人白血病细胞系Jurkat(美国典型培养物保藏中心保藏号TIB-152)和星形细胞瘤细胞系1321N1，可以证实激动剂和含有CARD的蛋白调节剂诱导细胞凋亡的能力。通过例如ATPLITE测定，可以测定存活率。本文提供的方法和组合物可以用于治疗与细胞不适当存活或增殖相关的疾病，所述疾病包括可归因于癌症或炎性疾病和自身免疫病中细胞凋亡系统调节异常的那些疾病。炎性疾病和自身免疫病示例性地包括全身性红斑狼齊、Hashimoto氏病、类风湿性关节炎、移植物4元宿主病、Sj6gren氏综合4正、恶'性贫血、Addison病、石更皮病、Goodpasture氏综合征、Crohn氏病、自身免疫性溶血性贫血、不育、重症肌无力、多发性硬化、Basedow氏病、血小板减少性紫癜、胰岛素依赖性糖尿病、变态反应、哮喘、特应性疾病、动脉硬化、心肌炎、心肌病、肾小球肾炎、再生不良性贫血、器官移植后的排斥。癌症包括肺、前列腺、肝、卵巢、结肠、子宫颈、淋巴组织和乳房组织的许多恶性胂瘤。因而，提供的组合物和方法还可以用于靶向和选择性地诱导激活的免疫细胞中的细胞凋亡，包括激活的淋巴细胞、淋巴样细胞、髓样细胞和类风湿性滑膜细胞(包括炎性滑膜细胞、巨噬细胞样滑膜细胞、成纤维细胞样滑膜细胞)和病毒感染的细胞(包括被例如HIV感染的那些)，只要这些靶向的细胞会表达或可以被使得表达特定的死亡受体(即DR4或DR5)。提供了治疗患有癌症或自身免疫病或炎性疾病的受试者的方法，其包含，给所述受试者施用治疗量的死亡受体激动剂和含有CARD的蛋白的一种或多种活性的调节剂，其中所述调节剂降低对死亡受体激动剂的抗性。在全文中使用的死亡受体激动剂和/或含有CARD的蛋白的调节剂的"治疗量"是足以造成靶细胞的细胞凋亡的量。本文使用的术语"治疗量"和"药学上有效量"是同义的。本领域技术人员能容易地确定正确的治疗量。在疾病(例如，癌症、自身免疫病和炎性疾病)的治疗中，也可以使用联合治疗。例如，提供的方法和组合物的激动剂和含有CARD的蛋白的调节剂可以与其它治疗剂联合施用。本文使用的"治疗剂"是能有效地改善病理状况的化合物或组合物。放疗也可以与或不与其它治疗剂相组合。本领域技术人员能使放疗形式适应疾病。治疗剂的实例包括化疗剂、抗炎剂、緩解疾病的抗风湿性药物(DMARD)、抗体、TNF家族成员、抗病毒剂、抗才几会试剂(anti-opportunisticagents)、抗生素、免疫抑制剂、免疫5求蛋白、抗症疾剂、抗类风湿性关节炎剂、细胞因子、趋化因子、生长因子和抗癌化合物。组:物。抗癌化合物的示^性实例包括博来霉素:卡柏、'苯丁酸il芥、顺铂、秋水仙碱、环磷酰胺、柔红霉素、更生霉素、乙烯雌酚阿霉素、依托泊苷、5-氟尿嘧啶、氟尿苷、美法仑、曱氨蝶呤、丝裂霉素、6-巯基噪呤、替尼泊苷、6-硫鸟。票呤、长春新碱和长春碱。抗癌4匕合物和治疗剂的其它实例，参见TheMerckManualofDiagnosisandTherapy,15thEd"Berkow等，编,1987,Rahway,N丄和Sladek等MetabolismandActionofAnti-CancerDrugs,1987,Powis等编，Taylor和Francis,NewYork,N.Y.。PKC抑制剂，双吲咮基马来酰亚胺VIII(BisVIII)，极大地促进Fas-介导的细胞凋亡(Zhou,T"等1999.NatMed5:42-48)。已经表明，JNK/p38途径的协同激活起重要作用(Ohtsuka，T.,和T.Zhou.2002.JBiolChem277:29294-29303),且3种普通化疗剂对DR5-介导的细胞凋亡的增强，似乎通过类似机理发生(Ohtsuka,T.,D.等2003.Oncogene22:2034-2044)。因而，提供的方法还可以包含，使用细胞凋亡诱导性化合物，例如双吲哚基马来酰亚胺VIII(BisVIII)或其它敏化剂，如SN-50或LY294002。因而，提供的方法和组合物的激动剂和含有CARD的蛋白的调节剂可以与BisVIII相组合。提供的方法和组合物的激动剂和含有CARD的蛋白的调节剂还可以与非类固醇抗炎药物(NSAID)(例如，舒林酸硫化物或其它COX-1或COX-2抑制剂)相组合。使用提供的方法和组合物的激动剂的治疗，也可以与使用其它激动剂的治疗相组合。例如，可以在施用DR4的抗体的同时、之前或之后，将DR5的抗体施用给需要的受试者。这样组合的抗体治疗还可以与施用本文提供的含有CARD的蛋白的一种或多种调节剂相组合，且还可以与其它治疗剂相组合。提供了组合物，它包含死亡受体激动剂和调节含有CARD的蛋白的一种或多种活性的试剂，其中所述调节剂降低对死亡受体激动剂的抗性。提供的组合物还可以包含选自下述的治疗剂化疗剂、TNF家族成员、抗病毒剂、抗炎剂，抗机会试剂、抗生素、免疫抑制剂、免疫球蛋白、抗症疾剂、抗类风湿性关节炎剂、细胞因子、趋化因子和生长因子。术语"蛋白"、"肽"、"多肽"或"肽部分"在本文中可互换地使用，且在本文中泛指用于通过肽键连接的2个或更多个氨基酸。术语"片段"在本文中用于指全长多肽或蛋白的部分，这样的部分可以通过对多肽的蛋白水解反应来生成，即切割多肽中的肽键后生成的肽。应当认识到，片段不一定需要通过蛋白水解反应来生成，而是可以使用化学合成方法或重组DNA:R术方法来生成，以产生合成的多肽。应当认识到，术语"蛋白"和"多肽"在本文中不用于指构成分子的特定大小或数目的氨基酸，且本发明的肽可以含有最多达几个氨基酸残基或更多。"分离的"或"纯化的"是指组合物(例如，多肽或核酸)，它基本上不含有其它材料，包括在自然界中通常伴随该组合物的材料。可以如下得到本发明的多肽或其片段，例如，通过从天然来源(例如，噬菌体)提取，通过表达编码所述多肽的重组核酸(例如，在细胞中或在无细胞的翻译系统中)，或通过化学合成所述多肽。另外，通过任一种这样的方法，或通过切割全长多肽，可以得到多肽片段。参照蛋白或多肽的片段仅包括参照蛋白/多肽的邻接氨基酸，且比参照序列短至少一个氨基酸。当在本文中提及特定蛋白时，预期变体、衍生物和片段。本领域技术人员会较好地理解蛋白变体和衍生物，且其可以包含氨基酸序列修饰。例如，氨基酸序列修饰通常归入3类中的一个或多个置换、插入或缺失变体。插入包括氨基和/或羧基末端融合以及一个或多个氨基酸残基的序列内插入。插入通常是比氨基和/或羧基末端融合更小的插入，例如，以l-4个残基的量级。缺失的特征在于，从蛋白序列中去除一个或多个氨基酸残基。通常，在蛋白分子内的任一个位点处缺失仅仅约2-6个残基，但是缺失的范围是l-30个残基。通常如下制备这些变体通过编码该蛋白的DNA的核苦酸的位点特异性的诱变，从而产生编码变体的DNA，且此后在重组细胞培养物中表达该DNA。在具有已知序列的DNA的预定位点处产生置换突变的技术，是众所周知的，且包括例如，M13引物诱变和PCR诱变。氨基酸置换通常是单个残基，但是可以同时发生在许多不同的位置处；插入通常是约1-10个氨基酸残基的量级。优选地，以相邻对产生缺失或插入，即缺失2个残基或插入2个残基。可以组合置换、缺失、插入或其任意组合，以达到最终的构建体。突变必须不得将序列置于阅读框之外，且优选地不会生成可产生二级mRNA结构的互补区，除非需要二级mRNA结构的这种变化。置换变体是这样的，其中已经去除了至少一个残基，且在它的位置处插入不同的残基。这样的置换通常根据下面的表l来进行，称作保守置换。表l:氨基酸置换<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>通过选择比表l中的那些更不保守的置换，即选择它们在维持下述方面的作用中更明显地不同的残基，可以产生功能或免疫学一致性的相当大变化(a)置换区域中多肽主链的结构，例如，作为折叠或螺旋构象，(b)耙位点处的分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。通常预见到会产生蛋白性质的最大变化的置换是这样的，其中(a)亲水残基(例如丝氨酰基或苏氨酰基)置换(或被置换为)疏水残基(例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基)；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换(或被置换为)任意其它残基；(c)具有电正性侧链的残基(例如，赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)置换(或被置换为)具电负性残基(例如，谷氨酰基或天冬氨酰基)；或(d)具有大侧链的残基(例如，苯丙氨酸)置换(或被置换为)不具有侧链的残基(例如，甘氨酸)，和(e)增加硫酸化和/或糖基化位点的数目。例如，本领域技术人员已知将一个氨基酸残基替换为另一个生物学上和/或化学上类似的残基是保守置换。例如，保守置换可以是，将一个疏水残基替换为另一个，或将一个极性残基替换为另一个。置换包括表l中所示的组合。在本文提供的多肽中，包括每种明确公开的序列的保守置换变化。通常，保守置换对得到的多肽的生物活性具有很少的影响至没有影响。在具体实例中，保守置换是肽中基本上不影响该肽的生物学功能的氨基酸置换。肽可以包括一个或多个氨基酸置换，例如2-10个保守置换，2-5个保守置换，4-9个保守置换，例如2、5或10个保守置换。使用例如标准规程，例如定点诱变或PCR，通过操作编码多肽的核普酸序列，可以生成含有一个或多个保守置换的多肽。或者，使用标准的肽合成方法，可以生成含有一个或多个保守置换的多肽。丙氨酸扫描可以用于鉴别蛋白中的哪个氨基酸残基能耐受氨基酸置换。在一个实例中，当丙氨酸或其它保守氨基酸(例如下面列出的那些)替换一个或多个天然氨基酸时，蛋白的生物活性的降低为至多25%,例如至多20%,例如至多10%。关于保守置换的其它信息除了别处外可以参见，Ben-Bassat等，(J.Bacteriol.169:751-7,1987),O'Regan等，(Gene77:237-51,1989)，Sahin-Toth等，(ProteinSci.3:240-7,1994),Hochuli等，(Bio/Technology6:1321-5，1988)和遗传学和分子生物学的标准教材中。可以采用置换或缺失诱变来插入N-糖基化(Asn-X-Thr/Ser)或O-糖基化(Ser或Thr)的位点。也可能需要缺失半胱氨酸或其它不稳定的残基。例如通过缺失一个碱性残基或将其置换为谷氨酰胺酰基或组氨酰基残基，可以实现潜在蛋白水解位点(例如Arg)的缺失或置换。某些翻译后衍生化，是重组宿主细胞作用于表达的多肽的结果。谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基经常在翻译后脱酰胺为对应的谷氨酰基和天冬酰基残基。或者，在温和的酸性条件下，脱酰胺这些残基。其它翻译后修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的O-氨基的曱基化(T.E.Creighton，Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFranciscopp79-86[1983])，N-末端胺的乙酰化，和在有些情况下，C-末端羧基的酰胺化。应当理解，有许多可以掺入公开的组合物中的氨基酸和肽类似物。例如，有许多D氨基酸或具有与表l所示的氨基酸不同的功能取代基的氨基酸。公开了天然存在的肽的相反立体异构体，以及肽类似物的立体异构体。通过使tRNA分子负载选择的氨基酸，并对利用例如琥珀密码子的遗传构建体进行工程改造以将类似物氨基酸以位点特异性的方式插入肽链中，可以容易地将这些氨基酸掺入多肽链中(Thorson等，MethodsinMolec.Biol.77:43-73(1991),Zoller，CurrentOpinioninBiotechnology,3:348-354(1992);Ibba，Biotechnology&GeneticEnginerringReviews13:197-216(1995)，Cahill等，TIBS,14(10):400-403(1989);Benner，TIBTech,12:158-163(1994);Ibba和Hennecke，Bio/technology,12:678-682(1994)，它们都在本文中引作参考，至少关于与氨基酸类似物有关的材料)。可以生成与多肽类似、但不是通过天然肽一睫相连的分子。例如，氨基酸或氨基酸类似物的键可以包括CH2NH—、—CH2S—、—CH2—CH2—、—CH=CH—(顺式和反式)、—COCH2-、—CH(OH)CH2—和—CHH2SO—(它们和其它的可以参见Spatola，A.F.inChemistryandBiochemistryofAminoAcids,Peptides,andProteins,B.Weinstein,编,MarcelDekker,NewYork,p.267(1983);Spatola,A.F.,VegaData(March1983),Vol.1,Issue3,PeptideBackboneModifications(综述)；Morley，TrendsPharmSci(1980)pp.463-468;Hudson,D.等，IntJPeptProtRes14:177-185(1979)(—CH2NH—、CH2CH2—);Spatola等LifeSci38:1243-1249(1986)(-画CHH2—S);HarmLGhem.SocPerkinTrans.I307-314(1982)(--CH隱-CH画画，顺式和反式)；Almquist等J.Med.Chem.23:1392-1398(1980)(—COCH2--);Jennings-White等TetrahedronLett23:2533(1982)(—COCH2—);Szelke等EuropeanAppln，EP45665CA(1982):97:39405(1982)(—CH(OH)CH2—);Holladay等Tetrahedron.Lett24:4401-4404(1983)(—C(OH)CH2—);和HrubyLifeSci31:189-199(1982)(—CH2—S—);它们各自都在本文中引作参考。