一类新型epsp合酶的鉴定的制作方法

专利名称：：一类新型epsp合酶的鉴定的制作方法
技术领域：
：本发明涉及植物分子生物学，特别是涉及一类赋予除草剂草甘膦抗性的新型EPSP合酶。
背景技术：
：N-膦酰甲基甘氨酸通常称作草甘膦，是一种重要的农艺学化学试剂。草甘膦抑制将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酸莽草酸(S3P)转化成5-烯醇丙酮基-3-磷酸莽草酸的酶。该酶(5-烯醇丙酮基莽草酸-3-磷酸合酶，在这里称为"EPSP合酶"或"EPSPS")的抑制通过阻断莽草酸途径来杀死植物细胞，从而抑制了芳族氨基酸的生物合成。由于草甘膦-类型的除草剂抑制了芳族氨基酸的生物合成，它们不仅杀死植物细胞，而且还对细菌细胞有毒性。草甘膦抑制许多细菌的EPSP合酶，并因此对这些细菌有毒性。然而，一些细菌的EPSP合酶具有高的草甘膦耐受性。抗草甘膦毒性的植物细胞可通过转化植物细胞来表达抗草甘膦的细菌EPSP合酶来产生。值得注意的是，来自根瘤农杆菌(J^ro6acter/u迈"/z7e尸ac/e力s)菌林CP4的细菌基因已用于在植物中表达之后赋予植物细胞除草剂抗性。一种来自鼠伤寒沙门菌(^/迈o/3e"aOT^y迈un'咖)菌林CT7的突变型EPSP合酶赋予了细菌细胞草甘膦抗性，并赋予了植物细胞草甘膦抗性(美国专利Nos.4,535,060、4，769，061和5，094，945)。EPSP合酶(Mr46,000)折叠成两个相似的结构域，每个结构域包含3个拷贝的Papa(3p-折叠单位(Stallings等，(1991)/Voc.Jc".5W.885046-5050)。Lys-22、Arg-124、Asp-313、Arg-344、Arg-386和Lys-411是来自大肠杆菌(Acoh')的EPSP合酶的保守残基(Sch6nbrunn爭，(2001)尸roc.Wa〃.Jcsd.Sc/.98:1376-1380)。对EPSPS活性重要的保守残基还包括Arg-lOO、Asp-242和Asp-384(Selvapandiyan等，(1995)FfAyZe〃ers374:253-256)。Arg-27与S3P结合(Shuttleworth爭，(1999)5/oc/e/z7/WiT38:296-302)。已经分离了野生型EPSPS酶的变体，这些变体由于EPSPS氨基酸编码序列的改变而是草甘膦-耐受性的(Kishore和Shah(1988)J應.胁.WocAe/w.57:627-63;Wang爭，(2003)/.尸/a/^Aes.116:455-60;Eschenburg等，(2002)尸/a/2"216:129-35)。He等(2001，肠c力/迈"A/一戸'caJc"1568:l-6)已经通过大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌EPSPS基因之间的突变发生和重组，研发出了具有增强的草甘膦耐受性的EPSP合酶，并提出在位置42(T42M)和位置230(Q230K)处的突变很可能是造成观察到的抗性的原因。随后的研究(He爭(2003)"/o"c力.万/oc力e瓜67:1405-1409)显示，T42M突变(苏氨酸突变为甲硫氨酸)足以提高大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌酶两者的耐受性。由于除草剂耐受性植物提供了许多有利方面，用于鉴定具有抗草甘膦活性的抗除草剂基因的方法是期望的。发明概述提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子草甘膦耐受性的组合物和方法。所述组合物包含一类称为III型的新型EPSPS酶，和编码该酶的多核苷酸、含有那些多核苷酸的载体，以及含有该载体的宿主细胞。这种新的蛋白质含有至少一个选自下列结构域(III型结构域)的序列结构域结构域I:L-A--G-X「S-X广L-X3-G-4-L-K-S-D-D-I(SEQIDNO:13)，其中X)表示赖氨酸或苏氨酸，其中X2表示精氨酸或组氨酸，其中X3表示丝氨酸或苏氨酸；结构域la:L-A-K-G-X!,(SEQIDNo:14)，其中X!表示赖氨酸或苏氨酸；结构域lb:S-XrL-X2(SEQIDNO:15)，其中X!表示精氨酸或组氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸；结构域Ic:G-A-L-K-S-D-D-T(SEQIDNO:16);结构域II:E-E-D-X广X广];一Z-X3-V—XrX5—X6-G(SEQIDNO:17)，其中X)表示天冬氨酸或丙氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸，其中X3表示缬氨酸或异亮氨酸，其中X4表示苏氨酸或谷氨酸或赖氨酸，其中Xs表示丝氨酸或甘氨酸，其中X6表示谷氨酰胺或丝氨酸或谷氨酸或苏氨酸；结构域IIa:E-E-D-X广X广I"f-X3-V(SEQIDNO:18),其中X,表示天冬氨酸或丙氨酸，其中X,表示丝氨酸或苏氨酸，其中X3表示缬氨酸或异亮氨酸；结构域lib:X广X广XfG(SEQIDNO:19),其中X!表示苏氨酸或谷氨酸或赖氨酸，其中X2表示丝氨酸或甘氨酸，其中X3表示谷氨酰胺或丝氨酸或谷氨酸或苏氨酸；结构域III:旱TAA(SEQIDNO:20);结构域IV:KWI(G/M)E(SEQIDNO:21)K-i-P-I-X,-P，其中X!表示甘氨酸或甲硫氨酸或亮氨酸；结构域V:X广G-C-P-P-V(SEQIDNO:22)，其中t表示苏氨酸或丝氨酸；结构域VI:I-&-A-X「g-Y-X广D-L-T(SEQIDNO:23),其中表示精氨酸或赖氨酸或亮氨酸，并且其中X2表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域VII:W-X「V-X2-X3-T-G(SEQIDNO:24)，其中X!表示精氨酸或赖氨酸，其中X2表示丙氨酸或组氨酸或谷氨酸或丝氨酸，其中X3表示脯氨酸或丙氨酸；结构域VIII:E-P-Z^A-S-A-A-T—Y-L-W-X广A-X广X广L(SEQIDNO:25)，其中X,表示丙氨酸或甘氨酸，其中X2表示谷氨酸或谷氨酰胺，其中X3表示缬氨酸或亮氨酸或丙氨酸；结构域Villa:E-P-/HV-S-A-A-T-Y-L-W(SEQIDNO:26);结构域IX:I-D-X广Q(SEQIDNO:27)，其中X!表示异亮氨酸或亮氨酸；结构域X:F-X广Q-P-D-A-K-A(SEQIDNO:28)，其中X!表示苏氨酸或丝氨酸；结构域XI:X广E-g-X2-X3-X4-A-X5-X6-X7—G-^-Q-M-Q-D-A-I-P-T-Xs-A—V-X^—A-F-I^SEQIDNO:29)，其中X!表示谷氨酰胺或赖氨酸或丝氨酸，其中X2表示天冬酰胺或组氨酸，其中X3表示甲硫氨酸或亮氨酸，其中L表示脯氨酸或谷氨酰胺，其中Xs表示苏氨酸或谷氨酸或缬氨酸，其中X6表示缬氨酸或异亮氨酸，其中X7表示天冬氨酸或缬氨酸，其中Xs表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X,表示亮氨酸或异亮氨酸；结构域XIa:X广F-旦-X广X3-X广A(SEQIDNO:30)，其中X!表示谷氨酰胺或赖氨酸或丝氨酸，其中X2表示天冬酰胺或组氨酸，其中X3表示甲硫氨酸或亮氨酸，其中1表示脯氨酸或谷氨酰胺；结构域XIb:X「X2-X「G-H-M-Q-D+I-P-T-X4+V-X5A-A-F-]i(SEQIDNO:31)，其中X,表示苏氨酸或谷氨酸或缬氨酸，其中X2指缬氨酸或异亮氨酸，其中X3指天冬氨酸或缬氨酸，其中X4指亮氨酸或异亮氨酸，其中X5指亮氨酸或异亮氨酸；结构域XIc:G-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T(SEQIDNO:32);结构域XII:P-X-R-E一X广X2-X「X4-N-L-R-V-K-E-g-D-A-X5(SEQIDNO:33)，其中X:表示缬氨酸或苏氨酸，其中X2表示谷氨酸或甘氨酸，其中X3表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X4表示丙氨酸或谷氨酸，其中X5表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域XIIa:P-X+E(SEQIDNO:34);结构域XIIb:X广X广X3-XrN-L-R-V-K-E-g-D-H5(SEQIDN0:35)，其中X!表示缬氨酸或苏氨酸，其中X2表示谷氨酸或甘氨酸，其中X3表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X4表示丙氨酸或谷氨酸，其中X5表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域XIIc:N-L-R-V-K-E-g-D-y(SEQIDNO:36);结构域XIII:E-G-D-D-L-X广X2(SEQIDNO:37)，其中X!表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X2表示缬氨酸或异亮氨酸；结构域XIV:X「P-X「L-A-G(SEQIDNO:38)，其中t表示天冬氨酸或天冬酰胺，其中L表示丙氨酸或丝氨酸或苏氨酸；结构域XV:A-X广I-D-X「X3-Xr"+W(SEQIDNO:39)，其中Xi表示亮氨酸或丝氨酸或谷氨酸，其中L表示苏氨酸或丝氨酸，其中X3表示组氨酸或苯基丙氨酸，其中X,表示丙氨酸或丝氨酸；结构域XVI:F-A-L-A-X广L-]^-X2-X3-G-I(SEQIDNO:40)，其中X!表示甘氨酸或丙氨酸，其中X2表示异亮氨酸或缬氨酸，其中X3表示丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸或赖氨酸；结构域XVIa:F-A-L-A-X广L-E(SEQIDNO:41)其中X！表示甘氨酸或丙氨酸；结构域XVIb:LHX2-G-I(SEQIDNO:42)，其中Xi表示异亮氨酸或缬氨酸，其中X2表示丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸或赖氨酸；以及结构域XVII:-XrP-X2-C-V-X3-r(SEQIDNO:43)，其中X!表示天冬酰胺或天冬氨酸，其中X2表示丙氨酸或天冬氨酸，其中X3表示丙氨酸或甘氨酸。结构域XVIII:XrS-L-G-V(SEQIDNO:44),其中X!表示丙氨酸或丝氨酸或脯氨酸。SEQIDN0S:13-44中列出的上述结构域通过比对具有至少50%的序列同一性的III型序列而确定。至少一种这些序列结构域的存在预示着抗草甘膦活性。提供了对应赋予除草剂抗性的核酸序列的分离的核酸分子。另外，也包含了对应所述多核苷酸的氨基酸序列。特别地，本发明提供了含有III型结构域的分离的核酸分子，包括在SEQIDNO:9、11、55、57和58中列出的核苷酸序列、编码在SEQIDNO:10、12、56和59中显示的氨基酸序列的核苷酸序列、保藏于登记号为B-30833和B-30838的细菌宿主中的抗除草剂的核苷酸序列，以及它们的变体和片段。与本发明的核苷酸序列互补的核苷酸序列，或者与本发明的序列杂交的核苷酸序列也包括在内。这些序列可用于构建用于随后转化进目标植物的表达栽体，用作用于分离其它草甘膦抗性基因的探针，用作选择标记等。组合物还包含所述多肽的抗体以及编码抗除草剂多肽的合成多核苷酸。所述编码序列可用于在生物体，包括微生物和植物中转化并表达的DNA构建体或表达盒。组合物也包含转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子，它们通过将本发明的组合物引入生物体的基因组中而是草甘膦耐受性的。如果生物体是一种植物，则该序列的引入使得能将含有草甘膦的除草剂施用至作物来选择性杀死草甘膦敏感的杂草，而不会杀死转化的生物体。另外提供了用于鉴定具有抗草甘膦活性的EPSP合酶的方法。该方法包括，获得EPSP合酶的氨基酸序列，以及确定所述氨基酸序列是否含有至少一种本发明的序列结构域。在此描述的EPSP合酶代表一类新型EPSPS酶，在下文中称为III型EPSPS酶。附图描述图l显示了EPSP合酶氨基酸序列的比对。已确定为对底物结合和EPSPS活性重要的保守残基用方框标出。方框描绘了III型结构域的氨基酸位置。方框上方的罗马数字与III型结构域对应。发明详述本发明涉及用于赋予生物体除草剂耐受性，特别是草甘膦耐受性的组合物和方法。该方法涉及用编码本发明的ni型草甘膦耐性基因的核苷酸序列来转化生物体。特别的，本发明识别一种类型的赋予草甘膦耐受性的酶，以及编码这种酶的核苷酸序列。该序列可用于制备显示增加的除草剂草甘膦耐受性的植物。因此，提供了转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。III型酶特征为具有至少一种选自下面列出的结构域的结构域，在这里称之为III型结构域结构域I:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>SEQIDNO:13)，其中X,表示赖氨酸或苏氨酸，其中X2表示精氨酸或组氨酸，其中X3表示丝氨酸或苏氨酸；结构域la:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>(SEQIDNo:14)，其中Xi表示赖氨酸或苏氨酸；结构域lb:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>(SEQIDNO:15)，其中X,表示精氨酸或组氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸；结构域Ic:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>(SEQIDNO:16);结构域II:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>(SEQIDNO:17),其中X!表示天冬氨酸或丙氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸，其中X3表示缬氨酸或异亮氨酸，其中X,表示苏氨酸或谷氨酸或赖氨酸，其中Xs表示丝氨酸或甘氨酸，其中Xe表示谷氨酰胺或丝氨酸或谷氨酸或苏氨酸；结构域IIa:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>(SEQIDNO:18)，其中X表示天冬氨酸或丙氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸，其中X3表示缬氨酸或异亮氨酸；结构域lib:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>(SEQIDNO:19)，其中X!表示苏氨酸或谷氨酸或赖氨酸，其中X:表示丝氨酸或甘氨酸，其中X3表示谷氨酰胺或丝氨酸或谷氨酸或苏氨酸；结构域III:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>TAA,IDNO:20);结构域IV:<formula>formulaseeoriginaldocumentpage25</formula>(SEQIDNO:21)K-A-P-I-XHP，其中Xi表示甘氨酸或甲硫氨酸或亮氨酸；结构域V:Xf-G-C-P-P-V(SEQIDNO:22)，其中X!表示苏氨酸或丝氨酸；结构域VI:I-^A-Xf^Y-X^D-L-T(SEQIDNO:23)，其中X,表示精氨酸或赖氨酸或亮氨酸，并且其中X2表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域VII:W-X广V-X广X广T-G(SEQIDNO:24)，其中Xi表示精氨酸或赖氨酸,其中X2表示丙氨酸或组氛酸或谷氨酸或丝氨酸，其中X3表示脯氨酸或丙氨酸；结构域VIII:E-P-Z"A-S-A-A-T—Y-L-W-X广A-X厂X广L(SEQIDNO:25)，其中Xi表示丙氨酸或甘氨酸，其中X2表示谷氨酸或谷氨酰胺，其中X3表示缬氨酸或亮氨酸或丙氨酸；结构域Villa:E-P-Z"A-S-A-A-T-Y-L-W(SEQIDNO:26);结构域IX:I-D-X广g(SEQIDNO:27)，其中X!表示异亮氨酸或亮氨酸；结构域X:F-X「Q-P-D-A-K-A(SEQIDNO:28),其中X!表示苏氨酸或丝氨酸；结构域XI:X广^f-X广X厂XrA-X「X6-X7-G-g-Q-M-Q-D-A-I-P-T-X「A-V-X9A-A-F-]i(SEQIDNO:29)，其中X!表示谷氨酰胺或赖氨酸或丝氨酸，其中X2表示天冬酰胺或组氨酸，其中L表示甲疏氨酸或亮氨酸，其中L表示脯氨酸或谷氨酰胺，其中Xs表示苏氨酸或谷氨酸或缬氨酸，其中X6表示缬氨酸或异亮氨酸，其中X7表示天冬氨酸或缬氨酸，其中Xs表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X,表示亮氨酸或异亮氨酸；结构域XIa:X「^f-X广XfX广A(SEQIDNO:30)，其中Xi表示谷氨酰胺或赖氨酸或丝氨酸，其中X2表示天冬酰胺或组氨酸，其中X3表示甲硫氨酸或亮氨酸，其中L表示脯氨酸或谷氨酰胺；结构域XIb:X「X2-X3-G-g-Q-M-Q-D-A-I-P-T-X4-A-V-X5A-A-F-;^(SEQIDNO:31)，其中X!表示苏氨酸或谷氨酸或缬氨酸，其中X2指缬氨酸或异亮氨酸，其中Xs指天冬氨酸或缬氨酸，其中X4指亮氨酸或异亮氨酸，其中Xs指亮氨酸或异亮氨酸；结构域XIc:G-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T(SEQIDNO:32);结构域XII:P-X-R-E-X「X广X3-XrN-L-R-V-K-E-g-D-W-X5(SEQIDNO:33)，其中X,表示缬氨酸或苏氨酸，其中X2表示谷氨酸或甘氨酸，其中X3表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X4表示丙氨酸或谷氨酸，其中Xs表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域XIIa:P-Y+E(SEQIDNO:34);结构域XIIb:X广X2-X3-X广N-L-R-V-K-E-g-D-^X5(SEQIDNO:35)，其中表示缬氨酸或苏氨酸，其中X2表示谷氨酸或甘氨酸，其中X3表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X4表示丙氨酸或谷氨酸，其中Xs表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域XIIc:N-L-R-V-K-E-g-D-A(SEQIDNO:36);结构域XIII:E-G-D-D-L-X广X2(SEQIDNO:37)，其中X!表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X2表示缬氨酸或异亮氨酸；结构域XIV:X广P-X广L-A-G(SEQIDNO:38)，其中X,表示天冬氨酸或天冬酰胺，其中l表示丙氨酸或丝氨酸或苏氨酸；结构域XV:A-XrI-D-X广X广X广ZH7-i(SEQIDNO:39),其中X:表示亮氨酸或丝氨酸或谷氨酸，其中X2表示苏氨酸或丝氨酸，其中X3表示组氨酸或苯基丙氨酸，其中l表示丙氨酸或丝氨酸；结构域XVI:F-A-L-A-X广L--X2-X3-G-i(SEQIDN0:40)，其中X!表示甘氨酸或丙氨酸，其中X2表示异亮氨酸或缬氨酸，其中X3表示丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸或赖氨酸；结构域XVIa:F-A-L-A-X广L-^(SEQIDNO:41)，其中X:表示甘氨酸或丙氨酸;结构域XVIb:L-E-Xr"X2-G"l(SEQIDNO:42)，其中X!表示异亮氨酸或缬氨酸，其中X2表示丝氨酸或甘氨酸或丙氡酸或赖氨酸；以及结构域XVII:-X广P-X广C-V-X广J(SEQIDNO:43),其中l表示天冬酰胺或天冬氨酸，其中X2表示丙氨酸或天冬氨酸，其中X3表示丙氨酸或甘氨酸。结构域XVIII:X「S-L-G-V(SBQIDNO:44)，其中X:表示丙氨酸或丝氨酸或脯氨酸。SEQIDN0S:13-44中列出的上述结构域通过比对具有至少50%序列同一性的III型序列得以鉴定。在一些实施方案中，存在至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32个这才羊的序列结构域。采用本发明的方法以及鉴定的结构域，可以鉴定可赋予草甘膦耐受性的其它蛋白质(例如，SEQIDNO:2、4、46和48)。这些蛋白质包括已知的蛋白质以及新鉴定的蛋白质(例如，SEQIDNOS:IO、12、56和59)。"草甘膦"意指N-膦酰甲基甘氨酸(包括它的任何盐)的任何除草剂形式，以及导致植物(planta)中产生草甘膦阴离子的其它形式。"抗除草剂蛋白质"、"除草剂耐受性蛋白质"或由"除草剂抗性-"或"除草剂耐受性-"编码多核苷酸的表达产生的蛋白质包括，赋予细胞比未表达该蛋白质的细胞耐受更高浓度的除草剂的能力的蛋白质，或者赋予细胞比未表达该蛋白质的细胞更长时间耐受某种浓度的除草剂的能力的蛋白质。"抗草甘膦蛋白质"或"草甘膦耐受性蛋白质"包括，赋予细胞比未表达该蛋白质的细胞耐受更高浓度的草甘膦的能力的蛋白质，或者赋予细胞比未表达该蛋白质的细胞更长时间地耐受一定浓度的草甘膦的能力的蛋白质。"耐受"或"耐受性"意指以不容易与未经处理的细胞区分的方式存活，或行使基本的细胞功能例如蛋白质合成和呼吸。分离的多核苷酸，以及它们的变体和片段本发明的一个方面涉及不同于SEQIDN0S:1、3、7、45、47和53中列出的多核苷酸序列的分离的多核苷酸，其编码具有至少一种本发明的III型序列结构域的EPSP合酶。"不同于"意指本发明不包括在列举的SEQIDNOS中列出的多核苷酸序列。本发明的分离的多核苷酸包括，编码抗除草剂蛋白质和多肽或其生物活性部分的核苷酸序列，以及足以用作杂交探针来鉴定除草剂抗性-编码多核苷酸的多核普酸。如在此使用的，"多核苷酸"旨在包括DM分子(例如cDNA或基因组DM)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。多核苷酸可以是单链或双链腿。本发明的核苷酸序列包括特征为上面包括的结构域的那些。用于鉴定这些结构域的信息包括草甘膦-敏感性EPSPS分子的序列比对。序列比对用来确定序列间的同源区域，并用来确定是III型EPSPS酶的特征的III型结构域。所述结构域的变体也包含于本发明范围内(例如SEQIDNO:55)。200680016320.X说明书第13/50页这种变体包含具有至少90%、至少95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的序列，并包含于赋予草甘膦耐受性的DNA分子中。"分离的"或"纯化的"多核苷酸或蛋白质，或其生物活性部分基本上无其它细胞物质，或在通过重组技术生产时基本上无培养基，或者在化学合成时基本上无化学前体或其它的化学试剂。优选地，"分离的"多核苷酸不含有在该多核苷酸所源自的生物体的基因组DNA中，天然位于该多核苷酸侧翼(即，位于该多核苷酸5'和3'末端的序列)的序列(例如，蛋白质编码序列)。为了本发明的目的，"分离的"在用来指多核苷酸时不包括分离的染色体。例如，在多个实施方案中，分离的草甘膦抗性-编码多核苷酸可包含少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述的这些核苷酸序列天然位于该多核苷酸所源自的细胞的基因组DNA中的多核苷酸的侧翼。基本上无细胞物质的抗除草剂蛋白质包括具有低于约30%、20%、10%或5%(按干重计算)的非-抗除草剂蛋白质(在这里也称作"污染蛋白质")的蛋白质制剂。作为这些除草剂抗性-编码核苷酸序列的片段的多核苦酸也包含于本发明中(例如，SEQIDN0S:57、58和60)。"片段"意指编码抗除草剂蛋白质的核苷酸序列的一部分(例如SEQIDN0:59)。该核苷酸序列片段可编码抗除草剂蛋白质的生物活性部分，或者它可以是采用下面公开的方法，能够用作杂交探针或PCR引物的片段。作为抗除草剂核普酸序列的片段的多核苷酸包含至少约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950个连续核苷酸，或者达到存在于在此公开的全长除草剂抗性-编码核苷酸序列中的核普酸数。"连续"核苷酸意指彼此直接邻接的核苷酸残基。本发明核普酸序列的片段通常会含有至少一种在此描述的III型结构域，并且会编码保留全长抗草甘膦蛋白质的生物活性，即抗除草剂活性的蛋白质片段。"保留抗除草剂活性"意指该片段将会具有至少约30%、至少约50%、至少约70%或至少约80%的作为SEQIDNO:6在此公开的全长抗草甘膦蛋白质的抗除草剂活性。用于测量抗除草剂活性的方法是本领域熟知的。参见，例如，美国专利No.4，535，060和5，188，642,它们的每一个在这里通过全文引用作为参考。编码本发明蛋白质的生物活性部分的除草剂抗性-编码核苷酸序列的片段将会编码至少约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400个连续氨基酸，或达到存在于本发明的全长抗除草剂蛋白质中的氨基酸总数。重要的是，该片段将会含有至少一种在这里描述的III型结构域。本发明的抗除草剂蛋白质是特征为III型的那些，或它们的保留活性的片段或变体。术语"充分一致"意指采用标准参数，用在这里描述的比对程序之一测量出的，与参考序列比较具有至少约60%或65%序列同一性、至少约70%或75%序列同一性、至少约80%或85%序列同一性或至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的氨基酸或核苷酸序列。本领域的技术人员将会理解，这些值可通过考虑密码子简并、氨基酸相似性、阅读框定位等来适当调节，以确定通过两种核苷酸序列编码的蛋白质的相应同一性。为了测定两个氨基酸序列或两个多核苷酸的百分比同一性，为了最佳比较而进行序列比对。这两个序列之间的百分比同一性是序列共有的相同位置数的函数(即，百分比同一性=相同位置数/位置总数(例如，重叠位置)xl00)。在一个实施方案中，这两个序列是一样长的。这两个序列之间的百分比同一性可采用类似于下面描述的那些技术(允许或不允许缺口)测定。在百分比同一性计算中，通常计算精确的匹配。两个序列之间的百分比同一性的测定可采用数学算法完成。用于比较两个序列的数学算法的非限制性实例是Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-2268的算法，其在Karlin和Altschu1(1993)Proc.Natl.Acad.Sd.USA90:5873-5877中进行了修改。这种算法整合进了Altschul等，(1990)/.#o/.Wo/.215:403-410的BLASTN和BLASTX程序中。BLAST核苷酸搜索可用BLASTN程序进行(分值-lOO,字长=12)，以获得与本发明的GDC-类多核苷酸同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可用BLASTX程序进行(分值=50，字长-3)，以获得与本发明的抗除草剂蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得有缺口的比对用于比较目的，可以如Altschul等(1997)A^c/e/c25:3389-2402中描述的l吏用GappedBLAST。备选地，可以采用PSI-Blast进行迭代搜索，测定分子间远缘关系。参见Altschul等(1997)，同上。当采用BLAST、GappedBLAST和PSI-Blast程序时，可以使用各个程序的默认参数(例如BLASTX和BLASTN)。参见www,ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一非限制性实例是ClustalW算法(Higgins等，(1994)A^/c/eicJc油紋22:4673-4680)。ClustalW可比较序列并对齐整个氨基酸或DM序列，并因而可提供有关整个氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法在多个可商业获得的DNA/氨基酸分析软件包中使用，例如VectorNTIProgramSuite(InvitrogenCorporation,Carlsbad，CA)的ALIGNX程序模块。