特别优选的非肽键是-CH2NH-。应当理解，肽类似物可以在键原子之间具有超过一个原子，例如b-丙氨酸、g-氨基丁酸等。氨基酸类似物和类似物和肽类似物经常具有增强的或所需的性质，例如，更经济的生产，更高的化学稳定性，增强的药理学性质(半衰期、吸收、效力、功效等)，改变的特异性(例如，广谱生物活性)，减少的抗原性等。D-氨基酸可以用于产生更稳定的肽，因为D氨基酸不被肽酶等识别。用相同类型的D-氨基酸系统性地置换共有序列的一个或多个氨基酸(例如，用D-赖氨酸替换L-赖氨酸)，可以用于产生更稳定的肽。半胱氨酸残基可以用于将2个或更多个肽环化或附着到一起。这可以有助于限制肽为特定构象(Rizo和GieraschWev.肠c/z亂61:387(1992)，其在本文中引作参考)。应当理解，定义本文公开的基因和蛋白的任意变体、修饰或衍生物的一种方式是，通过根据与特定已知序列的同源性定义变体、修饰和衍生物。具体公开了本文公开的核酸和多肽的变体，它们与所述或已知序列具有70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的同源性。本领域技术人员容易理解如何确定2个蛋白或核酸的同源性。例如，可以在比对2个序列之后计算同源性，从而使得同源性是在最高水平。通过公开的算法，可以进行计算同源性的另一种方法。通过Smith和WatermanAdv.Appl.Math.2:482(1981)的局部同源性算法，通过Needl薩n和Wunsch,J.MoLBiol.48:443(1970)的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman,Pro"Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444(1988)的搜索相似性方法，通过这些算法的计算机化实现(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,在WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.,Madison,WI),或通过目检，可以进行对比序列的最佳比对。这些参考文献在本文中整体引作关于计算同源性的方法的参考。通过例如Zuker，M.Sc/e画244:48-52,1989,Jaeger爭尸亂淑/.爿c^/.t75^86:7706-7710，1989，Jaeger爭五"zymo/.183:281-306,1989中公开的算法，可以得到核酸的相同类型的同源性，这些参考文献在本文中引作参考，至少关于与核酸比对有关的材料。4是供的组合物可以经口、直肠、脑池内、心室内、颅内、鞘内、关节内、阴道内、肠胃夕卜(静脉内、肌内或皮下)、局部(粉末、软膏或滴剂)、腹膜内注射、经皮、通过吸入或作为口或鼻喷雾剂施用。所需抗体或治疗剂的准确量将根据受试者而变化，取决于受试者的年龄、体重和一般状况、待治疗疾病的严重程度、肺瘤的位置和大小、所用的具体化合物、施用模式等。本领域技术人员仅用本文给出教导的常规实验，可以确定合适的量。抗体一般的单剂量范围为0.1-10,000微克，优选1-100微克。载体中一般的抗体浓度的范围为送递的每毫升中0.2-2000纳克。就注射进关节而言，抗体和载体的体积依赖于关节而变化，但是将约0.5-10ml、且优选l-5ml注射进人膝，且将约0.1-5ml、且优选l-2ml注射进人踝关节。组合物还可以包含药学上可接受的载体。"药学上可接受的"是指不是生物学或者在其它方面不希望有的材料，它可以与选择的基质一起施用给个体，不造成显著的不希望的生物作用、或以有害的方式与包含它的药物组合物中的任何其它组分相互作用。依赖于预期的施用模式，所述抗体或治疗剂可以在固体、半固体或液体剂量形式的药物组合物中，所述剂量形式例如片剂、栓剂、丸剂、胶嚢、粉末、液体或悬浮液，优选适用于一次施用精确剂量的单位剂量形式。所述组合物将包括有效量的所选基质以及药学上可接受的载体，且另外可以包括其它药用试剂、药物、载体或稀释剂。适用于肠胃外注射的组合物可以包含生理上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳剂，以及用于重构为无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或载体的实例包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)、其合适的混合物、才直物油(例如橄榄油)和注射用有机酯例如油酸乙酯。可以维持正确的流动性，例如通过利用包衣例如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需的粒度，以及通过利用表面活性剂。这些组合物也可以含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯曱酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，可以确保防止微生物的作用。也可能需要包括等渗剂，例如糖、氯化钠等。注射用药物形式的延长吸收，可以利用延迟吸收的试剂例如一硬脂酸铝和明胶来达到。用于经口施用的固体剂量形式包括胶嚢、片剂、丸剂、粉末和颗粒。在这类固体剂量形式中，活性化合物与至少一种惰性常规赋形剂(或载体)例如柠檬酸钠或磷酸二4丐或以下物质混合(a)填充物或增容剂，例如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸，(b)粘合剂，例如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶，(c)湿润剂，例如甘油，(d)崩解剂，例如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐和碳酸钠，(e)溶液阻滞剂，例如石蜡，(f)吸收促进剂，例如季铵化合物，(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和甘油一硬脂酸酯，(h)吸附剂，例如高呤土和膨润土，和(i)润滑剂，例如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠或其混合物。就胶嚢、片剂和丸剂而论，所述剂量形式也可以包含緩沖剂。相似类型的固体组合物也可以用作利用诸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等的赋形剂的软和硬填充明胶胶嚢中的填充物。诸如片剂、糖锭剂、胶嚢、丸剂和颗粒的固体剂量形式，可以用包衣和壳制备，例如肠溶衣和本领域已知的其它包衣。它们可以含有遮光剂(opacifyingagent),且也可以是这样的组合物，从而4吏得它们在肠道的某部分以延迟方式释放一种或多种活性化合物。可以使用的包埋组合物的实例是聚合物质和蜡。如果合适，所述活性化合物也可以为具有一种或多种上述赋形剂的微嚢化形式。用于经口施用的液体剂量形式包括药学上可接受的乳剂、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。除所述活性化合物外，所述液体剂量形式可以含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯曱醇、苯甲醇、苯甲酸节酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基曱酰胺，油，特别是棉子油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油，甘油，四氢糠醇，聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯或这些物质的混合物等。除这类惰性稀释剂外，所述组合物还可以包括佐剂，例如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、增甜剂、调味剂和加香剂。悬浮液除含有所述活性化合物外，还可以含有悬浮剂，例如乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝(aluminiummetahydroxide)、膨润土、琼脂和西黄蓍胶或这些物质的混合物等。用于直肠施用的组合物优选地是栓剂，所述栓剂可以通过将本发明的化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体(例如可可脂、聚乙二醇或栓剂用蜡)混合来制备，所述赋形剂或载体在常温下为固体，但在体温下为液体，因此在直肠或阴道腔中熔化并释放所述活性化合物。用于局部施用本发明化合物的剂量形式包括软膏、粉末、喷雾剂和吸入剂。根据需要，所述活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体和任何防腐剂、緩冲剂或推进剂混合。眼用制剂、软膏、粉末和溶液也被预期在本发明范围内。本文所用的术语"药学上可接受的盐、酯、酰胺和前体药物"是指本发明化合物的那些羧酸盐、氨基酸加成盐、酯、酰胺和前体药物，它们在合理的医学判断范围内适用于与患者组织接触，而没有过度的毒性、刺激性、变态反应等，与合理的利益/风险比率相称，对于其预期的用途是有效的，合适时也是指本发明化合物的两性离子形式。术语"盐"是指本发明化合物的相对无毒的无机和有机酸加成盐。这些盐可以在所述化合物的最后分离和纯化期间原位制备，或者通过单独将游离碱形式的纯化化合物与合适的有机酸或无机酸反应，并分离由此生成的盐。代表性盐包括氢溴酸盐、盐酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、草酸盐、戊酸盐、油酸盐、椋榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、苯曱酸盐、乳酸盐、磷酸盐、曱苯磺酸盐、柠檬酸盐、马来酸盐、延胡索酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、naphthylate、曱磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐、曱磺酸盐和月桂基磺酸盐等。这些可以包括基于碱金属和碱土金属例如钠、锂、钾、钙、镁等的阳离子、以及无毒铵、季铵和胺阳离子，包括但不限于铵、四甲基铵、四乙基铵、曱胺、二曱胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等。(参见例如S.M。Barge等，"PharmaceuticalSalts,"J.尸/2wm.6W.，1977,66:1-19，该文献引入本文作为参考。)提供了分离的核酸，其包含用于RNA干扰(RNAi)的双链RNA(dsRNA)。dsRNA可以是短干扰RNA(siRNA)或短发夹RNA(shRNA)。因而，提供了包含shRNA的分离的核酸，其中所述shRNA抑制含有CARD的蛋白的表达。所述shRNA可以由核酸序列SEQIDNO:10、12、14或16编码。公开的核酸由例如核苷酸、核苷酸类似物或核苷酸取代物组成。在本文中讨_沦了这些和其它分子的非限制性实例。应当理解，例如，当在细胞中表达载体时，表达的mRNA将通常由A、C、G和U组成。同样地，应当理解，例如，如果通过例如外源递送，将反义分子导入细胞或细胞环境中，则该反义分子有利地由减少该反义分子在细胞环境中的降解的核苷酸类似物组成。"分离的核酸"或"纯化的核酸"是指DNA,它不含有在本发明的DNA的来源生物的天然存在的基因组中侧接该基因的基因。该术语因此包括，例如，重组DNA，它整合入载体中，例如自主复制质粒或病毒；或整合入原核生物或真核生物的基因组DNA中(例如，转基因)；或它作为分离的分子而存在(例如，通过PCR、限制性内切核酸酶消化或化学或体外合成生成的cDNA或基因组或cDNA片段)。它也包括作为编码其它多肽序列的杂交基因的部分的重组DNA。术语"分离的核酸"也指RNA，例如，mRNA分子，它由分离的DNA分子编码，或化学地合成，或是分离的或基本上不含有至少一些细胞组分，例如，其它类型的RNA分子或多肽分子。本文提供了包含本文提供的任一种核酸的载体，所述核酸可操作地连接到表达控制序列上。控制从哺乳动物宿主细胞中的载体转录的优选启动子，可以从各种来源得到，例如，病毒基因组，例如多瘤、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选的巨细胞病毒，或来自异种哺乳动物启动子，例如(3肌动蛋白启动子或EF1启动子，或来自杂交或嵌合启动子(例如，与P肌动蛋白启动子融合的巨细胞病毒启动子)。可以方便地得到SV40病毒的早期和晚期启动子，作为SV40限制片段，它也含有SV40病毒复制起点(Fiers等，Nature,273:113(1978))。可以方便地得到人巨细胞病毒的立即早期启动子，作为HindIIIE限制片段(Greenway，P.J.等，Gene18:355360(1982))。当然，来自宿主细胞或相关物种的启动子在本文中也是有用的。"增强子"通常是指在离转录起始位点不固定距离处发挥功能的DNA序列，且可以是在转录单位的5'(Laimins,L.等,Pro"Natl.Acad.Sci.78:993(1981))或3'(Lusky，M丄"等，Mol.CellBio.3:1108(1983))。而且，增强子可以是在内含子内(Banerji,J丄.等，Cell33:729(1983))以及在编码序列本身内(Osborne,T.F"等，Mol.CellBio.4:1293(1984))。它们的长度通常是10-300bp，且它们顺式起作用。增强子起增加从附近启动子的转录的功能。增强子也经常含有介导转录调节的反应元件。