在用ClustalW比对氨基酸序列后，可以评估氨基酸的百分比同一性。可用于分析ClustalW比对的软件程序的非限制性实例是GENED0CTM。GENEDOC(KarlNicholas)使得能评估多个蛋白质之间的氨基酸(或DNA)相似性和同一性。用于序列比较的数学算法的另一非限制性实例是Myers和Miller(1988)"》/OS4:11-17的算法。该算法整合进了ALIGN程序(version2.0)中，ALIGN程序是GCG序列比对软件包(可从Accelrys公司，SanDiego,CA获得)的一部分。当采用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可采用PAM120权重残基表、12的缺口长度罚分和4的缺口罚分。除非另外说明，将使用Needleman和Wunsch(1970)/.#o/.5/o/.48(3):443-453算法的GAPVersion10，使用下列参数，用于测定序列同一性或相似性核苷酸序列的百分比同一性和百分比相似性使用50的GAP权重和3的长度权重，以及nwsgapdna.cmp打分矩P车；氨基酸序列的百分比同一性和百分比相似性使用8的GAP权重和2的长度权重，以及BL0SUM62打分程序。也可以使用等价程序。"等价程序"意指用于任何两种所讨论序列的任何序列比较程序，当与由GAP10版产生的对应的比对相比较时，所述的序列比较程序产生了具有相同核普酸残基匹配和相同百分比序列同一性的比对。本发明还包含多核苷酸变体。除草剂抗性-编码核苷酸序列的"变体"包括编码在这里公开的抗除草剂蛋白质，但由于遗传密码的简并而保守不同的那些序列，以及如上讨论的充分一致的那些序列。天然存在的等位基因变体可采用熟知的分子生物学技术，例如如在下文中概述的聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术鉴定。核苷酸序列变体还包括合成产生的核香酸序列，所述的核苷酸序列例如通过采用定点诱变产生，但它仍然编码如下文中讨论的在本发明中公开的抗除草剂蛋白质。包含于本发明的蛋白质变体是有生物活性的，即它们保留了天然蛋白的目标生物活性，即抗除草剂活性。"保留抗除草剂活性"意指该变体将会具有至少约30%、至少约50%、至少约70%或至少约80%的天然蛋白质的抗除草剂活性。用于测量抗除草剂活性的方法是本领域熟知的。参见，例如，美国专利No.4，535，060和5，188，642，它们的每一个在这里通过全文引用作为参考。熟练技术人员将会进一步了解到，变化可通过突变来引入进本发明的核苷酸序列中，从而导致编码的抗除草剂蛋白质的氨基酸序列发生变化，而不会改变该蛋白质的生物活性。因此，多种分离的多核苷酸可通过引入一个或多个核苷酸的取代、添加或缺失进在这里公开的相应核苷酸序列中而产生，这样一个或多个氨基酸的取代、添加或缺失引入进了编码的蛋白质中。可通过标准技术，例如定点诱变和PCR-介导的诱变来引入突变。这些核苷酸序列变体也包含于本发明中。例如，保守氨基酸取代可以在一个或多个预定的，非必需的氨基酸残基处发生。"非必需的"氨基酸残基是可以从抗除草剂蛋白质的野生型序列改变而不会改变生物活性的残基，而"必需的"氨基酸残基是生物活性所必需的。"保守氨基酸取代"是其中氨基酸残基用具有类似侧链的氨基酸残基代替的取代。具有类似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性側链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、P分支的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链的(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。氨基酸取代可以在保持功能的非保守区发生。一般而言，这种取代不能对保守氨基酸残基，或者不能对位于保守基序内的氨基酸残基进行，所述的保守基序内的这些残基是蛋白质活性所必需的。然而，本领域的技术人员将会了解，功能性变体可以在保守残基中具有较小的保守或非保守改变。备选地，变体核苷酸序列可通过沿全部或部分的编码序列随机引入突变，例如通过饱和诱变来产生，并且可以筛选产生的突变体的赋予抗除草剂活性的能力以鉴定保持该活性的突变体。诱变发生后，可重组表达编码的蛋白质，并采用标准检测技术测定该蛋白质的活性。采用方法例如PCR、杂交等，对应的抗除草剂序列可通过寻找本发明的保守结构域来鉴定。参见，例如Sambrook和Russell(2001)#o/ecw/arC7o/n'/7f爿丄a6orator/#a/7i/a7(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)以及Innis等，(1990)尸CW户rofoco7i.'JCu/deto^/et/o(/sa/7t/tio/7s(AcademicPress,StLouis,M0)。在杂交方法中，全部或部分的抗除草剂核苷酸序列或结构域可用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建这种cDNA和基因组文库的方法通常为本领域所知，并且公开于Sambrook和Russell,2001(同上)中。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDM片段、RNA片段或其它寡核苷酸，并且可用可检测基团例如"P，或任何其它可检测标记，例如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子标记。用于杂交的探针可以基于在此公开的已知的除草剂抗性-编码核苷酸序列，通过标记合成的寡核苷酸产生。另外可以使用基于核苷酸序列或编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基而设计的简并引物。探针通常包含核苷酸序列的一个区域，在严格条件下，该区域与本发明除草剂抗性-编码核苷酸序列或其片段或变体的至少约12、至少约25或至少约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800个连续核苷酸杂交。用于制备杂交探针的方法通常是本领域所知的，并公开于Sambrook和Russell，2001，同上以及Sambrook等(1989)#o/eci//ar"o/22.wjZa6or"or/舱/zwa7(2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress:ColdSpringHarbor,NewYork)中，将两者在此通过引用作为参考。这种序列的杂交可在严格条件下进行。"严格条件"或"严格杂交条件"是指，在其下探针将会与其靶序列比与其它序列杂交达到更高的可检测水平(例如，至少两倍于背景)的条件。严格条件是序列-依赖性的，并且在不同的环境下将会不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可鉴定与探针100%互补的靶序列(同源探测)。备选地，可调节严格条件以允许序列中的一些错配，以便检测到较低水平的相似性(异源探测)。通常，探针长度少于约1000个核苷酸，或少于500个核苷酸。典型地，严格条件会是其中在PH7.0-8.3下盐浓度低于约1.5MNa离子，通常约0.01-1.0MNa离子浓度(或其它盐)，并且对于短探针(例如10-50个核苷酸)温度至少约30'C而对于长的探针(例如大于50个核苷酸)至少60。C的那些条件。严格条件也可以通过加入去稳定剂例如曱酰胺实现。示例性的低严格条件包括，在37匸下用30-35%甲酰胺、1MNaCl、1%SDS(十二烷基硫酸钠)的緩冲液杂交，并在50-55。C下于1x至2xSSC(20xSSC=3.0MNaC1/0.3M柠檬酸钠)中洗涤。示例性的中等严格条件包括，在37'C下于40-45°/。甲酰胺、1.0MNaCl、1%SDS中杂交，并在55-60n下于0.5x至lxSSC中洗涤。示例性的高严格条件包括，在37。C下于50%甲酰胺、1MNaCl、1XSDS中杂交，并在60-65°C的0.1xSSC中洗涤。任选地，洗涤緩冲液可包含约0.1%至约1%的SDS。杂交的持续时间一般少于约24小时，通常约4至12小时。特异性通常是杂交后洗涤的函数，最终的洗涤溶液的离子强度和温度是关键因素。对于DM-DM杂交链，i;可从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的等式Tm=81.5°C+16.6(logM)+0.41(%GC)-0.61(°/。form)-500/L估算；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，y。GC是DM中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，。/。forra是杂交溶液中甲酰胺的百分比，而L是碱基对表示的杂交链的长度。L是50%的互补靶序列杂交至完全匹配的探针时的温度(在确定的离子强度和pH下)。对于每l%的错配，Tm降低约l°C;从而，可调节L、杂交和/或洗涤条件来与期望同一性的序列杂交。例如，如果要寻找"o%同一性的序列，可将"L降低10。C。通常，在确定的离子强度和pH下，严格条件选择为比特定序列和它的互补序列的热解链温度(Tm)约低5'C。然而，极严格条件可釆用在比热解链温度(Tra)低1、2、3或4。C下的杂交和/或洗涤；中等严格条件可采用在比热解链温度(TJ低6、7、8、9或10'C下的杂交和/或洗涤；低严格条件可采用在比热解链温度(Tra)低11、12、13、14、15或20匸下的杂交和/或洗涤。采用所述的等式、杂交和洗涤组合物，以及期望的Tm,—般技术人员将会理解，杂交和/或洗涤溶液的严格性的变化已隐含描述。如果期望的错配水平导致L低于45'C(水溶液)或32。C(甲酰胺溶液)，则优选增加SSC的浓度，以便可使用更高的温度。多核苷酸杂交的广泛指导在Tijssen(1993)LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology-HybridizationwithNucleicAcidProbes,PartI，Chapter2(Elsevier,NewYork)5和Ausubel等编辑的(1995)CurrentProtocolsinMolecularBiology,Chapter2(GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork)中找至'J。参见Sambrook等(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual(2ded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarborNY)。分离的蛋白质以及其变体和片段抗除草剂蛋白质也包含于本发明内。"抗除草剂蛋白质，，意指具有至少一种上面列出的结构域的III型蛋白质，包括，例如SEQIDNO:10、12、56和59。也提供其片段、生物活性部分和变体，并且可用于实践本发明的方法。"片段，，或"生物活性部分"包括含有编码抗除草剂蛋白质的一部分氨基酸序列，并保留了抗除草剂活性的多肽片段。抗除草剂蛋白质的生物活性部分可以是例如10、25、50、IOO或更多个氨基酸长的多肽。这种生物活性部分可通过重组技术制备并评估其抗除草剂活性。用于测量抗除草剂活性的方法是本领域熟知的。参见，例如，美国专利No.4，535，060和5，188，642，将它们每一个在此通过全文引用作为参考。"变体"意指具有与III型酶有至少约60%、65%、约70%、75%、约80°/。、85%，或约至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性的氨基酸序列的蛋白质或多肽。变体还包括由在严格条件下与编码III型酶的多核苷酸，或其互补多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽。变体包括由于诱变而氨基酸序列不同的多肽。本发明包含的变体蛋白质是有生物活性的，即它们继续拥有天然蛋白质的期望的生物活性，即保留了抗除草剂活性。用于测量抗除草剂活性的方法是本领域熟知的。参见，例如美国专利No.4，535,060和5，188，642,将它们每一个在此通过全文引用作为参考。细菌基因通常在邻近开放阅读框的起始处具有多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在一个或多个这些起始密码子处的翻译起始将会导致功能性蛋白质的产生。这些起始密码子可包括ATG密码子。然而，细菌例如芽孢杆菌(Bacillusw.)也识别密码子GTG为起始密码子，并且在GTG密码子处起始翻译的蛋白质在第一个氨基酸处含有甲硫氨酸。此外，通常不会根据先前经验而确定这些密码子中哪些在细菌中天然使用。因此，应理解，一个备选甲硫氨酸密码子的使用可能导致赋予除草剂抗性的变体的产生(例如，由SEQIDNO:58编码的SEQIDNO:59)。这些抗除草剂蛋白质包含于本发明内，并且可用于本发明的方法。也包括本发明多肽的抗体，或其变体或片段的抗体。用于产生抗体的方法是本领域熟知的(参见，例如HarlowandLane(1988)J/7〃60c^.e5v爿Za60r"oryColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.;美国专利No.4,196,265)。细菌或植物细胞的转化细菌细胞的转化通过本领域已知的多种技术中的一种完成，该技术不限于电穿孔或化学转化(参见，例如Ausubel(ed.)(1994)CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWileyandSons,Inc.,Indianopolis，IN)。赋予对毒性物质抗性的标记可用于将转化的细胞(已经吸收并表达试验DM的那些细胞)与未-转化的细胞(不含有或不表达试验DNA的那些细胞)鉴别开来。在本发明的一方面，基因可用作用以评估细菌或植物细胞转化的标记。植物细胞的转化可以以类似的方式完成。"