启动子也可以含有介导转录调节的反应元件。增强子经常决定基因表达的调节。尽管已知来自哺乳动物基因的许多增强子序列(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白和胰岛素)，但人们通常使用来自真核细胞病毒的增强子进行一般表达。优选的实例是在复制起点的晚期侧的SV40增强子(bp100270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、在复制起点的晚期侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。启动子和/或增强子可以被光或触发它们的功能的特定化学事件特异性地激活。系统可以被诸如四环素和地塞米^^的试剂、合成的转录因子、定向的RNA自切割(YenL.等2004.Nature431:471-476)和其它方案调节。也存在增强病毒载体基因表达的方式，这通过暴露于辐照例如Y辐照，或烷基化化疗药物实现。启动子和/或增强子区域可以起组成型启动子和/或增强子的作用，以使待转录的转录单位区域的表达最大化。在某些构建体中，启动子和/或增强子区域可以是在所有真核细胞类型中都有活性的，即使CMV启动子(650碱基)。其它优选的启动子是SV40启动子、巨细胞病毒(+连接的内含子序列)、(3-肌动蛋白、延伸因子-1(EF-1)和反转录病毒载体LTR。已经表明，可以克隆所有特异性的调节元件，并用于构建在特定细胞类型(例如黑素瘤细胞)中选择性地表达的表达载体。胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子已经用于在神经胶质(星形胶质细胞)起源的细胞中选择性地表达基因。HLA-DR、CDllc、Fascin和CD68启和扭j"突细胞(Brocker，T"等1997.JExpMedl85:541-550;GoughP丄和Raines,E.W.2003.Blood101:485-491;Cui,Y.等2002.Blood99:399-408;Sudowe，S.等2003.MolTher8:567-575),且来自树突细胞特异性的基因的启动子元件(例如CD83)也可以证实在这方面是有用的(BerchtoldS.等2002.Immunobiology205:231-246)。在真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或具核细胞)中使用的表达载体，也可以含有终止转录必需的序列，其可以影响mRNA表达。这些区域^皮转录成编码组织因子蛋白的mRNA的非翻i奪部分的多腺普酸化区段。3'非翻译区也包括转录终止位点。优选地，转录单位也含有多腺苦酸化区域。该区域的一个优点是，它增加转录的单元将被如mRNA那样加工和运输的可能性。多腺苷酸化信号在表达构建体中的鉴别和应用是充分确定的。优选地，在转基因构建体中使用同源多腺普酸化信号。在某些转录单位中，多腺苷酸化区域源自SV40早期多腺苦酸化信号，且由约400个碱基组成。还优选地，转^体的表达或稳定性:一；、、'、"病毒载体可以包含编码标记产物的核酸序列。该标记产物用于确定该基因是否已经一皮递送给细胞，和递送后是否一皮表达。优选的标记基因包括大肠杆菌(￡.co/OlacZ基因，它编码卩半乳糖普酶、绿色荧光蛋白(GFP)和萤光素酶。在有些实施方案中，标记可以是选4爭标记。哺乳动物细^^的合适选择标记的实例是二氢叶酸还原酶(DHFR)、胸苷激酶、新霉素、新霉素类似物G418、潮霉素和噤呤霉素。当这样的选择标记成功地转移进哺乳动物宿主细胞时，转化的哺乳动物宿主细胞如果置于选择压力下，可以存活。存在2种广泛使用的不同类别的选择方案。第一类基于细胞的代谢和使用不能独立于补加培养基生长的突变细胞系。2个实例是CHODHFR细胞和小鼠LTK细胞。这些细胞不能在没有加入诸如胸苦或次黄。票呤的营养物的情况下生长。因为这些细胞缺少完整核普酸合成途径必需的某些基因，所以除非在补加培养基中提供缺失的核苷酸，它们不能存活。补加培养基的一个替代方案是，将完整DHFR或TK基因导入缺少各自基因的细胞中，从而改变它们的生长需求。没有被DHFR或TK基因转化的单个细胞不能在非补加培养基中存活。第二类是显性选择，它是指在任意细胞类型中使用的选择方案，且不需要使用突变细胞系。这些方案通常使用药物来停滞宿主细胞的生长。具有新基因的那些细胞可表达传递药物抗性的蛋白，且在该选择后存活。这样的显性选择的实例使用药物新霉素(SouthernP.和Berg,P.,J.Molec.Appl.Genet.1:327(1982》、霉酚酸(Mulligan，R.C.和Berg,P.Science209:1422(1980))或潮霉素(Sugden，B.等，Mol.Cell.Biol.5:410413(1985))。3个实例采用真核生物控制下的细菌基因，来传递分别对适当药物G418或新霉素(遗传霉素)、xgpt(霉酚酸)或潮霉素的抗性。其它包括新霉素类似物G418和。票呤霉素。提供了细胞，其包含任一种本文提供的载体。公开的细胞可以是用于克隆或繁殖本文提供的载体的任意细胞。因而，细胞可以来自任意原代细胞培养物或确立的细胞系。基于载体的选择和所需用途，本领域技术人员可以选择细胞类型。提供了分离的多肽，其包含死亡受体的含有CARD的蛋白结合区，其中所述多肽包含少于25个氨基酸残基。因而，提供的多肽可以是TFNR1(登记号gi:23312372)的含有CARD的蛋白结合区。提供的多肽可以是Fas受体(登记号gi:119833)的含有CARD的蛋白结合区。提供的多肽可以是TRAIL受体的含有CARD的蛋白结合区。因而，提供的多肽可以是DR4(登记号gi:21264525)的含有CARD的蛋白结合区。提供的多肽可以是DR5(登记号gi:3721878)的含有CARD的蛋白结合区。提供的多肽可以是氨基酸序列SEQIDNO:22的片段，其中所述片段结合本文公开的含有CARD的蛋白。作为解释性实例，提供的多肽可以包含DR5的氨基酸250-340。因而，所述多肽可以包含氨基酸序列SEQIDNO:23。所述多肽还可以包含氨基酸序列SEQIDNO:23的片段，从而使得该片段能结合DDX3。作为实例，调节剂可以是包含DR5的氨基酸280-310的多肽。因而，调节剂可以包含氨基酸序列SEQIDNO:24。作为另一个实例，调节剂可以是包含DR5的氨基酸300-330的多肽。因而，调节剂可以包含氨基酸序列SEQIDNO:36。"结合"是指，所述多肽以用标准生化方法检测到的足够亲和力，与含有CARD的蛋白形成非共价键(例如氬键)。在一个方面，提供的多肽以等于或大于它的来源死亡受体的亲和力，结合含有CARD的蛋白。死亡受体的含有CARD的蛋白结合区可以用作可溶受体，以用于竟争抑制含有CARD的蛋白结合。因而，提供了阻断含有CARD的蛋白与细胞中的死亡受体结合的方法，其包含，使所述细胞接触编码本文公开的死亡受体存活区域的多肽，或其阻断结合的片段。也提供了反转细胞对细胞中的死亡受体激动剂的抗性的方法，其包含，使细胞接触所述多肽。提供了分离的多肽，其包含含有CARD的蛋白的死亡受体结合结构域。提供的多肽可以是DDX3(SEQIDNO:25,登记号gi:13514816)的死亡受体结合结构域。提供的多肽可以是氨基酸序列SEQIDNO:25的片段，其中所述片段结合本文公开的死亡受体。DDX3结合DR5的约氨基酸200-250和350-400。因而，调节剂可以是包含DDX3的氨基酸200-250的多肽，或其片段。因而，调节剂可以包含氨基酸序列SEQIDNO:37。因而，调节剂可以是包含DDX3的氨基酸350-400的多肽，或其片段。因而，调节剂可以包含氨基酸序列SEQIDNO:38。提供的多肽可以是mda-5(登记号gi:11344593)的死亡受体结合结构域。提供的多肽可以是RIG-1(登记号gi:6048564)的死亡受体结合结构域。包含含有CARD的蛋白的死亡受体结合结构域的分离多肽可以用作含有CARD的蛋白与死亡受体结合的显性阴性抑制剂，如果该多肽不能抑制死亡受体-诱导的细胞凋亡的话。因而，在一个方面，分离的多肽不能结合胱天蛋白酶或IAP。负责DDX3结合IAP的CARD基序是在约氨基酸50-100。因而，提供的多肽可以包含DDX3的死亡受体结合结构域，但是不包含DDX3的氨基酸50-100。因而，调节剂可以是包含DDX3的氨基酸200-250和/或氨基酸350-400、但是不包含DDX3的氨基酸50-100的多肽。例如，提供了由DDX3的氨基酸151-662组成的多肽。因而，调节剂可以包含由氨基酸序列SEQIDNO:39组成的多肽。在另一个方面，所述多肽可以阻断内源性含有CARD的蛋白与死亡受体的结合。在另一个方面，所述多肽可以阻止IAP向死亡受体的募集。在另一个方面，所述多肽不能抑制FADD向死亡受体的募集。预期这些方面的任意组合。含有CARD的蛋白(例如DDX3)抑制死亡受体-诱导的细胞凋亡的能力，至少部分地归因于含有CARD的蛋白的CARD结构域将IAP募集到死亡受体。因而，提供了阻断IAP与死亡受体的结合的方法，其包含，使细胞接触公开的多肽。也提供了反转细胞对死亡受体激动剂的抗性的方法，其包含，使细胞接触公开的多肽。使用本领域技术人员对特定试剂或化合物已知的任意方法，可以制备本文公开的组合物和执行公开的方法所必需的组合物，除非另有特别说明。例如，所述核酸可以使用标准的化学合成方法来制备，或可以使用酶方法或任何其它已知方法来生产。这样的方法可以是，标准的酶促消化，然后进行核苷酸片段分离(参见例如，Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndEdition(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.，1989)Chapters5，6),至纯合成方法，例如，氰乙基亚磷酰胺法，它使用Milligen或BeckmanSystem1PlusDNA合成^f义(例^口，Milligen画Biosearch的Model8700自动化合成仪，Burlington,MA或ABIModel380B)。可用于制备寡核苷酉交的合成方法，也^己载在Ikuta等，Ann.Rev.Biochem.53:323-356(1984)，(磷酸三酯和亚磷酸三酯方法)，和Narang等，MethodsEnzymol.,65:610-620(1980),(磷酸三酯方法)。蛋白核酸分子可以使用已知方法来制备，例如Nielsen等，Bioconjug.Chem.5:3-7(1994)公开的方法。生产公开的多肽的一种方法是，通过蛋白化学技术，将2个或更多个肽或多肽连接到一起。例如，使用Fmoc(9-药基曱氧羰基)或Boc(叔丁氧羰基)化学，使用目前可得到的实验室设备，可以化学合成肽或多肽(AppliedBiosystems,Inc.,FosterCity,CA)。本领域净支术人员可以容易地明白，例如，与公开的蛋白相对应的肽或多肽，可以通过标准的化学反应来合成。例如，可以合成肽或多肽，且不从它的合成树脂切割下来，然而可以合成肽或蛋白的其它片段，且随后从树脂切割下来，从而暴露在其它片段上功能地封闭的末端基团。通过肽缩合反应，这2个片段可以分别在它们的羧基和氨基末端，通过肽键共价地连接，以形成抗体或其片段(GrantGA(1992)SyntheticPeptides:AUserGuide.W.H.FreemanandCo.，N.Y.(1992);BodanskyM和TrostB.，Ed.(1993)PrinciplesofPeptideSynthesis.Springer-VerlagInc.,NY,它在本文中引作参考，至少关于肽合成的材料)。或者，如本文所述，体内独立地合成肽或多肽。一旦分离，就可以通过类似的肽缩合反应，连接这些独立的肽或多肽，以形成肽或其片段。例如，克隆的或合成的肽片段的酶促连接，允许连接相对短的肽片段，以生成更大的肽片段、多肽或完整蛋白结构域(AbrahmsenL等，Biochemistry,30:4151(1991))。或者，可以使用合成肽的天然化学连接，来从更短的肽片段合成地构建大肽或多肽。该方法由2步化学反应组成(Dawson等SynthesisofProteinsbyNativeChemicalLigation.Science,266:776-779(1994))。第一步是，未保护的合成肽(硫酯)与另一种未保护的含有氨基-末端Cys残基的肽片段化学选择性地反应，以产生硫酯-连接的中间体，作为初步共价产物。不改变反应条件，该中间体经过自发的、快速的分子内反应，以在连接位点形成天然肽键(BaggioliniM等(1992)FEBSLett.307:97-101;Clark-LewisI等，J.Biol.Chem.，269:16075(1994);Clark-LewisI等，Biochemistry,30:3128(1991);RajarathnamK等，Biochemistry33:6623-30(1994))。或者，化学地连接未保护的肽片段，其中在肽片段之间由于化学连接形成的键是非天然的(非-肽)键(Schnolzer,M等Science,256:221(1992))。该技术已经用于合成蛋白结构域的类似物以及大量相对纯的具有完全生物活性的蛋白(deLisleMiltonRC等，TechniquesinProteinChemistryIV.AcademicPress,NewYork,pp.257-267(1992》。下文叙述以下实施例以说明本发明的方法和结果。这些实施例无意包括本发明的所有方面，而是说明代表性的方法和结果。这些实施例并不意欲排除对于本领域技术人员显而易见的本发明的等同方案和变化。实施例实施例1:通过生成死亡结构域功能的阻断，可诱导的肿瘤细胞对TRAIL-R2-介导的细胞凋亡的抗性材津+和方法勿應屑、在沐/口试*:人乳腺癌细月包系MDA-MB-231购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,VA)。得到人卵巢癌细胞系UL-3C。将细胞维持在补加了10。/。热灭活的FCS、50(ag/ml链霉素和50U/mL青霉素的DMEM或RPMI1640中(Cellgro,Mediatec，Inc.,Herndon,VA)。抗-人TRAIL-R1(克隆2E12)和抗-人TRAIL-R2(克隆TRA-8)单克隆抗体如以前所述(Ichikawa,等2003;Ichikawa，等2001)。开发了用于流式细胞术和免疫沉淀测定的抗-人TRAIL-R2(克隆2B4)。重组可溶TRAIL购自AlexisBiochemicals(SanDiego，CA)。多克隆抗-胱天蛋白酶3和抗-胱天蛋白酶8抗体购自BDPharMingen(SanDiego，CA)。制备了单克隆抗-人胱天蛋白酶2、3、8、9和10抗体，和单克隆抗-人Bcl-2、Bcl-xL、Bax、cIAP-l、cIAP-2、XIAP和存活蛋白抗体。多克隆抗-磷酸-SAPK/JNK(Thr"VTyr185)、抗-磷酸-p38MAPK(Thr180/Tyr182)、抗-PARP抗体购自CellSignallingTechnology,Inc.(Beverly,MA)。^元-(3-月几动蛋白3元体购自Sigma(St.Louis,MO)。4元-FADD购自TransductionLaboratories(Lexington,KY)。抗-FLIP购自ProSciInc.(Poway,CA)。所有辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的二级试剂都购自SouthernBiotechnologyAssociates,Inc.(Birmingham,AL)。和-W2^勿^《面《id:^^4勿應^为、浙将106细胞与1(ig/ml生物素化的2E12和l|iig/mlPE-缀合的2B4在冰上温育30分钟。用FACS緩沖液(含有5%FBS和0.01%NaN3的PBS)洗涤2次后，将细胞与Streptoavidin画Cychrome温育。通过FACScan流式纟田月包仪(BD,CA)，分析10,000活细胞。,产#勿應^/"77L4-S、ZE"和7X4/丄-介^^勿/S源亡^《^'/i^勿^^^为Vf:将细胞(1,000细胞/孔)接种进96-孔平板，一式三份，含有8种浓度(从1000ng/ml开始双倍系列稀释)的TRA-8、2E12或TRAIL。过夜培养后，才艮据生产商的说明书(PackardInstruments,Meriden,CT),使用ATPLITE测定，测定细胞生存力。将结果表达为处理的孔中的活细胞与培养基对照孔相比的百分比。*應对77^/丄』2的在^的谬爭将细胞(5X10Vml)与起始剂量的1ng/mlTRA-8温育2天。用新鲜培养基分离细胞，且每隔一天与双倍剂量的TRA-8温育，直到TRA-8剂量达到2,000ng/ml。在每个处理周期中，通过ATPLITE测定，测定未诱导的(亲本)和用诱导剂量的TRA-8诱导处理的细胞的细胞生存力。77M/L-/^的^發和^/^:使用柏DNA校对聚合酶(Invitrogen)，通过聚合酶链反应(PCR)，得到TRAIL-R2的全长cDNA。将cDNA克隆进pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)。选择至少5个独立克隆用于测序。勿應源亡-亩^蛋^的蛋^伊遊为Vf:用冷PBS洗涤肿瘤细胞(3x106)2次，并用含有10mMTris-HCl(pH7.6)、150mMNaCl、0.5mMEDTA、1mMEGTA、0.1%SDS、1mM原钒酸钠和蛋白酶抑制剂混合物(lmM苯曱基磺酰氟、1)ig/ml胃酶抑制剂A、2pg/ml抑酞酶)的300pl裂解緩沖液裂解。将裂解物超声处理10秒，并在12,000g离心20分钟。将含有等量总蛋白的细胞裂解物与SDS-PAGE样品緩冲液煮沸5分钟。在8%、10%或12%SDS-PAGE中分离全细胞裂解物，并电泳地转移至硝酸纤维素膜上。用溶于TBST緩冲液(20mMTris-HCl(pH7.4)、500mMNaCl和0.1%Tween20)中的5%脱脂奶粉封闭印迹，并与溶于封闭緩冲液中的第一抗体在4'C温育过夜。用TBST洗涤印迹3次，并用HRP-缀合的第二抗体在室温探测1小时。用TBST洗涤4次后，根据生产商的说明书，使用ECL蛋白印迹检测系统(AmershamBiosciences,Piscataway，NJ),显现才笨观寸的蛋白。勿應源亡-和勿^/,"f传^-初^差西^脊z夷源斧^cDA^浙人细胞凋亡基因阵列(HS-002)和人信号转导途径发现者基因阵列(HS-008)购自SuperArray，Inc(Frederick,MD)。使用TRIZOL方案(Invitrogen,Carlsbad,CA)，从细胞提取总RNA。用32p-dCTP合成cDNA探针。用32P-dCTP标记的探针在60。C杂交膜印迹上的cDNA过夜。使用CYCLONEPHOSPHORIMAGERTM(PackardInstruments,MeddienCT)，分析基因表达谱。和7X4/丄-i^W^"i《沉淀用冰冷的PBS洗涤107细胞，并用裂解緩沖液(1%TritonX-100、150mMNaCl、10%甘油、20mMTris-HCl[pH7.5]、2mMEDTA、0.57mMPMSF和蛋白酶抑制剂混合物)在冰上裂解15分钟。然后，通过在4。C在16,000g离心10分钟，将裂解物澄清2次。将可溶级分与30^TRA-8或2B4缀合的琼脂糖4B在4。C温育过夜。用裂解緩沖液洗涤7次和用10mMTris洗涤3次后，通过在SDS-PAGE加载緩沖液中煮沸3分钟，洗脱结合的蛋白，并在SDS-PAGE中分离d通过蛋白印迹分析，测定胱天蛋白酶8和FADD的存在。二举,丙谬^麽凝魔冶泳与2B4-琼脂糖4B共免疫沉淀后，洗脱蛋白，用丙酮脱盐，并重构在IEF样品緩冲液(Bio-Rad,Hercules,CA)中。在室温，将160ng总蛋白加载进IPG条(Bio-Rad)过夜，然后在PROTEANIEFCell(BioRad)中分离。用ReadyPrep平衡緩冲液(Bio-Rad)平衡蛋白条，并在100/c)SDS-PAGE凝胶上进一步分离。结束后，用含有10%曱醇和7%乙酸的緩冲液固定凝胶，并用SYPRORuby染色緩冲液(Bio-Rad)染色。使用VERSADOC数字成像系统(Bio-Rad)，将凝胶成像，并用PDQUEST软件(Bio-Rad)分析。结果77M/丄-i^-介爭^勿^敏源亡的遂^^^在y么选择人乳腺癌细胞系MDA-231和人卵巢癌细胞系UL-3C的TRAIL-R2抗性诱导，因为它们共表达高水平的细胞表面TRAIL-R1和-R2，如通过双色流式细胞术分析，使用抗-TRAIL-Rl(2E12)和抗-TRAIL-R2(2B4)抗体所测得的(图1A)。2个肿瘤细胞系易感激动性抗-TRAIL受体抗体2E12和TRA-8以及TRAIL诱导的细胞凋亡，如通过体外细胞毒性测定所测得的(图1B)，这表明TRAIL的2种受体在2个肿瘤细胞系中都是有功能的。为了确定这些肿瘤细胞是否在处理后发展对TRA-8的细胞凋亡抗性，从非-细胞凋亡剂量(lng/ml)的TRA-8开始，处理细胞2天，然后每隔一天加倍剂量，直到2，000ng/ml,然后撤除TRA-8。在每个剂量，测量处理的和未处理的细胞的细胞生存力。TRA-8剂量低于10ng/ml时，处理的和未处理的细胞没有显著的细胞死亡。当TRA-8剂量增加到50ng/ml或更高时，在未处理的细胞中观察到TRA-8剂量-依赖性的细胞生存力降低。相反地，在最高达2000ng/ml的处理细胞中，没有显著的细胞死亡(图1C)。这些结果表明，用较低的、非-细胞凋亡诱导剂量的TRA-8重复处理肿瘤细胞，诱导细胞凋亡抗性，且诱导的抗性不是由于去除细胞凋亡敏感细胞的选择过程。撤除TRA-8后4周，测试亲本细胞(MDA-231P、UL-3CP)和处理的细胞(MDA-231R、UL画3CR)对TRA画8、2E12或TRAIL诱导的细胞凋亡的易感性。与用1,000ng/mlTRA-8处理后亲本细胞几乎100%细胞死亡相比，一定浓度范围的TRA-8没有诱导MDA-231R和UL-3CR细胞的显著的细胞死亡(图2A),从而表明细胞变得对TRA-8-58诱导的细胞凋亡具有高抗性。相反地，TRA-8抗性的肿瘤细胞对2E12-诱导的细胞凋亡的易感性保持不变(图2B)。尽管降低了易感性，但诱导的TRA-8抗性细胞仍然对TRAIL-介导的细胞凋亡易感(图2C)。这些结果表明，TRA-8-诱导的细胞凋亡抗性对TRAIL-R2是选择性的。撤除TRA-8后，细胞保持TRA-8抗性状态至少3个月，然后易感性在4个月期间緩慢恢复至亲本细胞的约30%水平(图2D)，从而表明诱导的对TRA-8的抗性是持久的，但是部分可逆的。W^^戈力在W勿應源亡^潜。TRA-8-诱导的细胞凋亡抗性对TRAIL-R2是选择性的，这表明，可以选择性地降低TRAIL-R2的表达，或TRAIL-R2的突变可以发生在诱导TRA-8抗性之后。为了排除这些可能性，检查了TRAIL-R2的细胞表面表达，且检测到与它们的亲本细胞相比，2种TRA-8抗性细胞中的TRAIL-R2表达水平都没有变化(图3A)。该结果得到了蛋白印迹分析的进一步证实，从而表明TRAIL-R2蛋白的2种同工型在亲本和抗性细胞中同样地表达(图3A)。对从TRA-8抗性细胞系分离的TRAIL-R2的全长cDNA克隆测序，且没有鉴别出突变。这些结果表明，诱导的和选择性的对TRAIL-R2的抗性不是由于TRAIL-R2自身的变化。通过许多细胞凋亡调节蛋白，例如细胞凋亡抑制剂(IAP)家族(Park:等2002;Ng，等2002;Roa，等2003;Cummins，等2004;Li，等2004;Bockbrader,等2005)和Bcl誦2家族(Hinz,等2000;Rokhlin，等2001;Fulda，等2002;Carthy，等2003;Chawla-Sarkar,等2004;Sinicrope，等2004),可以调节TRAIL-R2-介导的细胞凋亡。使用一组新开发的单克隆抗体，通过蛋白印迹分析，检查了cIAPl、cIAP2、XIAP、存活蛋白、Bcl-2、Bcl-xL和Bax的蛋白表达水平。尽管MDA231和UL-3C表达可变水平的这些蛋白，但亲本和抗性细胞之间没有显著差异(图3A),从而表明这些蛋白的表达水平不可能参与TRA-8的诱导。使用膜cDNA阵列(Superarray，Frederick,MD)，它包4舌超过200个熟知的细胞凋亡-相关的基因(图3B，上图)和细胞信号传导基因(图3B,下图)，更广泛地筛选一组细胞凋亡-和细胞信号传导-相关基因中的潜在转录变化。MDA231亲本和抗性细胞之间的平行对比表明，诱导TRA-8-抗性之后，这些基因的表达谱没有显著变化。我^^9f勿乂敏哞77L4/L-i^勿乂敏源亡/-矛#爭^这#"#逸辟。上游胱天蛋白酶8和下游胱天蛋白酶3的顺序激活，是TRAIL-R2细胞凋亡信号转导的关键事件。因而，检查了这2种胱天蛋白酶的时间-依赖性的激活。如前面所表明的，用TRA-8处理TRA-8敏感的亲本MDA231细胞，诱导胱天蛋白酶8(图4A，上图)和胱天蛋白酶3(图4A,中图)的激活，如通过TRA-8处理后胱天蛋白酶的切割片段的产生所证实的。作为胱天蛋白酶激活的非常敏感的标记，PARP被迅速切割(图4A，下图)。但是，TRA-8处理后，胱天蛋白酶8、胱天蛋白酶3的激活和PARP的随后切割，不发生在抗性细胞中。胱天蛋白酶级联的激活的失败，不是由于胱天蛋白酶途径的内在缺陷，因为TRA-8抗性细胞中的2E12-触发的TRAIL-R1胱天蛋白酶激活级联没有受损(图4A,左图)。这些结果表明，在TRA-8抗性诱导后，在上游胱天蛋白酶8的水平，选择性地阻断了TRAIL-R1相关胱天蛋白酶级联。JNK/p38激酶途径的胱天蛋白酶8-依赖性的激活，在TRAIL-R2-介导的细胞凋亡中起关键的协同作用(Ohtsuka，等20(B;Ohtsuka，等2002)。在TRA-8处理过程中，通过JNK/p38激酶的磷酸化的蛋白印迹分析，测量了JNK/p38激酶的激活。与胱天蛋白酶8激活相应地，JNK(图4B，上图)和p38(图4B，下图)以时间-依赖性的方式迅速磷酸化。但是，在TRA-8抗性细胞中，仅2E12而不是TRA-8能诱导JNK/p38的磷酸化，从而表明TRA-8-抗性细胞中的JNK/p38激酶途径也被选择性地抑制。7T^-S戎^^vf勿/g^77^/丄-/2死亡潜沟試^^的遂举^胆餘。由于FADD和胱天蛋白酶8被募集到TRAIL-R2的死亡结构域，且是DISC的主要组分，所以通过共免疫沉淀测定，检查了亲本和抗性细胞中在TRAIL-R1和TRAIL-R2处形成DISC的能力。在MDA231亲本细胞中，用TRA-8或2E12处理后，存在FADD(图5A，上图)和胱天蛋白酶8(图5A，中图)的时间-依赖性的增加，它们分别与TRAIL-R2(图5A，左图)或TRAIL-R1(图5A,右图)共免疫沉淀。在TRA-8抗性细胞中，在TRA-8-介导的细胞凋亡过程中，没有TRAIL-R2共免疫沉淀的FADD和胱天蛋白酶8,但是没有影响2E12处理后FADD和胱天蛋白酶8与TRAIL-R1的共免疫沉淀。而且，为了确定cFLIP(胱天蛋白酶8的对死亡结构域的抑制性竟争剂)是否在阻断DISC形成中起作用，还检查了cFLIP与TRAIL-R1和TRAIL-R2的共免疫沉淀。以类似的时间-依赖性的方式，在亲本细月包中，在TRA-8-介导的细胞凋亡过程中，cFLIP与TRAIL-R2共免疫沉淀，但是在抗性细胞中则没有(图5A，下图)。在2E12-介导的细胞凋亡过程中，亲本和TRA-8抗性细胞之间的cFLIP与TRAIL-R1的共免疫沉淀没有不同。因为FADD、胱天蛋白酶8和cFLIP的总蛋白表达水平类似，所以这些死亡结构域-相关蛋白的募集失败，不是由于这些蛋白的缺陷表达。这些结果表明，诱导的TRA-8抗性可能是由于在TRA-8处理后，在DISC形成中TRAIL-R2募集FADD和胱天蛋白酶8的选择缺陷。