植物"意指整林植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚和它们的子代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。"转基因植物"或"转化的植物"或"稳定转化的"植物或细胞或组织指，已将外源的多核苷酸序列或DNA片段插入或整合进植物细胞中的植物。"稳定转化"意指引入植物中的核苷酸构建体整合进植物的基因组中，并能够遗传给它的子代。可修饰本发明的基因以获得或增强在植物细胞中的表达。本发明的抗除草剂序列可提供于表达盒中用于在目标植物中表达。"植物表达盒，，包括能够导致在植物细胞中从开放阅读框表达蛋白质的DNA构建体。在转录的5'-3'方向，该表达盒将会包含在植物中发挥功能的有效连接至本发明的DM序列的转录起始区域(即启动子)，以及转录和翻译的终止区域(即终止区域)。在一些实施方案中，转录起始区域将会导致RNA序列的产生，所述的RNA序列允许编码的EPSPS酶充分表达而增强用该多核苷酸转化的植物细胞的草甘膦耐受性。"充分表达"意指转录起始区域将会提供一定数量的本发明抗草甘膦多肽(例如，含有III型结构域的那些)的表达，所述的一定量的抗草甘耐受更高浓度的草甘i的能力，、或比);有或不表达该蛋白质^植物或细胞更长时间地耐受一定浓度的草甘膦的能力。表达盒可另外包含至少一种将被共转化进生物体中的额外的基因，例如选择标记基因。备选地，另外的基因可在多个表达盒上提供。这种表达盒中提供多个限制性位点用于插入抗除草剂序列而使其处于调控区的转录调节下。对于本发明的植物宿主和/或DNA序列，启动子可以是天然的或类似的，或者外来的或异源的。另外，启动子可以是天然的序列或为合成的序列。如果启动子是"天然的"或与植物宿主"同源的"，则旨在表示该启动子发现于所述启动子引入其中的天然植物中。如果启动子对本发明的DNA序列来说是"外来的"或"异源的"，则旨在表示对于有效连接的本发明的DM序列，该启动子不是天然的或天然存在的启动子。"异源的"一般指对于它们存在于其中的细胞或部分天然基因组来说不是内源性的，且已通过感染、转染、显微注射、电穿孔、微喷射等加至细胞的多核苷酸序列。"有效连接"意指启动子和另一个序列之间的功能性连接，其中启动子序列起始和调节对应所述另一个序列的DM序列的转录。通常，有效连接表示连接的多核苷酸序列是连续的并且，如果需要连接两个蛋白质编码区，则其是连续的并且位于相同的阅读框内。通常，这种构建体也会含有5'和3'非翻译区。这种构建体可以含有"信号序列"或"前导序列"来帮助目标肽同步翻译运输或翻译后运输至某些细胞内结构，例如叶绿体(或其它质体)、内质网或高尔基体，或者被分泌。例如，基因可设计成含有信号肽，以便帮助该肽转移到内质网。"信号序列"意指已知或猜测可导致肽同步翻译运输或翻译后运输穿过细胞膜的序列。在真核生物中，这通常涉及分泌进入高尔基体中，伴随有一些糖基化产生。"前导序列"意指当翻译时，导致足以引发肽链同步翻译运输到亚细胞器的任何氨基酸序列。因此，这包括前导序列，目标是通过运输到内质网，运输到液泡、质体包括叶绿体、线粒体等来运输和/或糖基化。植物表达盒还可以设计成含有内含子，这样，表达需要进行内含子的mRNA加工。"3'非翻译区"意指位于编码序列下游的核苷酸序列。多腺苷酸化信号序列(例如，多腺苷酸化的核苷酸)和编码调节信号的其它序列是非翻译区，所述的调节信号能够影响多聚腺苷酸片段添加到mRNA前体的3'末端。"5'非翻译区"意指位于编码序列上游的核苷酸序列。其它上游或下游的非翻译元件包括增强子。增强子是用于增强启动子区表达的核苷酸序列。增强子是本领域熟知的并且包括，但不限于SV40增强子区和35S增强子元件。终止区可以是天然与转录起始区一起的，可以是天然与本发明的抗除草剂序列一起的，或者可以源自另外的来源。适宜的终止区可从根瘤农杆菌的Ti-质粒获得，例如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还可以参见Guerineau等，(1991)#o7.Ce力.Ce/2eL262:141-144;P訓dfoot(1991)CW764:671-674;Sanfacon爭，(1991)Ce薦紐5:141-149;Mogen等，(1990)尸/a/"e/72:1261-1272;Munroe等，(1990)Ge/e91:151-158;Ballas等，(1989)肠/e/"c油組17:7891-7903;以及Joshi等，(1987)iV"c/e/c15:9627-9639。如有必要，可以优化基因来增强在转化的宿主细胞中的表达。即，基因可以用宿主细胞偏爱的密码子合成用于提高表达，或者可以用密码子以宿主偏爱的密码子使用频率合成。通常，基因的GC含量将会增加。对于宿主偏爱的密码子使用的讨论，参见，例如Campbell和Gowri(1990)户7aW户A^2'0A92:1-11。用于合成宿主偏爱的基因的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利No.6,320,100、6,075,185、5，380，831和5,436,391,美国公开的申请案No.20040005600和20010003849，以及Murray等，(1989)jV"c/e/cWes.17:477-498，在此将其通过引用作为参考。在一个实施方案中，将目标多核苷酸靶向叶绿体来表达。以这种方式，如果目标多核苷酸不直接插入进叶绿体中，则表达盒将另外含有编码转运肽(transitpeptide)的多核苷酸来引导目标基因产物至叶绿体。这种转运肽是本领域已知的。参见，例如VonHeijne等，(1991),h/^#o/.A/o/.We;.9:104-126;Clark等，(1989)/.C力e迈.264:17544-17550;Della-Cioppa等，(1987)户7ai7t户力7"'".84:965-968;Romer等，(1993)A/oc力e迈.h.Co迈顶肌196:1414-1421;以及Shah等，(1986)Sc/e"ce233:478-481。在一些实施方案中，本发明的多核苷酸编码一种含有氨基-末端叶绿体转运肽和EPSPS酶的融合多肽。"融合多肽"可例如通过这样产生除去编码第一种多肽的多核苷酸序列的终止密码子，然后按读码框融合编码第二种多肽的多核苷酸序列，这样得到的多核苷酸序列将随后由细胞表达为单个多肽。可以优化要耙向至叶绿体的目标多核苷酸在叶绿体中的表达，考虑植物细胞核和该细胞器之间密码子利用的不同。以这种方式，目标多核苷酸可釆用叶绿体-偏爱的密码子合成。参见，例如，美国专利No.5,380,831，在此将其通过引用作为参考。通常将这种"植物表达盒"插入"植物转化载体"中。"转化载体"意指有效转化细胞所需的DNA分子。这种分子可以由一个或多个表达盒组成，并且可以组织成多于一个的"载体"DNA分子。例如，二元载体是利用两个非-连续DNA载体，来编码植物细胞转化所需的所有顺式-和反式功能的植物转化载体(Hellens和Mullineaux(2000)rre油2."尸/aW5We，5:446—451)。"载体"指设计用来在不同宿主细胞之间转移的多核苷酸构建体。"表达载体"指具有在外源细胞中插入、整合并表达异源DM序列能力的载体。该植物转化载体可由实现植物转化所需的一个或多个DNA载体组成。例如，利用由多于一个的连续DNA片段组成的植物转化载体是本领域中的一般惯例。在本领域中，这些载体通常称为"二元载体"。二元栽体以及具有辅助质粒的栽体最常用于农杆菌(J^ro^c^eWwzO-介导的转化，其中实现有效转化所需的DNA片段的大小和复杂性非常大，并且将功能元件分散到单独的DNA分子上是有利的。二元载体通常含有质粒载体，所述的质粒载体含有T-DNA转移所需的顺式作用序列(例如左边界和右边界)、设计成能够在植物细胞中表达的选择标记，以及"目标基因，，(设计成能够在期望产生转基因植物的植物细胞中表达的基因)。也存在于该质粒载体上的是细菌复制所需的序列。将顺式-作用序列以允许有效转移进入植物细胞中并在那里表达的方式排列。例如，选择标记基因和目标基因位于左边界和右边界之间。通常，第二个质粒载体含有介导T-DNA从农杆菌转移到植物细胞中的反式-作用因子。该质粒常常包含毒性功能元件(Vir基因)，其允许通过农杆菌感染植物细胞，并通过边界序列处的切割转移DNA以及vir-介导的DNA转移，这是本领域所了解的(Hellens和Mul1ineaux(2000)7>e"^y7/7户/a;^Sc/e/jce,5:446-451)。几种类型的农杆菌属菌抹(例如LBA4404、GV3101、EHAIOI、EHA105等)可用于植物转化。通过其它方法例如微喷射、显微注射、电穿孔、聚乙二醇等来转化植物不需要第二种质粒载体。植物转化本发明的方法涉及将核苷酸构建体引入植物中。"引入"意指以使构建体获得进入植物细胞内的方式给予植物核苷酸构建体。本发明的方法不需要采用用于将核苷酸构建体引入进植物中的特殊方法，仅需要核苷酸构建体获得进入至少一个植物细胞的内部。用于将核苷酸构建体引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法，以及病毒-介导的方法。通常，植物转化方法包括将异源DM转移进耙植物细胞(例如未成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)中，之后应用最大阈水平的适当选择(取决于选择标记基因，并且在该情况下是"草甘膦")来从一组未转化的细胞群中回收转化了的植物细月包。在这种方法中，含有一个或多个本发明的III型结构域的抗草甘膦多肽可用作选择标记。通常将外植体转移至新鲜提供的相同的培养基中并按常规培养。随后，在置于补充有最大阈水平的选择剂(例如"草甘膦")的再生培养基中后，转化的细胞分化成了小苗。然后将小苗转移至选择性生根培养基(rootingmedium)中，用以回收生根的小苗或小植林。随后，转基因小植林成长为成熟植物并产生能育种子(例如，Hiei等,(1994)r力e尸/a/^/our加/6:271-282;Ishida等，(1996)^"ure倫&由o/喂14:745-750)。通常将外植体转移至新鲜提供的相同的培养基中并按常规培养。用于产生转基因植物的才支术和方法的一般性描述可在Ayres和Park(1994)Cr/"'ca7We".ew^/7a/f5We;jce13:219-239以及Bommineni和Jauhar(1997)42:107-120中找到。由于转化的材料含有许多细胞，转化和未转化的细胞都存在于接受处理的任何一片靶标愈伤组织或组织或细胞群中。杀死未转化的细胞并使转化的细胞增殖的能力产生了转化的植物培养物。通常，除去未转化的细胞的能力是对迅速回收转化的植物细胞并成功生产转基因植物的限制。然后，将用分子和生物化学方法来确认转基因植物基因组中整合的异源基因的存在。转基因植物的产生可通过多种方法之一完成，包括但不限于通过农杆菌将异源DNA引入植物细胞中(农杆菌-介导的转化)、用附着于粒子的异源的外来DNA轰击植物细胞，以及多种其它的非-粒子引导-介导方法(例如，Hiei等(1994)7力e户"/^6:271-282;Ishida等，(1996)W"i/re肠tec//7o7og/14:745-750;Ayres和Park(1994)6W〃ca/Wey/ew尸/a/7tSc/e/2ce13:219—239;Bommineni和Jauhar(1997)舱7心ca42:107-120)来转移DNA。用于叶绿体转化的方法是本领域已知的。见，例如，Svab等，(1990)户roc.^"/.Jcad.Sc/.^^87:8526-8530;Svab和Maliga(1993)户roc.ya〃.^ca^5"c/.90:913—917;Svab和Maliga(1993)/.12:601-606。该方法依靠粒子枪递送含有选择标记的DNA，并通过同源重组靶向该DM至质体基因组。另外，质体转化可通过核-编码的和质体-引导的RNA聚合酶的组织偏爱型表达，使沉默的质体运载的转基因反式激活来完成。这样的一种体系已经在McBride等，(1994)户wc.Wa〃.JcaA5W.91:7301-7305中才艮道。根据常规的方法，可使已转化的细胞成长为植林。见，例如McCormick爭，(1986)户/a/^Ce//7epor"5:81-84。随后可以栽培这些植物，并用相同转化林或不同转化林授粉，并且鉴定得到的具有组成型表达期望表型特征的杂种。可以栽培两个或多个世代，以确保期望的表型特征的表达得以稳定保持和遗传，然后收获种子以确保期望表型特征的表达已经实现。以这样的方式，本发明提供了转化的种子(也称为"转基因种子")，所述的种子具有已稳定整合进它们基因组中的本发明核普酸构建体，例如本发明表达盒。本发明可用于任何植物种类的转化，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目标植物的实例包括，但不限于玉米(maize)、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜、芸苔属物种、苜蓿、黑麦、黍、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡树、椰子、菠萝、柑橘、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、木瓜、腰果、澳大利亚坚果、杏、燕麦、蔬菜、观赏性植物和针叶植物。蔬茱包括，但不限于番茄、莴苣、四季豆、利马豆、豌豆，以及黄瓜(Curcumis)属的成员例如黄瓜、罗马甜瓜和甜瓜。观赏性植物包括，但不限于杜鹃花、八仙花(hydrangea)、木槿(hibiscus)、蔷薇、郁金香、水仙花、矮牵牛花(petunias)、康乃馨、猩猩木和菊花。优选地，本发明的植物是作物(例如，玉米、高梁、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、马铃薯、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜等)。本发明尤其适合于单子叶植物科的任何成员，包括但不限于玉米、水稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、山药、洋葱、香蕉、椰子和枣椰子。植物转化的评估在将异源的外来DNA引入植物细胞中后，通过多种方法，例如分析与整合进的基因相关的多核苷酸、蛋白质和代谢物，来证实植物基因组中异源基因的转化或整合。PCR分析是一种在移栽进土壤之前的早期阶段，筛选转化的细胞、组织或小苗的整合的基因的存在的快速方法(Sambrook和Russell(2001)yl/o/ecw/arC7o/7/力fJ丄a6orafo/7^a/3Ufl/,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY)。PCR用对目标基因或农杆菌载体背景等特异性的寡核苷酸引物完成。2001，同上)确认。一般而言，从转化体中提取出总DNA，将其用合适的限制性内切酶消化，在琼脂糖凝胶中分级分离并转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上。然后，根据标准技术(Sambrook和Russell,2001，同上)，用例如放射标记的"P耙DNA片段探测该膜或"印迹"来确认植物基因组中所引入的基因的整合。在RNA印迹分析中，根据本领域中常规使用的标准方法(Sambrook和Russell，2001,同上)，从转化体的特定组织中分离出RNA，将其在甲醛琼脂糖凝胶中分级分离，并印记到尼龙滤膜上。然后，通过本领域已知的方法(Sambrook和Russell,2001,同上)，将所述滤膜与源自GDC的放射性探针杂交来检测由本发明序列编码的RNA的表达。可采用结合抗除草剂蛋白质上存在的一个或多个表位的抗体，通过标准方法(Sambrook和Russell，2001，同上)对转基因植物进4亍蛋白质印迹和生物化学测定法等，以测定由除草剂抗性基因编码的蛋白质的存在。本发明也涉及用于鉴定具有抗草甘膦活性的EPSP合酶的方法。该方法包括，确定某些保守序列结构域是否存在于EPSP合酶的氨基酸序列中。一个或多个结构域的存在在上面列出。从序列预测蛋白质功能釆用本发明的方法以及鉴定的结构域，可以鉴定赋予草甘膦耐受性的其它多肽(例如，SEQIDN0:2、4、46和48)。可通过搜寻含有EPSP合酶序列的序列数据库，和/或通过比对EPSP合酶的多肽序列来搜索III型结构域的存在而鉴定这些另外的多肽。这些多肽包括已知的多肽以及新鉴定出的多肽。应该了解，这些结构域的一些修饰本质上是容许的而不破坏这些结构域的赋予草甘膦抗性的特性，并因此与在这里列出的结构域是等效的。一般而言，存在四个等级的蛋白质结构一级结构，其由直链氨基酸或多肽序列组成；二级结构，其由蛋白质折叠成的a-螺旋、|3-片层(p-strand)以及转角(turn)产生；三级结构，其由已组合形成紧密的球状结构域的简单基序构成；以及四级结构，其可包含多条氨基酸链或亚基。当从序列预测功能时，鉴定功能上重要的基序或模式是重要的。具有相似折叠的蛋白质结构域通常具有相同的分子功能(Hegyi和Gerstein(1999)/.5/o人288:147-164;Moult和Melamud(2000)O/iv.0p//7.S"i/cL10:384-389;Shakhnovich爭，(2003)/.#o/.S/o/.326:1-9)。对蛋白质功能重要的结构域的确定可通过多序列比对完成。三维结构可通过同源建模，即通过利用具有经实验方法测定的3D结构的序列同系物(>25。/。的序列同一性)预测。例如大肠杆菌EPSP合酶(AroA)的三维结构是所熟知的(Sh6nbrunn等，(2001)尸roc.Jcac/.仏W98:1375-1380)。该结构是基于AroA与草甘膦和莽草酸3-磷酸的结晶。下面的实施例是以举例说明的方式而不是以限定的方式提供。试验实施例l.EPSPS基因的分离已从7种不同细菌(肺炎克雷伯氏菌(A7e^y/e"s，画"/se入放射开j土壤杆菌(^rodfl"er/w迈radf/o6a"er,、根瘤菌属物种(A力/zo6/咖sp.)、泡嚢短波单胞菌(Arey"/7C^迈o/7a51n5".ci/7<sr/s人根瘤农杆菌("ro6fl"er/咖f咖e尸ac/e/7S,、7"*夜卓應#f户sewcfo迈OT2ass/r!'/^eJ，以及布鲁氏菌属/苍白杆菌属(^t/ceZ/a/OcAro^c^iy/zO分离了编码III型EPSPS酶的基因。grg8开放阅读框的DNA编码序列和氨基酸序列在于2004年12月29日申请的美国专利申请No.60/640,195中提供，并分别在本申请的SEQIDNO:7和SEQIDNO:8中提供。giX2开放阅读框的DM编码序列和氨基酸序列分别在本申请的SEQIDNO:57和10以及SEQIDNO:58和59中提供。^r^7J开放阅读框的DNA编码序列和氨基酸序列分别在本申请的SEQIDNO:11和SEQIDNO:12中提供。grg6开放阅读框的DNA编码序列和氨基酸序列在GenBank登记号AE016853的碱基1，140，091到1，141，347中提供，并且分别在本申请的SEQIDNO:1和SEQIDNO:2中提供。grg9开放阅读框的DNA编码序列和氨基酸序列在GenBank登记号NC—003304的碱基628，398到629，675中提供，并且分别在本申请的SEQIDNO:3和SEQIDNO:4中提供。grg7开放阅读框的DNA编码序列和氨基酸序列分别在本申请的SEQIDNO:45和SEQIDNO:46中提供。grg5开放阅读框的DNA编码序列和氨基酸序列在GenBank登记号NC-005773的碱基1到1257中提供，并且分别在本申请的SEQIDNO:47和SEQIDNO:48中提供。玉米EPSPS开放阅读框的DNA编码序列和氨基酸序列在GenBank登记号X63374(gi:1524383)的碱基1到1335中提供，并且蛋白质序列在本申请的SEQIDNO:50中提供。公开于国际专利申请案W02005014820中的细菌EPSPS的MA编码序列和氨基酸序列分别在本申请的SEQIDNO:53和SEQIDNO:54中提供。^^7迈J开放阅读框的DNA编码序列和氨基酸序列分别在本申请的SEQIDNO:55和SEQIDNO:56中提供。实施例2.从丁香假单胞菌番茄致病变种(尸se"^/Po/assyr//7^aepv"迈a&,菌抹DC3000克隆EPSP合酶基因。用下列引物CAGAGATCTGGCATGCGACCTCAAGCCACTCTC(上游，SEQIDN0:61)和CAGGGCGCGCCTCAGCGCTGAACACTCACCC(下游，SEQIDNO:62)，从丁香假单胞菌番茄致病变种菌抹DC3000(ATCCBAA-8H)的基因组DMPCR-扩增EPSP合酶编码序列。将得到的1.3kbPCR产物用处7II和heI消化，连接进已用5a迈HI和heI消化的改良的pUC18中，随后经电穿孔进入DH5a细胞中。从抗氨苄青霉素的菌落制备质粒DM并通过限制酶切消化分析。选择一个克隆用于进一步的分析。用本领域熟知的技术测定了插入片段的DM序列，并发现与公开的菌林DC3000的序列(Genbank登记号AE016853,碱基1，140，091到1，141，347)100%—致。该质粒称为pAX703,并且EPSPSORF称为grg么将质粒pAX703转化进JaroJ大肠杆菌细胞并发现弥补了缺失。这说明grg6编码了功能性EPSP合酶。实施例3.从放射形土壤杆菌菌抹C58克隆EPSP合酶基因。用下列引物:CAGGGATCCGGCATGATCGAACTGACCATCACCC(上游，SEQIDNO:63)和CAGGGCGCGCCTCAGTGCTGCGGCTCGGCAGCG(下游，SEQIDNO:64)，从根瘤农杆菌菌林C58(ATCC33970)的基因组DNAPCR-扩增EPSP合酶编码序列。将得到的1.3kbPCR产物用勘威I和I消化，连接进已用^izHI和hcl消化的改良的pUC18中，随后经电穿孔进入DH5a细胞中。从抗氨千青霉素的菌落制备质粒DNA并通过限制酶切消化分析。选择一个克隆用于进一步的分析。用本领域熟知的技术测定了插入片段的DNA序列，并发现与公开的菌林C58的序列(Genbank登记号NC—003304，碱基628398到629675)100%—致。该质粒称为pAX702,并且C58EPSPSORF称为^rg久将质粒pAX702转化进zlarW大肠杆菌细胞中并发现弥补了缺失。这说明grg9编码了功能性EPSP合酶。实施例4.检测grg6和grg9的草甘膦抗性。将分别含有gi^f和^T^夕的质粒pAX703和pAX702转化进大肠杆菌细胞中，并在含有不同浓度草甘膦的M63琼脂培养基上划线接种。将载体质粒PUC18用作草甘膦-敏感对照。结果在下面的表1中给出，并证实了grg6或^r^夕的表达赋予了高水平的草甘膦抗性。表1存在草甘膦时表达^r^f或gr^的大肠杆菌的生长。<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>实施例5.从丁香假单胞菌丁香致病变种菌抹B728a克隆EPSP合酶基因。用下列引物CAGGGATCCGGCATGCGACCTCAAGCCACCCTC(上游，SEQIDNO:65)和CAGGGCGCGCCTCAGCGCTGAACACTCACAC(下游，SEQIDNO:66)，从一个充分分离的丁香假单胞菌丁香致病变种菌林B728a的菌落PCR-扩增EPSP合酶编码序列。将得到的1.26kbPCR产物用合适的限制性内切酶消化并连接进载体pRSFlb中，然后经电穿孔进入大肠杆菌细胞中。从抗氨千青霉素的菌落制备质粒DNA并通过限制酶切消化分析。选出一个克隆用于进一步的分析并命名为pAX1923。测定pAX1923中的开放阅读框的DM序列，发现其与公开的丁香假单胞菌丁香致病变种菌株B728a的EPSPS的序列一致。因此，我们将该开》文阅读框命名为grg7。类似地，将另一1.26kbPCR产物用5a/zHI和heI消化，连接至已用"a/z;HI和J"I消化的改良的pUC18中，随后经电穿孔进入DH5a细胞中。从抗氨千青霉素的菌落制备质粒DNA并通过限制酶切消化分析。选择一个克隆用于进一步的分析。用本领域熟知的技术测定pAX712插入物的DNA序列，当与公开的丁香假单胞菌丁香致病变种菌林B728a的DM序列(Genbank登记号NZ-AABP02000003，碱基39,901到41,400)比较时，发现其包含3个核苷酸变化。这3个DM核苷酸变化导致蛋白质相对于由所述公开序列编码的假定蛋白质具有一个氨基酸变化。将编码EPSPS的菌林B728a的开放阅读框，如在质粒pAX712中鉴定的，称为^^7W(SEQIDNO:55;grg7ml蛋白质序列在SEQIDNO:56中列出)。实施例6.从丁香假单胞菌菜豆致病变种菌抹1448a克隆EPSP合酶基因。丁香假单胞菌菜豆致病变种菌林1448a的EPSPS的序列数据从TheInstituteforGenomicResearch的网址www,tigr.org获得。用基于可从TheInstituteforGenomicResearch("TIGR"，个人通信)获得的DNA序列设计的下列引物CAGGGATCCGGCATGCGACCTCAAGCCACCCTC(上游，SEQIDNO:67)和AGAGGCGCGCCTCAGCGCTGAACACGCACC(下游，SEQIDNO:68)，从丁香假单胞菌菜豆致病变种菌株1448a(ATCCBAA-978)的基因组DNAPCR-扩增丁香假单胞菌菜豆致病变种菌林1448a的EPSP合酶编码序列。将得到的1.26kbPCR产物用^础I和heI消化，连接进已用》緒HI和」"I消化的改良的pUC18中，随后经电穿孔进入DH5a细胞中。从抗氨节青霉素的菌落制备质粒DNA并通过限制酶切消化分析。选出一个克隆用于进一步的分析，并命名为pAX713。用本领域熟知的技术测定pAX713插入物的DNA序列，发现其与公开的丁香假单胞菌菜豆致病变种(/^eucfo迈o/as^rr//2gaepv.p力aseo7/co/a)菌林1448a的DNA序歹寸(通过TheInstituteforGenomicResearch(TIGR)进^f亍，并可在www,tigr.org上以电子版形式在线获得)100%—致。该质粒称为pAX713，并且编码EPSPS的菌林1448a的开;^文阅读框，如在质丰立pAX713中鉴定的，称为gix5。实施例7.检测grg5和grg7的草甘膦抗性。将分别含有grg5、grg7和^rg7/^的质粒pAX713、pAX1923和pAX712转化进大肠杆菌细胞中，并在含有不同浓度草甘膦的M63琼脂培养基上划线接种。将载体质粒PUC18用作草甘膦-敏感对照。结果在下面的表2中显示，并证实gw5、grg7或grg7/ZL的表达赋予了高水平的草甘膦抗性。表2存在草甘膦时表达^"gj、g^7或^^7W的大肠杆菌的生长。<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>实施例8:ATX20019的分离通过将土壤样品涂布于含有草甘膦作为唯一磷来源的HEPES矿物盐培养基(HMSM)上来分离ATX20019。由于HMSM不含芳族氨基酸，菌林必须是抗草甘膦的以便在该培养基中生长。将2克土壤悬浮于约10ml的水中，涡旋15秒并让其沉淀15分钟。将10n1菌环量的该混悬液加入至3ml补充有10mM草甘膦的HMSM(pH7.0)中。HMSM含有(每升)10g葡萄糖、2gNH4S04、9.53gHEPES、1.0ml0.8MMgS04、1.0ml0.1MCaCl2、1.0ml痕量元素溶液(在100ml的lOOOx溶液中0.1gFeS04.7H20、0.5mgCuS04'5H20、1.0mgH肌、1.0mgMnS04.5H20、7.0mgZnS04.7H20、1.0mgMo03、4.0gKCl)。让培养物在28t:下于振荡培养箱中培育4天，随后将20m1用于接种2.5ml含有10mM草甘膦作为唯一磷来源的新鲜HMSM。2天后，将2Gp1用于接种另一个新鲜的2.5ml培养基。5天后，将20n1用于接种一个新鲜的2.5ml培养基。在充分培养后，通过将1U1菌环在琼脂平板表面划线接种将培养物涂布于固体培养基上，并在28。C下储存，所述的琼脂平板含有具有10mM草甘膦作为唯一磷来源的HMSM琼脂。然后将培养物再次涂布用于分离。由于其在有高浓度草甘膦的情况下生长的能力而选择了一种特殊的菌林，称为ATX20019。通过对16SrDNA进行序列测定并与数据库比较，确定了ATX20019是苍白杆菌属(OcAro6a"r咖sp.)/布鲁氏菌属(Brucellasp.)的一员。实施例9.粘粒文库的制备和筛选采用本领域一般已知的方法从ATX20019培养物中提取出总DM。将该DNA用限制性内切酶^f/W7部分消化并根据生产商的说明书，与SuperCos(Stratagene)栽体片段连接。用GigaPackIIIXLpackagingextract(Stratagene)，将连接产物包装进噬菌体颗粒中，转染进大肠杆菌aroA-细胞中。