TRA-8抗性细胞中在TRAIL-R2的死亡结构域装配DISC的失败表明，改变了TRAIL-R2蛋白复合物的功能和组成，其中新产生的或功能上改变的蛋白可以结合TRAIL-R2,并阻止FADD和胱天蛋白酶8向TRAIL-R2的死亡结构域的募集。因而，通过二维蛋白组学分析和质谱法分析，对比了TRA-8处理之前和之后，TRA-8-敏感的亲本和TRA-8-抗性MDA231细胞中TRAIL-R2-相关蛋白的蛋白组学语。通过PDQuest软件，分析了与TRAIL-R2共免疫沉淀的差异表达的蛋白，这引导我们集中到在TRA-8-介导的细胞凋亡过程中亲本和抗性细胞之间改变的3个蛋白点(图5B)。分别代表50kDa或20kDa的分子量的蛋白质量的点1和2,在TRA-8处理后只出现在MAD-231亲本细胞中，而没有出现在未处理的细胞和TRA-8-处理的抗性细胞中，从而表明在TRA-8-介导的细胞凋亡过程中这些蛋白可被募集到TRAIL-R2。基于它们的分子量和等电点，通过蛋白印迹分析证实，点1中的蛋白是胱天蛋白酶8(图5C),且点2中的蛋白是FADD(图5D)。点3中的蛋白令人感兴趣，因为它们恒定地结合TRAIL-R2,且在TRA-8國介导的细胞凋亡过程中发生从更高分子量蛋白向更低分子量蛋白的迁移(图5E)。该转化似乎与诱导的TRA-8抗性有关，因为它仅仅在TRA-8-处理的MDA231亲本细胞中观察到，而没有在抗性细胞中观察到。另外，质谱法分析鉴别出的2个点都源自DDX3，即DEAD-框RNA解旋酶家族的成员。因为高分子量形式的DDX3恒定地结合TRA-8抗性细胞中的TRAIL-R2,所以它可以是阻止FADD和胱天蛋白酶8向TRAIL-R2的死亡结构域募集的因子。r^-S戎#。化疗剂体外和体内地协同增强TRA-8-介导的细胞凋亡(Ohtsuka,等2003;Ohtsuka，等2002;Buchsbaum等2003)，特别是在那些TRA-8抗性细胞中。为了确定化疗剂是否能反转诱导的TRA-8抗性，检查了一组化疗剂(阿霉素、Texol、顺铂和双口引咮基马来酰亚胺VIII(BisVIII))对诱导的抗性细胞的TRA-8-介导的细胞凋亡的作用。在有指示浓度的化疗剂存在下，恢复了TRA-8抗性的MDA-231和UL-3C细胞中的TRA-8剂量-依赖性的反应(图6A),从而表明所有化疗剂都能反转TRA-8-诱导的抗性。使用一组单克隆抗-胱天蛋白酶抗体，检查了用阿霉素和TRA-8联合处理后，MAD-231抗性细胞中的胱天蛋白酶级:眹的激活。由于抗-胱天蛋白酶8(克隆2F4)和抗-胱天蛋白酶2(克隆2A3)仅仅分别识别原形式的胱天蛋白酶8和2，所以通过切割造成的原形式的减少的量，证实了胱天蛋白酶8和2的激活。抗-胱天蛋白酶9(克隆4B4)和抗-胱天蛋白酶3(克隆1H6)会分别识别原形式和切割形式的胱天蛋白酶9和3,通过胱天蛋白酶9和3的切割片段的存在，表明了它们的激活。用单独的TRA-S(图6B，泳道》或阿霉素(图6B,泳道4)进行单试剂处理4小时，与未处理的对照相比，没有诱导所有测试的胱天蛋白酶的任何显著激活(图6B，泳道1)。相反地，早在用阿霉素和TRA-8联合处理后1小时，就诱导了胱天蛋白酶2、9和3的激活(图6B，泳道2),这在4小时时间点得到进一步增强(图6B,泳道3)。在联合处理后4小时时间点，胱天蛋白酶8的激活是明显的。这些结果表明，用阿霉素处理恢复TRA-8抗性细胞中TRAIL-R2-相关的胱天蛋白酶级联。在有阿霉素存在下，TRA-8能触发FADD向TRAIL-R2的募集(图6C,泳道2和3),阿霉素处理恢复了TRAIL-R2的募集功能。实施例2:DDX3在TRAIL-R2-介导的细胞凋亡中的作用材料和方法-^敏屑、在#/口试/六人乳&，癌细月包系MDA-MB-231购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Manassas,VA)。得到人卵巢癌细胞系UL-3C。将细胞维持在补加了10。/。热灭活的FCS、50lag/ml链霉素和50U/mL青霉素的DMEM或RPMI1640中(Cellgro,Mediatec,Inc.，Herndon,VA)。抗-人TRAIL-R1(克隆2E12)和抗-人TRAIL-R2(克隆TRA-8)单克隆抗体如以前所述(Ichikawa,等2003;Ichikawa,等2001)。开发了用于流式细胞术和免疫沉淀测定的抗-人TRAIL-R2(克隆2B4)。重组可;容TRAIL购自AlexisBiochemicals(SanDiego,CA)。多克隆抗-胱天蛋白酶3和抗-胱天蛋白酶8抗体购自BDPharmingen(SanDiego,CA)。制备了单克隆抗-人胱天蛋白酶2、3、8、9和10抗体，和单克隆抗-人Bcl-2、Bcl-xL、Bax、cIAP-l、cIAP-2、XIAP和存活蛋白抗体。抗-PARP抗体购自CellSignallingTechnology,Inc.(Beverly,MA)。抗-卩-月几动蛋白抗体购自Sigma。抗-FADD购自TransductionLaboratories(Lexington,KY)。所有,束才艮过氧^匕物酵(HRP)画纟晨合的二级i式剂者卩购自SouthernBiotechnologyAssociates,Inc.(Birmingham,AL)。有活性的胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-3、胱天蛋白酶-6、胱天蛋白酶-7、胱天蛋白酶-8、胱天蛋白酶-9和胱天蛋白酶-10购自EMDBiosciences,Inc(SanDiego，CA)。荧光肽书亍生物Ac-Val画Asp陽Val画Asp画AMC(Ac-VDVAD-AMC,260060M001,SEQIDNO:40)、Ac-Asp画Glu-Val画Asp-氨基-4-曱基香豆素(Ac-DEVD画AMC,260031M001,SEQIDNO:41)和Ac-羰基画Ile-Glu画Thr-Asp-7-酰胺基-4-曱基香豆素(Z-IETD-AMC,260042M001，SEQIDNO:42)购自AlexisBiochemicals,SanDiego，CA。胱天蛋白酶-2、-3、-8、-10抑制剂(FMKSP01)购自R&DSystems,Inc.。方/vf-S、2五72#77^几-介^W勿/《源亡的《4''/SW-皮^敏毒#为\#。将细胞(l，OOO细胞/孔)接种进96-孔平板，一式三份，含有8种浓度(从1000ng/ml开始双倍系列稀释)的TRA-8、2E12或TRAIL。过夜培养后，根据生产商的说明书(PackardInstruments,Meriden,CT),使用ATPLITEtm測定，测定细胞生存力。将结果表达为处理的孔中的活细胞与培养基对照孔相比的百分比。^式'勿y敏^。用PBS洗涤细胞(106)—次，并重新悬浮于含有第一抗体(1fag/ml的TRA-8)的1ml冷FACS緩沖液(含有5%FBS和0.01。/。NaN3的PBS)中。将细胞在冰上染色60分钟，然后用3ml冷FACS緩沖液洗涤，并与第二抗体(PE-缀合的山羊抗-小鼠IgG的1:100稀释液)在4。C在黑暗中温育60分钟。用另外3mlFACS緩沖液洗涤后，通过FACSCAN流式细胞仪(BDBiosciences,SanJose,CA)，分析每个样品的IO，OOO细胞。勿應源亡-初^f4^夕f^伊遂为V^f:用冷PBS洗涤肿瘤细胞(3x106)2次，并用含有10mMTris-HCl(pH7.6)、150mMNaCl、0.5mMEDTA、lmMEGTA、0.1%SDS、1mM原钒酸钠和蛋白酶抑制剂混合物(lmM苯曱基磺酰氟、lpg/ml胃酶抑制剂A、2ng/ml抑酞酶)的300pl裂解緩沖液裂解。将细胞裂解物超声处理IO秒，并在l2，000g离心20分钟。将含有等量总蛋白的细胞裂解物与SDS-PAGE样品緩冲液煮沸5分钟。在8%、10%或12%SDS-PAGE中分离全细胞裂解物，并电泳地转移至硝酸纤维素膜上。用溶于TBST緩沖液(20mMTris-HCl(pH7.4)、500mMNaCl和0.1%Tween20)中的5%脱脂奶粉封闭印迹，并与溶于封闭緩冲液中的第一抗体在4'C温育过夜。用TBST洗涤印迹3次，并用HRP-缀合的第二抗体在室温探测1小时。用TBST洗涤4次后，根据生产商的说明书，使用ECL蛋白印迹检测系统(AmershamBiosciences)，显现:探测的蛋白。DAOW《这不义。设计RNAi:使用在线设计工具BLOOK-iTRNAiDesigner(Invitrogen)，鉴别DDX3的RNAi耙。从前IO个最高评分的RNAi靶中，选择5个靶向的shRNA序列(参见表2)。表2.shRNA方向有义-环-反义构建f-链序列jlCACCAAGCTTGCGCTATATTCCTCCTCATTTcgaaAAAT1108-上GAGGAGGAATATAGCGCCTCGAG128tAAAACTCGAGGCGCTATATTCCTCCTCATTTttcgAAAT卜GAGGAGGAATATAGCGCAAGCTThCACCGGAGAAATTATCATGGGAAACcgaaGTTTCCCAT2562-工GATAATTTCTCC582卞AAAAGGAGAAATTATCATGGGAAACttcgGTTTCCCAT卜GATAATTTCTCCpCACCGCCAAGTGATATTGAAGAATAaac^TATTCTTCA31554-工ATATCACTTGGC1574AAAAGCCAAGTGATATTGAAGAATAcgttTATTCTTCAA"TATCACTTGGCpCACCGCTTTCCAGCGGGTATATTAGcgaaCTAATATACC45'UTRCGCTGGAAAGC^AAAAGCTTTCCAGCGGGTATATTAG加gCTAATATACC「CGCTGGAAAGCpCACCGCTGATCGGATGTTGGATATGcgaaCATATCCAA51045-工CATCCGATCAGC1065AAAAGCTGATCGGATGTTGGATATGttcgCATATCCAAC「ATCCGATCAGC然后，将它们克隆进BLOCK-iTU6进入载体。shRNA由U6启动子驱动，且可以在大多数分裂的或未分裂的哺乳动物细胞类型中瞬<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>时表达。使用LIPOFECTAMINE2000(Invitrogen)，用RNAi转染抗性细胞，进行RNAi反应。转染后36小时，使用抗-DDX3抗体，通过蛋白印迹分析测定降低的DDX3表达。一旦实现降低的DDX3表达，就合成siRNA寡核普酸(靶序列GGAGAAATTATCATGGGAAAC(SEQIDNO:27):有义RNA5'-Fl-GGAGAAATTATCATGGGAAAC(F1-SEQIDNO:27)(Fl=焚光素)；反义RNA5'隱GUUUCCCAUGAUAAUUUCUCC-3'(SEQIDNO:28》，且RNAi对照寡核苷酸(RI-010-DP)购自Molecula(Columbia,MD)。表达载体的生成。将全长DDX3克隆进pcDNA3.1质粒(Invitrogen),在DDX3的N-末端具有His标记。使用下面的引物对，用从MDA231细胞提取的总RNA，通过反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR),生成DDX3和TRAIL-R2cDNA:具有BamHI的DDX31正向引物5'曙acggatccaaatgagtcatgtggcagtgga-3'(SEQIDNO:29);具有xhol的DDX3662反向引物5'-ctctcgagcaaagcaggctcagttaccc-3'(SEQIDNO:30)。具有Kpnl的TRAIL-R21正向引4勿5'-aaaggtaccagccatggaacaacggggacag-3，(SEQIDNO:31);具有EcoV的TRAIL-R2441反向引物5'-aaagatatcttaggacatggcagagtctgcatt-3，(SEQIDNO:32);将分离的DDX3的聚合酶链反应片段符合读框地克隆进pcDNA3.1-His载体(Invitrogen)。将TRAIL-R2cDNA克隆进pshutter-CMV载体。通过DNA测序，i正实正确的序列。通过缺失BamHI和xhol位点之间的DDX3序歹ll，生成DDX3/pcDNA3.1-His表达质粒。具有BamHI的DDX3151正向引物5'-acggatccaaatgttttctggaggcaacactggg-3，(SEQIDNO:33);^吏用下面的引物,通过缺失TRAIL-R2序列，生成TRAIL-R2/pshutter-CMV表达质粒具有EcoRV的TRAIL-R2340反向引物5'-aaagatatcttactgtctoagagtctcagtgggatc画3，(SEQIDNO:34);具有EcoRV和xhol的TRAIL-R2330反向引物5，-aaagatatcctcgagatttgctggaaccagcagcct曙3，(SEQIDNO:35)。在细霧哞淘建DDX3的4迷者在。将DDX3或cIAPl片段插入TOPO100载体(Invitrogen)。将得到的质粒转化进大肠杆菌4朱BL21(DE3)，其在LB培养基中生长至指数期，并用0.4mM异丙基-l-硫代-卩-D-吡喃型半乳糖苷诱导3小时。沉淀细胞，重新悬浮于裂解緩沖液(30mMTris画HCl,pH7.5,0.1mMNaCl，1mMDTT,0.1mMEDTA,1%NonidetP-40,和20pg/mlPMSF)，并超声处理。通过Ni柱，纯化在14,000xg离心15分钟后的上清液。通过BCA测定(Pierce，Rockford,IL),测定蛋白浓度，并将等分试样保藏在80°C。4'373勿f^肄^脊袭。使用LIPOFECTAMINEtm2000(Invitrogen,Inc.),用表达载体转染293或3T3细胞。