大肠杆菌aro4-是一种其中天然的编码EPSP合酶的ar"基因已删除的菌林。该菌林不能在M63培养基中生长，因为它需要外来提供的芳族氨基酸。含有EPSP合酶基因的粘粒的存在可遗传性地补充ard表型，即，使得该菌林能够在没有外来提供的芳族氨基酸的M63培养基上生长。将转染的细胞涂布于含有50pg/ml卡那霉素的M63琼脂培养基上，M63琼脂培养基含有100mMKH2PO4、15raM(NH4)2S04、50|iMCaCl2、l|nMFeS04、50^iMMgCl2、55mM葡萄糖、25mg/升L-脯氨酸、10mg/升盐酸硫胺素、用于调节pH至7.0的足够的NaOH，以及15g/升琼脂。鉴别了生长在该培养基上的两个菌落。从这两个菌落的每个制备粘粒DNA并将其再转化进大肠杆菌ar"-细胞中。在每种情况中，用粘粒DNA再转化的细胞可在有0或10mM草甘膦存在的M63培养基上生长，而含有空的SuperCos载体的细胞不能在M63培养基上生长。这证实了，所述的粘粒能够补充arW-表型并且能够赋予草甘膦抗性。这些粘粒称为pAX1100和pAX1101。通过使用两种不同的酶的限制酶切消化分析，所述的粘粒似乎是一致的。选择一种粘粒即pAX1101用于进一步鉴定。实施例10.粘粒pAX1101中的^x2的鉴定为了鉴定负责粘粒pAX1101显示的草甘膦-抗性的基因，将该克隆的DM用转座因子进行诱变处理。在该方法中，鉴定了已受到转座子插入，并且已丧失赋予草甘膦抗性的能力的克隆。转座子插入的位置确定了负责草甘膦抗性表型的开放阅读框。用EZ::TNInsertionKit(Epicentre,Madison，WI)和生产商提供的方法，让粘粒pAX1101接受体外转座子诱变。该方法随机地插入转座子片段进粘粒DNA中，并因此随机地破坏了粘粒中的基因的功能。所述的转座子含有编码抗生素抗性的基因，因此可通过在存在那种抗生素时生长的能力来选择转座子插入克隆。转座子插入的位置可通过限制性片段作图或通过用在转座子中退火的引物测序而确定。将转座子插入的pAX1101克隆转化进大肠杆菌菌林DH5a中，并将其涂布于含有草甘膦的M63培养基上。发现多个克隆已丧失了在存在草甘膦时生长的能力，这说明转座子已破坏了负责抗性的基因。使用本领域熟知的测序方法，测定含有转座子插入物的pAX1101区域的DM序列，并表示为SEQIDNO:9。确定了在SEQIDNO:9的碱基46到1380处的开放阅读框(ORF)。该核苷酸序列表示为SEQIDNO:57，并且对应的氨基酸序列表示为SEQIDNO:58。来自已丧失草甘膦抗性的8个转座子插入克隆的序列数据分析显示，它们都存在于该ORF内。这说明该ORF编码了粘粒赋予的草甘膦抗性。将该基因命名为grW二含有gr^^ORF的粘粒pAX1101于2005年4月4日保藏于农业研究机构保藏中心(AgriculturalResearchServiceCultureCollection(NRRL))，分配的保藏号为B-30833。实施例11.GRG12与其它蛋白质的同源性GRG12与EPSP合酶具有同源性。GRG12氨基酸序列(SEQIDNO:10)与其它EPSP合酶的氨基酸序列的比对在图1中显示。表3列出了GRG12与多种EPSP合酶的百分比同一性。对氨基酸序列(SEQIDNO:IO)的分析表明，其不含代表II型EPSP合酶的4个结构域。因此，它是一种新的、非-II型的抗草甘膦EPSP合酶。GRG12与在WO2005014820中描述的EPSPS(SEQIDNO:54)具有最高的氨基酸同源性。GRG12(SEQIDNO:10)与WO2005014820中描述的EPSPS具有92%的氨基酸同一性。表3.GRG12与其它EPSP合酶的氨基酸同一性<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>grg"DNA序列(SEQIDNO:9)的进一步分析显示，存在另一个更短的开放阅读框(SEQIDNO:58)，其从SEQIDNO:9的核苷酸142处的GTG起始密码子开始。该开放阅读框的翻译产生了与SEQIDNO:10的残基33-444相同的蛋白质(SEQIDNO:59)，除了SEQIDNO:59的起始密码子是甲硫氨酸而不是SEQIDNO:10中存在的缬氨酸。SEQIDNO:59与已知的EPSPS蛋白质的比对表明，该蛋白质含有已知对发挥EPSPS功能关键的所有残基。因此，该蛋白质可能含有功能性的、抗草甘膦EPSPS酶，而由高度保守的结构域内部的起始密码子起始翻译产生的蛋白质将不可能有功能。SEQIDNO:59与WO2005014820中描述的EPSPS(SEQIDNO:54)有97%的同一性。这两种开放阅读框(SEQIDNO:57和58)编码功能性EPSPS活性的能力都可通过如下检测如本领域已知，通过PCR来扩增每个开放阅读框，将得到的PCR片段克隆进在合适的启动子控制下的质粒栽体中，诱导蛋白质从所述开放阅读框表达，并比较表达的蛋白质补充大肠杆菌中的aroA-表型的能力和赋予草甘膦抗性的能力。实施例12.对^rg"进行基因工程改造用于在大肠杆菌中表达GRG12蛋白质通过PCR扩增^^L开放阅读框(ORF),克隆进稍微修饰形式的质粒载体pUC18中并转化进大肠杆菌菌林DH5a中。对pUC18的改变如下将终止密码子插入进/scZ开放阅读框中，并且将核糖体结合位点(用于优化插入的ORF的翻译起始)插入^/^/限制性位点的上游。制备质粒DNA，并通过限制酶切消化来确定gi^L插入物的存在和方向。将含有相对于载体中的/ac启动子以正向取向的ORF的一个克隆命名为pAX1106，并检测其赋予草甘膦抗性的能力。将含有pAX1106或空载体质粒的大肠杆菌细胞在含有0-200mM草甘膦的M63琼脂平板划线接种。结果在下面的表4中显示。这些结果证明，^^2赋予了高水平的草甘膦抗性。表4.pAX1106在M63草甘膦琼脂上的生长<table>complextableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>实施例13.在大肠杆菌中作为6xHis-标记的蛋白质表达的GRG12的纯化采用PFUULTRATMDM聚合酶(Stratagene)，通过PCR扩增^r^2编码区。设计用于引导PCR的寡核苷酸，来引入限制性内切酶识别位点至得到的PCR产物的5'和3'末端附近。将得到的PCR产物用合适的限制性内切酶消化，并将消化产物克隆进6xHis-标签表达载体pRSFlb(Novagen)中。得到的克隆在与6xHis标签相同的翻译阅读框中含有^^"，并且其C-端直接与6xHis标签连接。用于产生这种克隆，以及用于表达含有6xHis-标签的蛋白质的一般策略是本领域熟知的。GRG12蛋白质的表达水平可在SDS-PAGE蛋白质凝胶上测定。GRG12蛋白质可通过在例如Ni-NTASuperflowResin(Qiagen)上，按照生产商的说明书，进行层析来纯化诱导的GRG12蛋白质而得以分离。实施例14:ATX4150的分离ATX4150通过将土壤样品涂布于含有草甘膦作为唯一礴来源的加富基础培养基(EnrichedMinimalMedia)(EMM)上来分离。由于E醒不含芳族氨基酸，菌林必须是抗草甘膦的以便在该培养基中生长。将2克土壤悬浮于约30ml的水中，并在Aquasonic超声波仪水浴中超声处理30秒钟。将该样品涡旋5秒钟并让其沉淀60秒钟。将该步骤重复3次。将IOOp1该混悬液加入至3ml补充有4mM草甘膦的E醒(pH6.0)中。EMM含有(每900ml):10g葡萄糖、2gNaN03、1.0ml0.8MMgS04、1.0ml0.1MCaCl2、1.0ml痕量元素溶液(在100ml的1000x溶液0.1gFeS04.7H20、0.5mgCuSOr5H20、1.0mgH3B03、1.0mgMnSOr5H20、7.0mgZnSOr7H20、1.0mgMo03、4.0gKC1中)。让培养物在21X:下于组织培养旋转滚筒中振荡16天，并随后将IOOyl用于接种3ral含有4mM草甘膦作为唯一磷来源的新鲜EMM。5天后，将10Qp1用于接种另一个新鲜的3ml培养物。在数天后，通过将lia1菌环划线接种于琼脂平板表面上，将培养物涂布于固体培养基上，所述的琼脂平板含有具有5mM草甘膦作为唯一磷来源的E醒琼脂。在数天后，将菌落再涂布于含有5mM草甘膦作为唯一磷来源的E醒上用于分离。由于其在有高浓度草甘膦的情况下生长的能力而选择了一种特殊的菌抹，称为ATX4150。实施例15.粘粒文库的制备和筛选用本领域普遍知道的方法从ATX4150培养物中提取出总DNA。将该DNA用限制性内切酶部分消化并根据生产商的说明书，与SuperCos(Stratagene)载体片段连接。用GigaPackIIIXLpackagingextract(Stratagene)，将连接产物包装进噬菌体颗粒中，转染进大肠杆菌sroA-细胞中。大肠杆菌ar"-是一种其中天然的编码EPSP合酶的aro4基因已删除的菌株。该菌林不能在M63培养基中生长，因为它需要外来提供的芳族氨基酸。含有EPSP合酶基因的粘粒的存在可遗传性地补充ard-表型，即，其使得该菌林能够在没有外来提供的芳族氨基酸的M63培养基上生长。将转染的细胞涂布于含有50pg/ml卡那霉素的M63琼脂培养基上。M63琼脂培养基含有100mMKH2PO4、15mM(NH4)2S04、50jiMCaCl2、lnMFeS04、50nMMgCl2、55mM葡萄糖、25mg/升L-脯氨酸、10mg/升硫胺素HC1、用于调节pH至7.0的足够的Na0H,以及15g/升琼脂。鉴定了生长在该培养基上的5种菌落。从这些菌落的每个制备粘粒DNA并将其再转化进大肠杆菌arW-细胞。在每种情况中，用粘粒DNA再转化的细胞可在有O或IOmM草甘膦存在的M63培养基上生长，而含有空的SuperCos载体的细胞不能在M63培养基上生长。这证实了，所述的粘粒能够补充arol表型并且能够赋予草甘膦抗性。选择一种粘粒用于进一步鉴定，并且命名为pAX305。实施例16.粘粒pAX305中的gr^J的鉴定为了鉴定负责粘粒PAX305显示的草甘膦-抗性的基因，将该克隆的DNA用转座因子进4亍i秀变处理。用EZ::TNInsertionKit(Epicentre,Madison，WI)和生产商提供的方法，让粘粒pAX305接受体外转座子诱变。将pAX305的转座子插入克隆转化进大肠杆菌中，并将其涂布于含有草甘膦的M63培养基上。发现多个克隆已丧失了在存在草甘膦时生长的能力，这说明转座子已破坏了负责抗性的基因。使用本领域熟知的测序方法，测定含有转座子插入物的pAX305区域的DM序列，并表示为SEQIDNO:61。确定了一个开放阅读框(ORF，SEQIDNO:61的核苷酸碱基77到1354)。来自已丧失草甘膦抗性的8个转座子插入克隆的序列数据分析显示，它们都存在于该ORF内。这说明该ORF编码了粘粒赋予的草甘膦抗性。将该基因命名为gr^J。含有gr^JORF(SEQIDNO:11)的粘粒pAX305于2005年4月20日保藏于农业研究机构保藏中心(AgriculturalResearchServiceCultureCollection(NRRL))中，并分配保藏号为NRRLB-30838。实施例17.GRG15与其它蛋白质的同源性GRG15与EPSP合酶具有同源性。GRG15氨基酸序列(SEQIDNO:12)与其它EPSP合酶的氨基酸序列的比对在图1中显示。表5列出了GRG15与多种EPSP合酶的百分比同一性。对氨基酸序列(SEQIDNO:12)的分析表明，其不含有代表II型EPSP合酶的4个结构域。因此，它是一种新的、非-II型抗草甘膦EPSP合酶。表5.GRG15与其它EPSP合酶的氨基酸同一性基因与GRG15的百分比同一性GRG994%GRG870%GRG766%GRG666%GRG1260%鞋2,似萝32%32%32%31%26%26%24%24%GRG123%农杆菌属CP422%实施例18.抗草甘膦的非-II型酶(III型)之间的同源区段(HomologyBlock)GRG蛋白质(非-II型抗草甘膦蛋白质)的氨基酸序列的比较显示，GRG蛋白质相互具有显著的同源性，并且不同于先前确定的抗草甘膦EPSP合酶(参见图1)。实施例19:保守结构域的鉴定分析了7种已知的EPSP合酶的氨基酸序列的中不存在于I型或II型EPSP合酶中的保守结构域。在这些EPSP合酶中发现了下列结构域下划线表示仅在该类型中存在的保守残基，而斜体字表示所有EPSPS酶中保守的残基。结构域I:L-A-i-G-X广S-X2-L-X3-G-^-L-^-S-D-D-];(SEQIDNO:13)，其中X!表示赖氨酸或苏氨酸，其中X2表示精氨酸或组氨酸，其中X3表示丝氨酸或苏氨酸。结构域Ia:L-A-K-G-X！(SEQIDNo:14)，其中X:表示赖氨酸或苏氨酸。结构域lb:S-X广L-X2(SEQIDNO:15)，其中X,表示精氨酸或组氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸。结构域Ic:G-A-L-K-S-D-D-T卿IDNO:16)结构域II:E-g-D-X广X广I-E-X3-V-X广X5-X6-G(SEQIDNO:17)，其中X!表示天冬氨酸或丙氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸，其中X3表示缬氨酸或异亮氨酸，其中X4表示苏氨酸或谷氨酸或赖氨酸，其中Xs表示丝氨酸或甘氨酸，其中1表示谷氨酰胺或丝氨酸或谷氨酸或苏氨酸。结构域IIa:E-f-D-X广X广];-E-X3-V(SEQIDNO:18)，其中X!表示天冬氨酸或丙氨酸，其中X,表示丝氨酸或苏氨酸，其中X3表示缬氨酸或异亮氨酸。结构域lib:X广X广X3-G(SEQIDNO:19)，其中X!表示苏氨酸或谷氨酸或赖氨酸，其中X2表示丝氨酸或甘氨酸，其中X3表示谷氨酰胺或丝氨酸或谷氨酸或苏氨酸。结构域III:旱TAA卿IDNO:20)结构域IV:KiPI(G/M)E(SEQIDNO:21)HP-I-X广P，其中Xi表示甘氨酸或曱硫氨酸或亮氨酸。结构域V:X广G-C-P-P-V(SEQIDNO:22)，其中X!表示苏氨酸或丝氨酸。结构域VI:I-g-^-Xr^Y-Xr^D-L-T(SEQIDNO:23)，其中X!表示精氨酸或赖氨酸或亮氨酸，并且其中X2表示异亮氨酸或缬氨酸。结构域VII:W-X广V-X广X广T-G(SEQIDNO:24)，其中Xi表示精氨酸或赖氨酸，其中X2表示丙氨酸或组氨酸或谷氨酸或丝氨酸，其中X3表示脯氨酸或丙氨酸。结构域VIII:E-P-Z"A-S-A-A-T-Y-L-W-X「A-X2-X3-L(SEQIDNO:25)，其中X!表示丙氨酸或甘氨酸，其中X2表示谷氨酸或谷氨酰胺，其中X3表示缬氨酸或亮氨酸或丙氨酸。结构域Villa:E-P-/>"A-S-A-A-T-Y-L-W(SEQIDNO:26)结构域IX:I-D-X广g(SEQIDNO:27)，其中X:表示异亮氨酸或亮氨酸。结构域X:F-X广Q-P-D-A-K-A(SEQIDNO:28)，其中X!表示苏氨酸或丝氨酸，结构域XI:Xi-E—f-Xs—XrXj-A—Xs-Xs-XfG-g-Q-M-Q-D-A-I-P—T-Xs-A-V-X9A-A-F-E(SEQIDNO:29)，其中Xi表示谷氨酰胺或赖氨酸或丝氨酸，其中X2表示天冬酰胺或组氨酸，其中X3表示甲硫氨酸或亮氨酸，其中t表示脯氨酸或谷氨酰胺，其中Xs表示苏氨酸或谷氨酸或缬氨酸，其中Xs表示缬氨酸或异亮氨酸，其中X7表示天冬氨酸或缬氨酸，其中X8表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X9表示亮氨酸或异亮氨酸。结构域XIa:X「E_E-X2-X3-X4-A(SEQIDNO:30),其中X!表示谷氨酰胺或赖氨酸或丝氨酸，其中X2表示天冬酰胺或组氨酸，其中X3表示甲硫氨酸或亮氨酸，其中X^表示脯氨酸或谷氨酰胺。结构域XIb:X广X广X3-G-g-Q-M-Q-D-A-I-P-T-X广A-V—X5A-A-F-|i(SEQIDNO:31)，其中Xt表示苏氨酸或谷氨酸或缬氨酸，其中X2指缬氨酸或异亮氨酸，其中X3指天冬氨酸或缬氨酸，其中X4指亮氨酸或异亮氨酸，其中Xs指亮氨酸或异亮氨酸。结构域XIc:G-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T(SEQIDNO:32)结构域XII:X「X广X厂X4-N-L-R-V-K-E-￡-D-)-X5(SEQIDNO:33)，其中X,表示缬氨酸或苏氨酸，其中X2表示谷氨酸或甘氨酸，其中X3表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X,表示丙氨酸或谷氨酸，其中Xs表示异亮氨酸或缬氨酸。结构域XIIa:P-Y-R-E(SEQIDNO:34)结构域XIIb:X「X2-X3-X4-N-L-R-V-K-E-E-D->-X5(SEQIDNO:35)，其中X!表示缬氨酸或苏氨酸，其中X2表示谷氨酸或甘氨酸，其中X3表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X4表示丙氨酸或谷氨酸，其中Xs表示异亮氨酸或缬氨酸。结构域XIIc:N-L-R-V-K-E-g-D-j(SEQIDNO:36)结构域XIII:E-G-D-D-L-X广X2(SEQIDNO:37)，其中X!表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X2表示缬氨酸或异亮氨酸。结构域XIV:XrP-X2-L-A-G(SEQIDNO:38),其中X!表示天冬氨酸或天冬酰胺，其中X2表示丙氨酸或丝氨酸或苏氨酸。结构域XV:A-X广I-D—X广X广X广ZH7-i(SEQIDNO:39)，其中X!表示亮氨酸或丝氨酸或谷氨酸，其中X2表示苏氨酸或丝氨酸，其中X3表示组氨酸或苯丙氨酸，其中x,表示丙氨酸或丝氨酸。结构域XVI:F-A-L-A-XrX2-X3-G-I(SEQIDNO:40)，其中X,表示甘氨酸或丙氨酸，其中X2表示异亮氨酸或缬氨酸，其中X3表示丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸或赖氨酸。结构域XVIa:F-A-L-A-X「L-(SEQIDNO:41)，其中X!表示甘氨酸或丙氨酸。结构域XVIb:L-&-X广X2-G-工(SEQIDNO:42)，其中l表示异亮氨酸或缬氨酸，其中X2表示丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸或赖氨酸。结构域XVII:-X广P-X广C-V-X3-f(SEQIDNO:43)，其中X:表示天冬酰胺或天冬氨酸，其中X,表示丙氨酸或天冬氨酸，其中X3表示丙氨酸或甘氨酸。结构域XVIII:XrS-L-G-V(SEQIDNO:44),其中X!表示丙氨酸或丝氨酸或脯氨酸。实施例20.对^X^进行基因工程改造用于植物转化通过PCR从全长的cDNA模板扩增g/^"开放阅读框(0RF)。在PCR过程中，将^2'/2dIII限制性位点加入至0RF的每个末端。另外，将核苷酸序列ACC加至紧挨基因的起始密码子的5'，以增强翻译效率(Kozak(1987)肠/e/cJc油Wesearc力15:8125-8148;Joshi(1987)Wwearc/15:6643-6653)。采用本领域熟知的技术将PCR产物克隆并测序，以确保在PCR过程中未引入突变。将含有gr^^PCR产物的质粒用例如III消化，并分离出含有完整的ORF的片段。在该实施例中，将所述片段克隆进质粒，例如pAX200的"'/2dIII位点，所述pAX200质粒是含有水稻肌动蛋白启动子(McElroy等，(1991)M7ecCe"".231:150-160)，以及PinII终止子(An爭，(1989)T7e户/a/^Ce771:115-122)的植物表达载体。然后，将来自该中间质粒的启动子-基因-终止子片段亚克隆进质粒例如pSBll(JapanTobacco公司)中，形成最终的质粒，在此称为pSBllGRG12。pSBllGRG12经组织而使得含有所述的启动子-gr^^-终止子构建体的DNA片段可通过合适的限制性内切酶切离，并也可用于例如通过空气束注射(aerosolbeaminjection)转化进植物中。pSBllGRG12的结构通过限制酶切消化和凝胶电泳，以及通过跨越多个克隆连接部位的测序来核实。采用本领域熟知的三亲杂交方法(triparentalmatingprocedure)，将该质粒导入还含有质粒pSBl(JapanTobacco公司)的根瘤农杆菌菌林LBA4404中，并涂布于含有抗生素的培养基上。质粒pSBllGRG12携带有奇霉素抗性，但却是一种窄宿主范围的质粒并且不能够在农杆菌中复制。当pSBllGRG12通过同源重组整合进宽宿主范围的质粒pSBl中时，产生了抗生素抗性菌落。得到的共整合体(cointegrate)产物通过DNA杂交校验。含有该共整合体的农杆菌菌林可用于例如通过Purelntro方法(JapanTobacco)转化玉米。实施例21.《ix2转化进植物细胞中玉米穗最好在授粉8-12天后收集。从玉米穗中分离出胚，并且将那些0.8-1.5mm大小的胚优选用于转化。将胚盾片侧朝上涂布于合适的孵育培养基，例如DN62A5S培养基(3.98g/LN6盐、lmL/L(1000x储液)N6维生素、800mg/LL-天冬酰胺、100mg/LMyo-肌醇、1.4g/LL-脯氨酸、100mg/L酪蛋白氨基酸、50g/L蔗糖、1mL/L(1mg/mL储液)2，4-D)上。然而，除了DN62A5S的培养基和盐也是合适的，并且是本领域所知的。将胚在25x:下于黑暗中孵育过夜。然而，在本质上是不必将胚孵育过夜的。将得到的外植体转移至网状方格(每平板30-40个)中，转移至渗透培养基(osmoticmedia)上约30-45分钟，然后转移至束流平板(beamingplate)上(参见，例如PCT出版物No.WO/0138514和美国专利No.5,240,842)。使用基本上如PCT出版物No.WO/0138514中描述的条件，用空气束加速器将设计用于在植物细胞中表达GRG12的DM构建体加速进入植物组织中。之后，将胚在渗透培养基中孵育约30分钟，并在25匸下于黑暗中置于孵育培养基中过夜。为了避免不当破坏被加速器处理过的外植体，将它们在转移至恢复培养基之前孵育至少24小时。然后，将胚分散到恢复阶段培养基中，约5天，25'C于黑暗中，随后转移至选择培养基。将外植体在选择培养基中孵育达到8周，这取决于所采用的特定选择的性质和特征。在选择阶段后，将得到的愈伤组织转移至胚成熟培养基中，直到观察到成熟的体细胞胚形成。随后，将得到的成熟的体细胞胚置于低光照下，并且通过本领域熟知的方法起始再生过程。让得到的小苗在生根培养基中生根，并且将得到的植物转移至苗圃罐中并繁殖为转基因植物。表6.DN62A5S培养基<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>用1NK0H/1NKC1将溶液的pH调节至pH5.8,加入浓度达到3g/L的Gelrite(Sigma)，并将培养基进行高压灭菌处理。在冷却至50"C后，力口入2ml/L的5mg/ml硝酸银储液(PhytotechnologyLabs)。实施例22.通过农杆菌-介导的转化将^x2转化进玉米植物细胞中穗最好在授粉8-12天后收集。从玉米穗中分离出胚，并且将那些0.8-1.5mm大小的胚优选用于转化。将胚盾片侧朝上涂布于合适的孵育培养基上，并在25x:下于黑暗中孵育过夜。然而，在本质上是不必将胚孵育过夜的。将胚与农杆菌菌林接触约5-10分钟，所述农杆菌菌林含有用于Ti质粒介导的转移的合适载体，并随后涂布于共培养培养基上约3天(在25C下于黑暗中)。在共同培养后，将外植体转移至恢复阶段培养基中约5天(在25C下于黑暗中)。将外植体在选择培养基中孵育达到8周，这取决于所采用的特定选择的性质和特征。在选择阶段后，将得到的愈伤组织转移至胚成熟培养基中，直到观察到成熟的体细胞胚形成。随后，将得到的成熟的体细胞胚置于低光照下，并且通过本领域熟知的方法起始再生过程。让得到的小苗在生根培养基中生根，并且将得到的植物转移至苗圃罐中并繁殖为转基因植物。在本说明书中提及的所有出版物和专利申请案表现了本发明所属领域的那些技术人员的技术水平。所有出版物和专利申请在此以相同的程度引入作为参考，就如同每一出版物或专利申请被明确和单独地引入作为参考一样。尽管为了理解的清楚已经通过说明和实施例的方式相当详细地描述了前述的发明，但是显然可以做出某些改变和修饰而不脱离所附的权利要求的范围。权利要求1.一种不同于在SEQIDNO1、3、7、45、47和53中列出的多核苷酸序列的分离的多核苷酸，所述的分离的多核苷酸编码具有至少一个选自以下的序列结构域的EPSPS酶结构域IL-A-K-G-X1-S-X2-L-X3-G-A-L-K-S-D-D-T(SEQIDNO13)，其中X1表示赖氨酸或苏氨酸，其中X2表示精氨酸或组氨酸，其中X3表示丝氨酸或苏氨酸；结构域IaL-A-K-G-X1(SEQIDNo14)，其中X1表示赖氨酸或苏氨酸；结构域IbS-X1-L-X2(SEQIDNO15)，其中X1表示精氨酸或组氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸；结构域IcG-A-L-K-S-D-D-T(SEQIDNO16)；结构域IIE-P-D-X1-X2-T-F-X3-V-X4-X5-X6-G(SEQIDNO17)，其中X1表示天冬氨酸或丙氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸，其中X3表示缬氨酸或异亮氨酸，其中X4表示苏氨酸或谷氨酸或赖氨酸，其中X5表示丝氨酸或甘氨酸，其中X6表示谷氨酰胺或丝氨酸或谷氨酸或苏氨酸；结构域IIaE-P-D-X1-X2-T-F-X3-V(SEQIDNO18)，其中X1表示天冬氨酸或丙氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸，其中X3表示缬氨酸或异亮氨酸；结构域IIbX1-X2-X3-G(SEQIDNO19)，其中X1表示苏氨酸或谷氨酸或赖氨酸，其中X2表示丝氨酸或甘氨酸，其中X3表示谷氨酰胺或丝氨酸或谷氨酸或苏氨酸；结构域IIIRFLTAA(SEQIDNO20)；结构域IVKRPI(G/M)P(SEQIDNO21)K-R-P-I-X1-P，其中X1表示甘氨酸或甲硫氨酸或亮氨酸；结构域VX1-G-C-P-P-V(SEQIDNO22)，其中X1表示苏氨酸或丝氨酸；结构域VII-G-A-X1-G-Y-X2-D-L-T(SEQIDNO23)，其中X1表示精氨酸或赖氨酸或亮氨酸，并且其中X2表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域VIIW-X1-V-X2-X3-T-G(SEQIDNO24)，其中X1表示精氨酸或赖氨酸，其中X2表示丙氨酸或组氨酸或谷氨酸或丝氨酸，其中X3表示脯氨酸或丙氨酸；结构域VIIIE-P-D-A-S-A-A-T-Y-L-W-X1-A-X2-X3-L(SEQIDNO25)，其中X1表示丙氨酸或甘氨酸，其中X2表示谷氨酸或谷氨酰胺，其中X3表示缬氨酸或亮氨酸或丙氨酸；结构域VIIIaE-P-D-A-S-A-A-T-Y-L-W(SEQIDNO26)；结构域IXI-D-X1-G(SEQIDNO27)，其中X1表示异亮氨酸或亮氨酸；结构域XF-X1-Q-P-D-A-K-A(SEQIDNO28)，其中X1表示苏氨酸或丝氨酸；结构域XIX1-F-P-X2-X3-X4-A-X5-X6-X7-G-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T-X8-A-V-X9A-A-F-N(SEQIDNO29)，其中X1表示谷氨酰胺或赖氨酸或丝氨酸，其中X2表示天冬酰胺或组氨酸，其中X3表示甲硫氨酸或亮氨酸，其中X4表示脯氨酸或谷氨酰胺，其中X5表示苏氨酸或谷氨酸或缬氨酸，其中X6表示缬氨酸或异亮氨酸，其中X7表示天冬氨酸或缬氨酸，其中X8表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X9表示亮氨酸或异亮氨酸；结构域XIaX1-F-P-X2-X3-X4-A(SEQIDNO30)，其中X1表示谷氨酰胺或赖氨酸或丝氨酸，其中X2表示天冬酰胺或组氨酸，其中X3表示甲硫氨酸或亮氨酸，其中X4表示脯氨酸或谷氨酰胺；结构域XIbX1-X2-X3-G-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T-X4-A-V-X5A-A-F-N(SEQIDNO31)，其中X1表示苏氨酸或谷氨酸或缬氨酸，其中X2表示缬氨酸或异亮氨酸，其中X3表示天冬氨酸或缬氨酸，其中X4表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X5表示亮氨酸或异亮氨酸；结构域XIcG-