转染24小时后，使用各自的单克隆抗体，通过蛋白印迹分析，测定蛋白表达。关于共免疫沉淀分析，用含有蛋白酶抑制剂混合物的免疫沉淀-裂解緩冲液裂解细胞。^^^沉/定熟^C。将抗-DDX3或抗-TRAIL-R2抗体缀合到琼脂糖珠(Sigma)上。如下测定TRAIL-R2DISC的组成。在37°C,用500ng/ml的TRA-8处理5乂106细胞(如果没有不同说明)指示的时间，然后在免疫沉淀-裂解緩冲液(20mMTris-HCl，pH7.4，150mMNaCl,0.2%NONIDETP40，和10%甘油和完全蛋白酶抑制剂混合物)中裂解，或不经处理地裂解(无刺激的条件)。然后，在4°C,用30pl珠沉淀TRAIL-R2DISC过夜。免疫沉淀后，用裂解緩沖液洗涤珠4次。然后，用lOmMTris緩沖液洗涤珠5次，并重新悬浮于加载緩沖液，以用于SDS-PAGE和免疫印迹分析。##/鍵天资^瘅法#^/定。在96-孔干净底板中进行焚光测定，且在一式三份孔中进行所有测量。加入100pl测定緩沖液(10mMHEPESpH7.0,50mMNaCl,2mMMgCl2，5mMEDTA，和1mMDTT)。向每个孔中加入有活性的胱天蛋白酶-8和肽底物(Ac-IETD-AMC),至终浓度100ng/pl。加入共免疫沉淀洗脱级分，以开始反应。在含有测定緩沖液、底物和没有细胞裂解物的裂解緩冲液的孔中，测量背景荧光。测定平板在37。C温育1小时。在设定为355-nm激发和440-nm发射的荧光平板读数器(Bio-Tek，Winooski,VT)上，测量荧光。沐^應vef^躇勿萄灣;t。在体外测定中，检查胱天蛋白酶切割DDX3的能力。切割反应在37。C进行30分钟，包括10ul来自TRAIL-R2co-IP的洗脱级分、10ul反应緩沖液(10mMHEPES[pH7.0]，50mMNaCl,2mMMgCl2,5mMEGTA,1mMDTT,2mMATP)和5ul(0.1U/pl)重组活性形式的胱天蛋白酶。使用抗-DDX3抗体，通过蛋白印迹测定切割。结果娱遞f47^蛋^邀夢^、^f,该f^造^戎^勿/敏尹7X4/丄-Z^W^亡潜y々嫂^胆凑。自发发展的或诱导的对治疗剂TRAIL和激动性抗体(它们靶向死亡受体)的细胞凋亡抗性，代表着用这些试剂有效治疗癌症的主要障碍。为了确定抗性细胞中TRAIL-R2死亡结构域复合物的替代组成，通过二维蛋白组学分析和质谱法分析，对比了TRA-8处理之前和之后，TRA-8-敏感的亲本和TRA-8-抗性MDA231细胞中存在的TRAIL-R2-相关蛋白的蛋白组学谱。在用SYPROruby(MolecularProbes,Eugene,OR)染色的二维凝月交的4企查中，发现了约80KDa的蛋白点。该蛋白与TRAIL-R2的结合，阻断TRAIL-R2DISC的形成，从而造成TRA-8抗性。从SDS-PAGE切下约80kd蛋白，用胰蛋白酶消化，并通过质谱法分析肽序列。来自6个消化的片段的蛋白氨基酸序列与人DDX3的Genbank序列100%相同(表3)，从而表明在与DISC形成相关的TRA-S-诱导的细胞凋亡过程中，DDX3从TRAIL-R2解离。如果该蛋白保持结合TRAIL-R2-相关蛋白复合物，那么它可以阻止FADD募集，并造成DISC形成的失败。表3.DDX3片段<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>DAO^€T7^/丄-i^-介^的细^源亡^^Jf的7T^/丄-i^-V《^f^。为了确定DDX3是否确实结合TRAIL-R2，将DDX3的全长(氨基酸l-662)、N-末端片段(氨基酸l-316)和C-末端片段(氨基酸310-662)克隆进在N-末端具有6-His标记的PCDNAI113.1。将这些表达载体转染进MDA231亲本细胞，以实现DDX3的重组全长和缺失突变体的超表达。但是，如通过共免疫沉淀分析，然后通过使用抗-6-His抗体的蛋白印迹分析测得的，仅仅全长DDX3而不是它的N-末端和C-末端缺失突变体结合TRAIL-R2(图8A)。这些结果证实，DDX3结合TRAIL-R2,且它与TRAIL-R2的结合是全长依赖性的。在MDA231细胞中，用抗-TRAIL-R2免疫沉淀DDX3。为进一步证实DDX3与TRAIL-R2的结合，在大肠杆菌中表达DDX3的N-末端、C-末端片段和全长版本。纯化蛋白，并将其用作抗原，以产生针对DDX3的多克隆抗体和一组单克隆抗体。使用小鼠抗-DDX3单克隆抗体，通过共免疫沉淀和蛋白印迹分析，检测TRAIL-R2-结合的DDX3。结果证实，在非细胞凋亡的亲本和抗性细胞中，DDX3与TRAIL-R2共免疫沉淀(图7)。在TRA-8-敏感的细胞中，在细胞凋亡过程中，存在DDX3的时间-依赖性的降低，但是在TRA-8-抗性细胞中没有。另外，通过蛋白印迹分析，观察到TRA-8-诱导的细胞凋亡过程中TRAIL-R2-结合的DDX3的快速降低和切割。这表明，DDX3的切割是胱天蛋白酶-依赖性的。基于这些结果，细察了DDX3序列在N-末端的潜在切割位点，且在氨基酸129-135处发现了相对保守的胱天蛋白酶切割基序DKSDEDD(SEQIDNO:46)。切割似乎发生在DISC上，并导致DDX3的关键功能元件从TRAIL-R2释放。这些数据与以后的模型相符，其表明开始的的胱天蛋白酶被迅速募集到TRAIL-R2，并容易地切割DDX3。另外，FADD和胱天蛋白酶-8结合并募集TRAIL-R2，以形成DISC，这又导致与TRAIL-R2-结合的DDX3切割相关联的胱天蛋白酶级联激活，这表明，在某些情况下，DDX3是细胞凋亡程序必需的，从而表明DDX3结合参与TRAIL-R2-介导的细胞凋亡抗性的TRAIL-R2。乂,DZIO力77L4/￡-的^智3#^^誠#^。为了更好地理解DDX3在TRAIL-R2-介导的信号转导中的调节，使用已经用编码DDX3的缺失突变体的质粒瞬时转染的HEK293A细胞，测定结合TRAIL-R2必需的大概DDX3区域(图8A)。使用TRA-8，通过共免疫沉淀，测定重组DDX3和TRAIL-R2的相互作用。全长DDX3、DDX3A201-662或DDX3A1-400结合TRAIL-R2。但是，DDX3A251-662和DDX3A1-350都不结合TRAIL-R2(图8A),这表明DDX3具有2个TRAIL-R2结合基序。一个位于N-末端(氨基酸200-250);另一个邻近氨基酸350-400。来自相同细胞的裂解物的蛋白印迹分析，证实了相当量的野生型DDX3和DDX3缺失片段的生产，作为这些结果的解释，排除了蛋白表达的差异。DDX3永久结合TRAIL-R2,并与TRA-8-抗性细胞中FADD募集的阻断相关联，从而表明TRAIL-R2-结合的DDX3阻止FADD的募集。DDX3和FADD之间可以通过TRAIL-R2相连。为了测试DDX3和FADD是否在TRAIL-R2的死亡结构域处共有共同结合基序或2个结合基序是否紧靠在一起，从而使得结合前的DDX3干扰FADD的募集，测定了TRAIL-R2中DDX3-结合结构域的位置。构建了编码全长TRAIL-R2和一系列氨基末端结构域缺失(包括完全缺失死亡结构域)的TRAIL-R2的载体(图8B)。在类似的方法中，为了评价DDX3的功能，和排除内源人TRAIL-R2，选择鼠成纤维细胞细胞系NIH3T3作为共表达人TRAIL-R2和DDX3的宿主细胞。用编码His-标记的DDX3和全长TRAIL-R2、DDX3和一系列TRAIL-R2缺失突变体和单独的DDX3的质粒，共转染3T3细胞。使用TRA-8染色，通过流式细胞术，检查细胞表面TRAIL-R2表达。所有转染的细胞表现出类似水平的细胞表面TRAIL-R2(图8B)，从而表明胞内结构域的缺失不改变细胞表面TRAIL-R2。另外，所有转染的细胞都表达类似水平的重组DDX3，如使用抗-6-his抗体，通过全细胞裂解物的蛋白印迹分析所测得的。通过与TRA-8的共免疫沉淀和与抗-6-His抗体的蛋白印迹分析，检查重组DDX3与TRAIL-R2的缺失突变体的结合(图8B)。TRAIL-R2与DDX3的相互作用独立于TRAIL-R2的死亡结构域。为了进一步更准确地确定TRAIL-R2结合基序，构建了TRAIL-R2的其它缺失突变体D330和截短的TRAIL-R2(T300-330)(图8C)，与DDX3共转染进3T3细胞，并分析它们的相互作用。结果证实，DDX3不结合TRAIL-R2死亡结构域，但是结合邻近死亡结构域(氨基酸340-氨基酸420)的膜近侧区域(氨基酸300-330)(图8C)。这表明，DDX3可能起与以前鉴别出的TRAIL-R2信号传导中的死亡结构域-相关蛋白不同的作用。另外，该区域是与TRAIL-R1和DcR2高度同源的(图8D)。这些数据表明，DDX3是与死亡受体家族的成员结合的共同衔接蛋白。舍IC4WD。接着，通过分析该分子的特性，研究了DDX3在TRAIL-R2-介导的细胞凋亡中的功能显著性。最近，已经鉴别出了DEAD框蛋白家族的至少2种RNA解旋酶，它们含有胱天蛋白酶募69集结构域(CARD),这些RNA解旋酶中的CARD起细胞凋亡调节剂的作用。因为DDX3在TRAIL-R2-介导的细胞凋亡的调节中起重要作用，所以DDX3(DEAD框蛋白家族的解旋酶的成员)也可以具有CARD,且DDX3的细胞凋亡抑制功能可以直接依赖于CARD。因此，检查了DDX3是CARD蛋白的可能性。氨基酸比对分析表明，DDX3含有氨基酸50-氨基酸150之间的保守作用基序，正如MDA5和RIGI。CARD是同型相互作用基序。含有CARD的蛋白可以通过该结构域彼此相互作用。因为DDX3是新的、高度保守的含有CARD的解旋酶，所以它能与其它CARD蛋白相互作用。cIAPl(也是一种含有CARD的蛋白)已经广泛地被视作胱天蛋白酶的抑制剂，并被募集到TNFRI和TNFRII，以调节TNTRI-介导的细胞凋亡。在共免疫沉淀试验中使用抗-DDX3或抗-TRAIL-R2抗体，测试DDX3是否能与cIAPl相互作用。通过TRA-8未处理的亲本和抗性细胞中的共免疫沉淀的TRAIL-R2和共免疫沉淀的DDX3分析，可以确定，cIAPl可以容易地与DDX3和与TRAIL-R2复合物共免疫沉淀(图8E。但是，cIAPl迅速从TRAIL-R2-DDX3复合物释放出来，且这与亲本细胞中DDX3切割相关联。相反地，TRA-8处理后，抗性细胞中TRAIL-R2-DDX3复合物的cIAPl水平增加(图8E。这些结果表明，DDX3能用作TRAIL-R2和cIAPl之间的连接。a"ocWow"y>DZXO4A脊戎'/么为了研究DDX3在TRAIL-R2信号传导中的作用，检查了内源DDX3在TRA8-诱导的细胞凋亡中的重要性。由于在TRA-8-诱导的细胞凋亡过程中，抗性细胞中的DDX3没有降低，所以癌细胞对细胞凋亡的易感可能需要降低水平的DDX3表达。使用RNAi策略来确定DDX3在对TRAIL-R2-介导的细^^凋亡的抗性中的作用。4吏用在线_没计工具BLOOK-iTRNAiDesigner(Invitrogen)，鉴别DDX3的RNAi草巴。从前10个最高评分的RNAi把中，选择5个耙向的shRNA序列，并将其克隆进BLOCK-ITU6进入载体。用5个RNAi构建体，转染TRA-8-抗性MDA"1细胞，且在转染后48小时，使用单克隆抗-DDX3抗体，通过蛋白印迹分析，测定DDX3的蛋白表达水平。与未转染的或GFP-转染的对照相比，4/5测试的RNAi构建体是DDX3表达的非常有效的(超过50%降低)抑制剂(图9A)。选择这些构建体中最有效的#2,用70于分析DDX3敲减在TRA-8-介导的细胞凋亡中的作用。为了确定敲减DDX3表达是否反转TRA-8-抗性细胞中的TRA-8易感性，用RNAi载体(构建体#2)和作为转染细胞的指示剂的GFP表达载体，共转染TRA-8-抗性MDA231细胞。转染后48小时，用TRAIL-R2共免疫沉淀DDX3，并用抗-DDX3抗体探测。如预期的，与对照细胞相比，DDX3的表达显著降低(图9B)。分选GFP-阳性的细胞，并用各种浓度的TRA-8培养过夜。使用ATPLITE测定，用GFP和对照载体转染的MDA231细胞在TRA-8处理后没有发生细胞凋亡，从而表明细胞保留对TRA-8的抗性。但是，用DDX3RNAi和GFP共转染的细胞表现出TRA-8剂量-依赖性的细胞死亡(图9C)。使用TUNEL染色，发现显著量的DDX3敲减细胞发生了细胞凋亡(图9D)。这些结果表明，DDX3表达的下调反转TRA-8抗性。为了进一步测定DDX3在TRAIL-R2-介导的细胞凋亡中的起因作用，在一组肿瘤细胞中降低DDX3表达，并分析它们对TRA-8-诱导的细胞凋亡的易感性。DDX3RNAi减少该组肿瘤细胞(包括有些自发的抗性细胞)中的内源DDX3的量，并增加TRA8-诱导的细胞凋亡(图9E-F)。相反地，用对照寡核苷酸转染的细胞表现出正常的DDX3表达，并保持对TRA-8-诱导的细胞凋亡的抗性(图9E-F)。因而，DDX3是TRAIL-R2信号转导机构的关键组分，且是对TRAIL-R2-介导的细胞凋亡的抗性所必需的。^IDDX潜合^^77^/丄-/^^傻勿^敏源亡的。为了测试DDX3结合基序是否代表调节TRAIL-R2的死亡结构域功能的新的负调节结构域，对比了突变型TRAIL-R2与野生型TRAIL-R2的细胞凋亡诱导功能。用没有死亡结构域的TRAIL-R2转染的细胞似乎对TRA-8处理无反应，但是用含有截短的DDX3结合结构域的TRAIL-R2转染的细胞似乎是促细胞凋亡的，且与野生型TRAIL-R2-转染的细胞相比，表现出对TRA-8-诱导的细胞凋亡更高的易感性(图10)。存在DDX3的显著抑制作用，其可以阻抑TRAIL-R2-介导的细胞凋亡。这些发现表明，DDX3是TRAIL-R2-诱导的细胞凋亡的抑制性介质。DDX37TL4/丄-7^-介爭的勿z敏游亡的C4iZ)f^。为了分析TRAIL-R2-DDX3-cIAPl信号传导，评价了它结合cIAPl所需的区域。由于CARD是在DDX3的N末端，且被假定与cIAPl相互作用，所以该区域可能负责结合cIAPl。用编码His-标记的全长DDX3、DDX3A51-662、DDX3A101-662、DDX3A151-662或DDX3A1國350的质粒转染HEK293A细胞。全长和C-末端缺失的DDX3都能共免疫沉淀cIAPl，具有前100个氨基酸缺失的DDX3不能共免疫沉淀cIAPl(图IIA)。这些结果证实，DDX3的N-末端CARD负责募集cIAPl到TRAIL-R2复合物。还表明，cIAPl结合基序位于切割位点，氨基酸129-135(DKSDEDD;SEQIDNO:46)前面的DDX3氨基酸50-100。如果在TRAIL-R2-介导的细胞凋亡过程中切割DDX3，那么与cIAPl结合的DDX3的N-末端片段会脱离TRAIL-R2复合物，从而释放cIAPl对死亡信号传导的抑制。因而，DDX3是将cIAPl和死亡受体与细胞凋亡抗性相偶联的候选物。为了进一步证实该观念，使用了缺少氨基酸1-150的显性失活突变型DDX3。该突变型DDX3ACARD(DDX3A151-662)不能与cIAPl相互作用，但是仍然能结合TRAIL-R2(图IIB)。因而，通过与野生型DDX3竟争结合TRAIL-R2，评估了DDX3A151-662是否是内源DDX3的显性阴性抑制剂。用DDX3ACARD转染了4类细胞。如图5B所示，DDX3ACARD-转染的细胞表现出比内源全长DDX3更高水平的DDX3ACARD表达，从而表明截短的DDX3能与内源DDX3竟争TRAIL-R2结合。如图11B所示，通过TRAIL-R2-co-IP和用抗-DDX3和抗-cIAPl抗体4笨测的蛋白印迹分析得知，cIAPl与全长DDX3共免疫沉淀，但是不与DDX3ACARD共免疫沉淀。而且，使用ATPLITE测定，检查了转染的细胞对TRA-8-介导的细胞凋亡的易感性。全长重组DDX3的表达没有改变对TRA-8-介导的细胞凋亡的易感性，这是因为所有测试的细胞在TRA-8处理后都保持抗性。但是，在下调与cIAPl结合的TRAIL-R2后，表达高水平的DDX3ACARD的TRA-8-抗性肺瘤细胞恢复了它们对TRA-8-诱导的细胞凋亡的易感性。这些数据表明，cIAPl对TRA-8-诱导的细胞凋亡的抑制，是由DDX3的完整CARD介导的。缺少N-末端CARD的DDX3可以用作部分地反转TRA-8抗性的显性阴性。TRAIL-R2结合的复合物上的DDX3和cIAPl的水平，都可调节癌细胞对TRA-8-诱导的细胞凋亡的潜在易感性。7TL4/丄-c"尸/!合參^伊浙應'天资^齊-S/麓活。定量化DDX3,以;险查存在于细胞中的DDX3的水平如何与胱天蛋白酶-8募集和在TRAIL-R2DISC处的加工相关联。用TRA-8处理MDA231和72UL-3C亲本和抗性细胞4小时，并用新抗-TRAIL-R2单克隆抗体(克隆2B4)免疫沉淀TRAIL-R2,所述单克隆抗体识别与TRA-8不同的TRAIL-R2表位。TRAIL-R2/DDX3/cIAPl复合物从珠释放，且使用抗-DDX3和抗-cIAPl抗体，对TRAIL-R2-结合的DDX3和cIAPl进行免疫印迹和夹心ELISA分析。给ELISA平板包被2B4抗-TRAIL-R2抗体，以捕获免疫沉淀的TRAIL-R2,并通过对DDX3(3E2)和cIAPl特异性的单克隆抗体，测量DDX3和cIAPl。用TRA-8处理亲本-敏感的或诱导的-抗性肿瘤细胞，没有改变TRAIL-R2蛋白水平(图12A)。但是，在敏感的和抗性的细胞中，TRA-8处理显著改变了TRAIL-R2-结合的DDX3水平。首先，如通过3E2抗-DDX3抗体测得的，与未处理的敏感细胞相比，未处理的抗性细胞表达更高水平的TRAIL-R2-结合的DDX3(图12B)。重要的是，TRA-8处理之后，TRA-8画抗性细胞中TRAIL-R2-结合的DDX3显著增加，但是证实了在敏感细胞中的显著降低。TRAIL-R2复合物中cIAPl的水平也以与DDX3相同的模式改变(图12C)。这些结果表明，在细胞凋亡过程中，通过切割，从TRA-8-敏感的细胞中的TRAIL-R2复合物释放出DDX3的CARD结构域，然而与敏感细胞相比，TRA-8刺激后，抗性细胞中的DDX3和cIAPl确实被更有效地募集到TRAIL-R2。为了形成有功能的DISC，癌细胞必须从TRAIL-R2复合物中释放出cIAPl，以减少TRA-8-诱导的细胞凋亡过程中它对胱天蛋白酶的抑制。该过程需要切割DDX3,从而表明该步骤对起始前馈细胞凋亡放大环是重要的。因为TRAIL-R2-结合的DDX3对切割的抗性与抗性细胞中不能形成DISC有关，所以亲本和抗性细胞之间在TRAIL-R2-DDX3-cIAPl复合物处的DDX3切割易感性是不同的。在2种细胞中，分析了不同胱天蛋白酶的TRAIL-R2-结合的DDX3切割潜力。用抗-TRAIL-R2抗体共免疫沉淀TRAIL-R2-DDX3-cIAPl复合物。将从5朱洗脱的级分与有活性的胱天蛋白酶-2和-8温育。通过用抗-DDX3抗体进行蛋白印迹分析，4企测DDX3的切割。这些结果以及ELISA分析(图12E)证实，与敏感细胞相比，抗性细胞中胱天蛋白酶-8对DDX3的切割高度减弱，尽管胱天蛋白酶-2在两种细胞中表现出类似的蛋白酶潜力(图12E)。这些结果表明，TRA-8-敏感的和-抗性的细胞之间，DDX3复合物存在功能差异。也表明，死亡受体-结合的初始胱天蛋白酶切割DDX3的失败，是形成TRA-8抗性的关键步骤。由于在诱导的抗性细胞中抑制了DDX3的切割，所以促进了确定细胞凋亡信号传导步骤的研究，在该步骤中，DDX3抑制TRAIL-R2-介导的细胞凋亡。预测DDX3/cIAPl复合物抑制胱天蛋白酶-8激活；因此，检查了TRAIL-R2-DDX3-cIAPl复合物中胱天蛋白酶-8的激活，作为受体触发后首先检测的事件之一。为了评估TRAIL-R2-DDX3-cIAPl复合物对胱天蛋白酶-8激活的作用，使用焚光底物Ac-IETD-AMC测量胱天蛋白酶活性，与有活性的胱天蛋白酶-8和来自亲本敏感的或诱导的抗性细胞的DDX3co-IP洗脱级分温育。与壽文感细胞相比，在来自抗性细胞的TRAIL-R2co-IP洗脱级分中，在广范围的稀度中，观察到胱天蛋白酶-8活性的剂量-依赖性的抑制。另外，纯化的cIAPl也完全阻抑胱天蛋白酶-8蛋白酶活性(图12F)。似乎可能的是，DDX3-结合的cIAPl是起始激活胱天蛋白酶-8的抑制剂，从而阻止DDX3的切割。因而，这些数据提供了直接证据，其证实DDX3-cIAPl可以调节胱天蛋白酶-8活性，并表明，DDX3-cIAPl是TRAIL-R2结合的胱天蛋白酶-8的特异性调节剂。通过cIAPl-抑制的胱天蛋白酶-8的直接分析以及胱天蛋白酶对DDX3的切割测定，检查了TRAIL-R2-DDX3-cIAPl对胱天蛋白酶-8激活的作用，并表明，DDX3-cIAPl也起新类型的胱天蛋白酶抑制剂的作用。DDX3-cIAPl复合物能通过阻抑胱天蛋白酶-8的激活，从而抑制起始胱天蛋白酶对TRAIL-R2-结合的DDX3的切割，停滞死亡受体促细胞凋亡信号。该模型表明，DDX3通过募集cIAPl保护细胞免于TRA-8-诱导的细胞凋亡，并有助于阻断癌细胞中的死亡信号传导途径。实施例3:N-末端区域丝氨酸磷酸化对结合DR5的DDX3的调下生物信息学研究导致了DDX3中富含丝氨酸结构域(SEQIDNO:20，对应于SEQIDNO:26的氨基酸70-90)的鉴别，该结构域对于GSK3的潜在底物是保守的(图13A)。与(3-联蛋白和糖原合成酶(它们是GSK-3的2种最佳底物)相比，DDX3在预处理(primed)位点的N-末端具有5个连续丝氨酸。有几个系列的证据证实，DDX3是GSK3的底物(1)DDX3和GSK3a的共免疫沉淀证实，DDX3与GSK3a直接结合，且GSK3能磷酸化DDX3(图13B);(2)GSK3不能磷酸化在Ser90处具有点突变的DDX3(图13C);(3)Ser90突变型DDX3在TRA-8-介导的细胞凋亡过程中表现出增加的从DR5解离和切割(图13D)。这些结果表明，在DDX3的N-末端的富含丝氨酸结构域在DDX3与DR5的结合中起调节作用。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有公开的方法和组合物所属领域的技术人员通常理解的含义。尽管与本文所述类似或等同的任意方法和材料都可以用于实现或测试本方法和组合物，但描述了特别有用的方法、装置和材料。本文引用的出版物和它们引用的材料特别地在本文中引作参考。本文的任何内容都不应当理解为，承认本发明不能通过在先发明而早于所述公开内容。没有承认任何参考文献构成
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。讨论参考文献说明了它们的作者的观点，且申请人保留质询引用的文献的准确度和相关性的权力。应当清楚地理解，尽管在本文中提及许多出版物，但这样的参考文献不构成承i人，任意这样的文件构成本领域的/>知一i&知识的部分。在说明书和本说明书的权利要求书中，词语"包含"和该词语的变体指"包括但不限于"，且无意排除例如其它添加成分、组分、整数或步骤。本领域技术人员将认识到或能使用仅仅常规试验来确定，本文所述方法和组合物的特定实施方案的许多等同方案。这样的等同发案意欲包含在所附权利要求书内。参考文献Akao,Y.,YosMda，H.，Mats咖oto,K,Matsui,T.，Hogetu,K.，T幼aka，N.，andUsukura，了，(2003).Atumour-associatedDEAD-boxprotein,rck/p54exhibitsRN人unwindingac-tivitytowardc-mycRNAsww7ro.GenesCells8,671-676.Atoemri，E.S,,D丄Livingston,D.W.Nicholson,G.Salvesen，N.A.Thornberry，W.W."Wong,andJ.Yuan.1996.HumanICE/CED-3proteasenomenclature.Cell87:171,Andrejeva，J.，Childs,K.S.,Young,D,F.,Carlos,T.S.,Stock,N.，Goodboum,S.，andRandall,R.E.(2004).TheVproteinsofparamyxovirusesbindtheIFN-inducibleJRNAMicase，mda-5,andinhibititsactivationoftheIFN-betapromoter.ProcNatlAcadSciUSA101，17264-17269.Ashhab，Y.,A.Alian,A.Polliack,A.Panet，andD.BenYehuda.2001,Twosplicingvariantsofanewinhibitorofapoptosisgenewithdifferentbiologicalpropertiesandtissuedistributionpattern.FEBSLett495:56-60.75Ashkenazi，A，Pai,RC，Fong,S，Leung,S,Lawrence,DA，Marsters,SA，Blackie，C:Chang,L，McMurtrcy,Ae，Hebert,入DeForge'L，Ko咖enis,IL，Lewis,D，Hanis,L,Bussiere,J,Koeppen，H，Shahrokh,Z,andSchwall,RHSafetyandantitumoractivityofrecombinantsolubleApo2ligand.JClinInvestl卿；104:155-162.Baldwin^A.S.2001.ControlofoncogenesisandcancertherapyresistancebythetranscriptionfactorNF-kappaB.JClinInvest107:241-246.Baldwin,A.S.,Jr.1996.TheNF-kappaBandIkappaBproteins:newdiscoveriesandinsights.AnnuRevImmunol14:849-683.Belka，C.，B.Schmid，P.Marini,E,Durand^J.Rudner，H,Faltin，M.B咖berg，K.Schulze-Osthoff，andW.Budach.2001.Sensitizationofresistantlymphomacellstoirradiation-inducedapoptosisbythedeathligandTRAIL.Oncogene20:2190-2196.Bockbrader,K.M.，T叫M.,andS叫Y.(2005).AsmallmoleculeSmac-mimiccompoundinducesapoptosisandsensitizesTRAIL-andetoposide-inducedapoptosisinbreastcancercells.Oncogene,Bodmer,JX,,N.Holler,S.Reynard,P.Vinciguena,P.Schneider,P.Juo，J.Blenis，andJ.Tschopp.2000.TRAILreceptor-2signalsapoptosisthroughFADDandcaspase-8.NatCellBiol2:241-243.Boldin，M.P.,E.E.Varfolomeev,Z.Pancer,I丄.Mett，J.H.Camonis,andD.Wallach.1995.AnovelproteinthatinteractswiththedeathdomainofFas/APOlcontainsasequencemotifrelatedtothedeathdomain.JBiolChem270:7795-7798.Boldin,M.P.,T.M.Goncharov,Y.V.Goltsev,andD.Wallach.1996,InvolvementofMACH,anovelMORTl/FADD-interactingprotease,inFas/APO-l-andTNFreceptor-inducedcelldeath.Cell85:803-815.Bonavida，B,Ng,CP,Jazirehi,A,Schiller,G，andMizuteni,YSelectivityofTRAIL-mediatedapoptosisofcancercellsandsynergywithdrugs:thetrailtonon-toxiccancertherapeutics(review).IntJOncol1999;15:793-802.Buchsbaum,D,J"Zhou>T.，Grizzle,W.E.，Oliver,P.G.，Hammond,C.J"Zhang,S.,Carpenter,M.,andLoBuglio，A.R(2003).Antitumore伍cacyofTRA-8anti-DR5monoclonalantibodyaloneorincombinationwithchemotherapyand/orradiationther-apyinahumanbreastcancermodel.ClinCancerRes9,3731-3741.Budihardjo,I"H.Oliver,M.L加er，X.Luo,andX.Wang.1999.Biochemicalpathwaysofcaspaseactivationduringapoptosis.AtmuRevCellDevBiol15:269-29&Carthy,CM,Yanagawa,B,Luo，H，Granville,DJ，Yang,D，Cheung,P，Cheung,C,Esfandiarei，M，Rudin,CM,Thompson,CB,Hunt,DW,andMcManus,BMBcl-2andBcl-xLoverexpressioninhibitscytochromecrelease,activationofmultiplecaspases,andvirusreleasefollowingcoxsackievirusB3infection.Virology2003;313:147-157Causevic,M"R.G;Hislop，N.M.Kernoliaii,F.A.Carey,R.A.Kay，R丄Steele,andF.V.Fuller-Pace.2001.Overexpressionandpoly-ubiquitylationoftheDEAD-boxRNAhelicasep68incolorectaltumours.Oncogene20:7734-7743.Chang,H.Y.,H.Nishitoh，X.Yang,H.Ichijo，andD.Baltimore.1998.Activationofapoptosissignal-regulatingkinase1(ASK!)bytheadapterproteinDaxx.Science281:1860-1863.Chaudhary,P.M.,M.Eby,A.Jasmin,A.Bookwalter,J.Murray,andL.Hood.1997.Deathreceptor5,anewmemberoftheTNFRfamily,andf)R4induceFADD-dependentapoptosisandactivatetheNF-kappaBpathway.Immunity7:821-830.Chawla-Sarkai，M,Bae,SI,Reu,FJ,Jacobs,BS,Lindner,DJ,andBorden,ECDownreguktionofBcl-2，FLIPorIAPs(XIAPandsurvivin)bysiRNAssensitizesresistantmelanomacellstoApo2L/TRAlL-inducedapoptosis.CellDeathDiffer2004;11:915-923Chen,C.,L.C.Edelstein,andC.Gelinas.2000.TheRel/NF-kappaBfamilydirectlyactivatesexpressionoftheapoptosisinhibitorBcl-x(L).MolCellBiol20:2687-2695.Chinnaiyan,A.M.，K.O'Rourke,M.Tewari,andV.M.Dixit.1995.FADD,anoveldeathdomain-containingprotein,interactswiththedeathdomainofFasandinitiatesapoptosis.Cell81:505-512,Chinnaiy叫AM,Prasad^U,Shankar,S,H咖stra,DA,Shanaiah,M,Ch咖vert,TL,Ross,BD，andRehemtulla^ACombinedeffectoftumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingligaudandionizingradiationinbreastcancertherapy.ProcNatlAcadSciUSA2000;97:1754-1759.Crook，N.E.，R.J,ClenijandL,K.Miller.1993.Anapoptosis-inhibitbgbaculovirusgenewithazincfinger-likemotif.JVirol67:2168-2174.Cuello，M,Bttenberg,SA,Nau,MM,andLipkowitz，SSynergisticinductionofapoptosisbythecombinationoftrailandchemotherapyinchemoresistantovarianc咖a:cells.GynecolOncol2001;81:380-390.Cummins,JM,Kohli，M，Rago，C,Kinzler,KW，Vogelstein,B，andBunz,FX-linkedinhibitorofapoptosisprotein(XIAP)isanonredundantmodulatoroftumornecrosisfactor-relatedapoptosis-inducingl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述细胞是体内的。42.权利要求28的方法，其中所述耙细胞是癌细胞、类风湿性关节炎滑膜细胞、活化的淋巴细胞或病毒感染的细胞。43.治疗患有癌症的受试者的方法，其包含，给所述受试者施用治疗量的(a)死亡受体激动剂，和(b)含有CARD的蛋白的一种或多种活性的调节剂，其中所述调节剂降低对死亡受体激动剂的抗性。44.治疗患有炎性疾病或自身免疫病的受试者的方法，其包含，给所述受试者施用治疗量的(a)死亡受体激动剂，和(b)调节含有CARD的蛋白的一种或多种活性的试剂，其中所述调节剂降低对死亡受体激动剂的抗性。45.权利要求43或44的方法，其中所述激动剂选自DR5抗体、DR4抗体和TRAIL。46.权利要求43或44的方法，其中所述死亡受体是Fas、TNFR1或TRAIL受体。47.权利要求46的方法，其中所述TRAIL受体选自DR4和DR5。48.权利要求43或44的方法，其中所述调节剂是激酶抑制剂、DDX3切割的促进剂、IAP的抑制剂或DDX3表达的抑制剂(RNAi)。49.权利要求48的方法，其中所述DDX3表达的抑制剂是RNAi、siRNA或shRNA。50.权利要求43或44的方法，其中所述含有CARD的蛋白选自DDX3、mda-5和RIG匿1。51.权利要求43或44的方法，其中所述含有CARD的蛋白是其氨基酸序列与DDX3、mda-5和RIG-l具有至少85%同源性的多肽。52.权利要求43或44的方法，其中所述调节剂抑制含有CARD的蛋白与死亡受体的结合。53.权利要求43或44的方法，其中所述调节剂增加或降低含有CARD的蛋白与胱天蛋白酶或胱天蛋白酶的调节剂(IAP)的结合。54.权利要求53的方法，其中所述胱天蛋白酶是胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-4或胱天蛋白酶-5。55.权利要求53的方法，其中所述胱天蛋白酶的调节剂是选自cIAPl、cIAP2、XIAP和存活蛋白的IAP。56.权利要求43或44的方法，其中所述细胞是体外的。57.权利要求43或44的方法，其中所述细胞是体内的。58.权利要求43或44的方法，还包含，施用选自下述的治疗剂化疗剂、抗体、TNF家族成员、抗病毒剂、抗炎剂、抗机会试剂、抗生素、免疫抑制剂、免疫球蛋白、抗疟疾剂、抗类风湿性关节炎剂、细胞因子、趋化因子和生长因子。59.—种组合物，其包含(a)死亡受体激动剂，和(b)调节含有CARD的蛋白的一种或多种活性的试剂，其中所述调节剂降低对死亡受体激动剂的抗性。60.权利要求59的组合物，其中所述激动剂选自DR5抗体、DR4抗体和TRAIL。61.权利要求59的组合物，其中所述死亡受体是Fas、TNFR1或TRAIL受体。62.权利要求61的组合物，其中所述TRAIL受体选自DR4和DR5。63.权利要求59的组合物，其中所述调节剂是激酶抑制剂、DDX3切割的促进剂、CARD依赖性结合的抑制剂、IAP的抑制剂或DDX3表达的抑制剂。64.权利要求59的组合物，其中所述DDX3表达的抑制剂是RNAi、siRNA或shRNA。65.权利要求59的组合物，其中所述含有CARD的蛋白选自DDX3、mda-5和RIG陽1。66.权利要求59的组合物，其中所述含有CARD的蛋白是其氨基酸序列与DDX3、mda-5和RIG-1具有至少85%同源性的多肽。67.权利要求59的组合物，其中所述调节剂抑制含有CARD的蛋白与死亡受体的结合。68.权利要求59的组合物，其中所述调节剂增加或降低含有CARD的蛋白与胱天蛋白酶或胱天蛋白酶的调节剂(IAP)的结合。69.权利要求68的组合物，其中所述胱天蛋白酶是胱天蛋白酶-1、胱天蛋白酶-2、胱天蛋白酶-4或胱天蛋白酶-5。70.权利要求68的组合物，其中所述胱天蛋白酶的调节剂是选自cIAPl、cIAP2、XIAP和存活蛋白的IAP。71.权利要求59的组合物，还包含选自下述的治疗剂化疗剂、TNF超家族成员、抗病毒剂、抗炎剂、抗才几会试剂、抗生素、免疫抑制剂、免疫球蛋白、抗疟疾剂、抗类风湿性关节炎剂、细胞因子、趋化因子和生长因子。72.权利要求59的组合物，还包含药学上可接受的载体。73.包含短发夹RNA(shRNA)的分离的核酸，其中所述shRNA抑制含有CARD的蛋白的表达。74.权利要求73的分离的核酸，其中所述含有CARD的蛋白选自DDX3、mda隱5和RIG-1。75.权利要求73的分离的核酸，其中所述含有CARD的蛋白是其氨基酸序列与DDX3、mda-5和RIG-1具有至少85%同源性的多肽。76.权利要求73的分离的核酸，其中所述RNAi是包含核酸序列SEQIDNO:1、2、3或4的短发夹RNA(shRNA)。77.包含权利要求73的核酸的载体，所述核酸可#:作地连接到表达控制序列上。78.包含权利要求77的载体的细胞。79.分离的多肽，其编码死亡受体的存活区域，其中所述多肽包含少于25个氨基酸残基。80.权利要求79的分离的多肽，其中所述死亡受体是Fas、TNFRl或TRAIL受体。81.权利要求80的分离的多肽，其中所述TRAIL受体选自DR4和DR5。82.权利要求79的分离的多肽，其中所述存活结构域是含有CARD的蛋白结合结构域。83.权利要求82的分离的多肽，其中所述死亡受体选自DR5的DDX3结合结构域和DR4的DDX3结合结构域。84.阻断含有CARD的蛋白结合细胞中的死亡受体的方法，其包含，使细胞接触权利要求79的多肽或它的阻断结合的片段。85.反转细胞对细胞中死亡受体激动剂的抗性的方法，其包含，使细胞接触权利要求79的多肽。86.分离的多肽，其包含含有CARD的蛋白的死亡受体结合结构域。87.权利要求86的分离的多肽，其中所述含有CARD的蛋白选自DDX3、mda-5和RIG-1。88.权利要求86的分离的多肽，其中所述含有CARD的蛋白是其氨基酸序列与DDX3、mda-5和RIG-1具有至少85%同源性的多肽。89.权利要求86的分离的多肽，其中所述多肽不结合胱天蛋白酶或IAP，其中所述多肽阻断IAP与死亡受体的结合，且其中所述多肽不阻止FADD与死亡受体的结合。90.阻断IAP与死亡受体的结合的方法，其包含，使细胞接触权利要求86的多肽。91.反转细胞对死亡受体激动剂的抗性的方法，其包含，使细胞接触权利要求86的多肽。92.筛选含有CARD的蛋白的调节剂的方法，其中所述调节剂反转或阻止靶细胞对死亡受体激动剂的抗性，其包含a.使候选试剂接触含有CARD的蛋白，和b.检测与没有候选试剂存在时相比，有候选试剂存在时含有CARD的蛋白的一种或多种活性的降低，其中所述一种或多种活性与耙细胞对死亡受体激动剂的抗性相关写关，含有CARD的蛋白的一种或多种活性的降低，指示着候选试剂调节含有CARD的蛋白。93.权利要求92的方法，其中所述含有CARD的蛋白是在细胞中的，其中所述细胞另外接触死亡受体激动剂一次或多次，并且其中4全测对死亡受体激动剂抗性的水平。94.斥又利要求93的方法，其中通过测量细l包凋亡，4企测对死亡受体激动剂抗性的水平。全文摘要本文提供了反转或阻止靶细胞对死亡受体激动剂的抗性的方法。也提供了筛选死亡受体激动剂的生物标记抗性的方法，和监控对死亡受体激动剂的抗性的方法。也提供了选择性地诱导靶细胞的细胞凋亡、治疗患有癌症、自身免疫病或炎性疾病的受试者的方法，其包含，施用本文提供的组合物。还提供了组合物，其包含调节含有CARD的蛋白的试剂。文档编号C12Q1/00GK101495646SQ200680010114公开日2009年7月29日申请日期2006年1月31日优先权日2005年2月2日发明者R·P·金伯利,T·周申请人:Uab研究基金会