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T(SEQIDNO32)；结构域XIIP-V-R-F-X1-X2-X3-X4-N-L-R-V-K-E-C-D-R-X5(SEQIDNO33)，其中X1表示缬氨酸或苏氨酸，其中X2表示谷氨酸或甘氨酸，其中X3表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X4表示丙氨酸或谷氨酸，其中X5表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域XIIaP-V-R-F(SEQIDNO34)；结构域XIIbX1-X2-X3-X4-N-L-R-V-K-E-C-D-R-X5(SEQIDNO35)，其中X1表示缬氨酸或苏氨酸，其中X2表示谷氨酸或甘氨酸，其中X3表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X4表示丙氨酸或谷氨酸，其中X5表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域XIIcN-L-R-V-K-E-C-D-R(SEQIDNO36)；结构域XIIIE-G-D-D-L-X1-X2(SEQIDNO37)，其中X1表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X2表示缬氨酸或异亮氨酸；结构域XIVX1-P-X2-L-A-G(SEQIDNO38)，其中X1表示天冬氨酸或天冬酰胺，其中X2表示丙氨酸或丝氨酸或苏氨酸；结构域XVA-X1-I-D-X2-X3-X4-D-H-R(SEQIDNO39)，其中X1表示亮氨酸或丝氨酸或谷氨酸，其中X2表示苏氨酸或丝氨酸，其中X3表示组氨酸或苯丙氨酸，其中X4表示丙氨酸或丝氨酸；结构域XVIF-A-L-A-X1-L-K-X2-X3-G-I(SEQIDNO40)，其中X1表示甘氨酸或丙氨酸，其中X2表示异亮氨酸或缬氨酸，其中X3表示丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸或赖氨酸；结构域XVIaF-A-L-A-X1-L-K(SEQIDNO41)，其中X1表示甘氨酸或丙氨酸；结构域XVIbL-K-X1-X2-G-I(SEQIDNO42)，其中X1表示异亮氨酸或缬氨酸，其中X2表示丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸或赖氨酸；结构域XVII-X1-P-X2-C-V-X3-K(SEQIDNO43)，其中X1表示天冬酰胺或天冬氨酸，其中X2表示丙氨酸或天冬氨酸，其中X3表示丙氨酸或甘氨酸；结构域XVIIIX1-S-L-G-V(SEQIDNO44)，其中X1表示丙氨酸或丝氨酸或脯氨酸。2.权利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸选自a)SEQIDNO:9、11、55、57、58或60的核苷酸序列，或其互补序列；b)与SEQIDNO:9、11、57或59或61的核苷酸序列具有至少95%序列同一性的核苷酸序列，或其互补序列；c)以保藏号B-30833或B-30838保藏的质粒的DNA插入物的除草剂抗性核苷酸序列，或其互补序列；d)编码含有SEQIDNO:10、12、56或59的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；以及e)编码与SEQIDNO:10、12或59的氨基酸序列具有至少95%氨基酸序列同一性的多肽的核苷酸序列。3.权利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸连接至启动子，该启动子在植物细胞中起作用导致RNA序列的产生，该RNA序列-使得能充分表达编码的EPSPS酶，来增强用该多核苷酸转化的植物细胞的草甘膦耐受性。4.权利要求3的多核苷酸，所述的多核苷酸另外包含3，非翻译区，该3，非翻译区在植物细胞中起作用而导致将一段多腺苷酸化核普酸添加在RNA序列的3，末端。5.权利要求3的多核苷酸，其中所述的启动子相对于该多核苷酸是异源的。6.权利要求1的多核苷酸，其中所述的多核苷酸编码含有氨基-末端叶绿体转运肽和EPSPS酶的融合多肽。7.—种生产对草甘膦除草剂耐受的遗传转化植物的方法，所述的方法包括步骤a)将多核苷酸插入至植物细胞的基因组中，所述的多核苷酸含有i)启动子，其在植物细胞中起作用而导致RNA序列的产生，ii)不同于在SEQIDNO:7或53中列出的多核苷酸序列的多核苷酸，其导致编码BPSPS酶的RNA序列的产生，所迷的EPSPS酶具有至少一个选自以下的序列结构域结构域I:L-A-K-G-X「S-X2-L-X3-G-A-L-K-S-D-D-T(SEQIDNO:13)，其中X!表示赖氨酸或苏氨酸，其中X2表示精氨酸或组氨酸，其中Xs表示丝氨酸或苏氨酸；结构域la:L-A-K-G-X!,(SEQIDNo:14)，其中X,表示赖氨酸或苏氨酸；结构域lb:S-X「L-X2(SEQIDNO:15)，其中X,表示精氨酸或组氨酸,其中X2表示丝氨酸或苏氨酸；结构域Ic:G-A-L-K-S-D-D-T(SEQIDNO:16);结构域II:E-P-D-X广X广T-F-X广V-X广X广X6-G(SEQIDNO:17),其中X!表示天冬氨酸或丙氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸，其中X3表示缬氨酸或异亮氨酸，其中X4表示苏氨酸或谷氨酸或赖氯酸，其中Xs表示丝氨酸或甘氨酸，其中L表示谷氨酰胺或丝氨酸或谷氨酸或苏氨酸；结构域IIa:E-P-D-X「X广T-F-X广V(SEQIDNO:18)，其中X！表示天冬氨酸或丙氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸，其中X3表示缬氨酸或异亮氨酸；结构域lib:X「X广X「G(SEQIDNO:19)，其中X！表示苏氨酸或谷氨酸或赖氨酸，其中X2表示丝氨酸或甘氨酸，其中X3表示谷氨酰胺或丝氨酸或谷氨酸或苏氨酸；结构域III:肌TAA(SEQIDNO:20);结构域IV:，I(G/M)P(SEQIDNO:21)K-i-P-I-XrP，其中X:表示甘氨酸或甲硫氨酸或亮氨酸；结构域V:X「G-C-P-P-V(SEQIDNO:22)，其中X!表示苏氨酸或丝氨酸；结构域VI:I-G-A-X!-G-Y-X广D-L-T(SEQIDNO:23)，其中X,表示精氨酸或赖氨酸或亮氨酸，并且其中X2表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域VII:W-X广V-X广XrT-G(SEQIDNO:24)，其中X:表示精氨酸或赖氨酸,其中X2表示丙氨酸或组氨酸或谷氨酸或丝氨酸，其中X3表示脯氨酸或丙氨酸；结构域VIII:E-P-^A-S-A-A-T-Y-L+X广A-X广X3-L(SEQIDNO:25)，其中X!表示丙氨酸或甘氨酸，其中X2表示谷氨酸或谷氨酰胺，其中X3表示缬氨酸或亮氨酸或丙氨酸；结构域Villa:E-P-/"A-S-A-A-T-Y-L-W(SEQIDNO:26);结构域IX:I-D-X广G(SEQIDNO:27)，其中X!表示异亮氨酸或亮氨酸；结构域X:F-X广Q-P-D-A-K-A(SEQIDNO:28)，其中X!表示苏氨酸或丝氨酸；结构域XI:X「F-P-X2-X广X广A-X广X6-X厂G-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T-X8-A-V-X9A-A-F-N(SEQIDNO:29)，其中Xi表示谷氨酰胺或赖氨酸或丝氨酸，其中X2表示天冬酰胺或组氨酸，其中X3表示曱硫氨酸或亮氨酸，其中X,表示脯氨酸或谷氨酰胺，其中Xs表示苏氨酸或谷氨酸或缬氨酸，其中X6表示缬氨酸或异亮氨酸，其中X7表示天冬氨酸或缬氨酸，其中Xs表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X,表示亮氨酸或异亮氨酸；结构域XIa:X「F-P-X2-X3-X4-A(SEQIDNO:30)，其中X!表示谷氨酰胺或赖氨酸或丝氨酸，其中X2表示天冬酰胺或组氨酸，其中X3表示甲硫氨酸或亮氨酸，其中1表示脯氨酸或谷氨酰胺；结构域XIb:X)-X广X广G-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T-X广A-V-X5A-A-F-N(SEQIDNO:31)，其中Xi表示苏氨酸或谷氨酸或缬氨酸，其中X2指缬氨酸或异亮氨酸，其中X3指天冬氨酸或缬氨酸，其中l指亮氨酸或异亮氨酸，其中Xs指亮氨酸或异亮氨酸；结构域XIc:G-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T(SEQIDNO:32);结构域XII:P-V-R-F-X广X广X3-X4-N-L-R-V-K-E-C-IKff-X5(SEQIDN0:33)，其中X!表示缬氨酸或苏氨酸，其中X2表示谷氨酸或甘氨酸，其中X3表示亮氨酸或异亮氨酸，其中t表示丙氨酸或谷氨酸，其中Xs表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域XIIa:P-V-R-F(SEQIDNO:34);结构域XIIb:X「XfX3_X4-N-L-R-V-K-E-C-D-H(SEQIDNO:35)，其中X,表示缬氨酸或苏氨酸，其中X2表示谷氨酸或甘氨酸，其中X3表示亮氨酸或异亮氨酸，其中L表示丙氨酸或谷氨酸，其中Xs表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域XIIc:N-L-R-V+E-C-D-i(SEQIDNO:36);结构域XIII:E-G-D-D-L-X「X2(SEQIDNO:37),其中X!表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X2表示缬氨酸或异亮氨酸；结构域XIV:X广P-XfL+G(SEQIDNO:38)，其中Xi表示天冬氨酸或天冬酰胺，其中Xs表示丙氨酸或丝氨酸或苏氨酸；结构域XV:A-X广I-D-X广X广X广/H7-i(SEQIDNO:39)，其中X!表示亮氨酸或丝氨酸或谷氨酸，其中X2表示苏氨酸或丝氨酸，其中X3表示组氨酸或苯丙氨酸，其中X,表示丙氨酸或丝氨酸；结构域XVI:F-A-L-A-X广L-K-X广X3-G-I(SEQIDNO:40)，其中X！表示甘氨酸或丙氨酸，其中X2表示异亮氨酸或缬氨酸，其中X3表示丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸或赖氨酸；结构域XVIa:F+L-A-X广L-K(SEQIDNO:41)其中X,表示甘氨酸或丙氨酸;结构域XVIb:L-K-X「X广G-I(SEQIDNO:42)，其中X!表示异亮氨酸或缬氨酸，其中X2表示丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸或赖氨酸；结构域XVII:-X广P-X广C-V-X广f(SEQIDNO:43),其中X!表示天冬酰胺或天冬氨酸，其中X2表示丙氨酸或天冬氨酸，其中X3表示丙氨酸或甘氨酸；结构域XVIII:X,-S-L-G-V(SEQIDNO:44),其中X:表示丙氨酸或丝氨酸或脯氨酸；iii)3，非翻译多核普酸，其在植物细胞中起作用而导致一段多腺苷酸化核苷酸添加在RNA序列的3，末端；b)获得转化的植物细胞；以及c)从转化的植物细胞再生具有增强的草甘膦除草剂耐受性的遗传转化植物。8.权利要求7的方法，其中获得转化的植物包括筛选增强的草甘膦除草剂耐受性。9.权利要求7的方法，其中所述的多核苷酸编码含有氨基-末端叶绿体转运肽和EPSPS酶的融合多肽。10.—种草甘膦耐受的植物细胞，所述的植物细胞含有权利要求1的异源多核苷酸。11.权利要求10的草甘膦耐受的植物细胞，所述的植物细胞选自玉米、小麦、水稻、大麦、大豆、棉花、甜菜、油菜、芸莒、亚麻、向曰葵、马铃薯、烟草、番茄、苜蓿、杨树、松树、桉树、苹果树、莴苣、豌豆、小扁豆、葡萄和草冲草。12.—种含有权利要求10的植物细胞的草甘膦耐受植物。13.权利要求12的植物的转化种子。14.权利要求12的草甘膦耐受植物，所述的植物选自玉米、小麦、水稻、大麦、大豆、棉花、甜菜、油菜、芸苜、亚麻、向日葵、马铃薯、烟草、番茄、苜蓿、杨树、松树、桉树、苹果树、莴苣、豌豆、小扁豆、葡萄和草冲草。15.—种分离的多肽，所述的多肽选自a)含有SEQIDNO:10、12、56或59的氨基酸序列的多肽；b)由SEQIDNO:9、11、55、57、58或60的核苷酸序列编码的多肽；c)含有与SEQIDNO:10、12或59的氨基酸序列具有至少95%序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中所述的多肽具有抗除草剂活性；d)通过与SEQIDNO:9、11、57、58或60的核苷酸序列至少95%一致的核苷酸序列编码的多肽，其中所述的多肽具有抗除草剂活性；以及，e)由质粒的DM插入物的抗除草剂核苷酸序列编码的多肽，所述的质粒以保藏号B-30833或B-30838保藏。16.权利要求15的多肽，所述的多肽还含有异源氨基酸序列。17.—种用于选择性控制有植物种子或植物的田地中的杂草的方法，所述的方法包括a)栽培草甘膦耐受的种子或植物，所述的植物或种子已将含有异源多核苷酸的多核苷酸整合进它们的基因组中，所述的异源多核苷酸具有i)启动子，其在植物细胞中起作用而导致RNA序列的产生；ii)不同于在SEQIDNO:7或53中列出的多核苷酸序列的多核苷酸，其导致编码EPSPS酶的RNA序列的产生，所述的EPSPS酶具有至少一个选自以下的序列结构域结构域I:L-A-K-G-X)-S-X广L-X广G-A-L-K-S-D-D-T(SEQIDNO:13)，其中X,表示赖氨酸或苏氨酸，其中X2表示精氨酸或组氨酸，其中X3表示丝氨酸或苏氨酸；结构域la:L-A-K-G-Xl(SEQIDNo:14)，其中X!表示赖氨酸或苏氨酸；结构域lb:S-X「L-X2(SEQIDNO:15)，其中X!表示精氨酸或组氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸；结构域Ic:G+L-K-S+D-T(SEQIDNO:16);结构域II:E-P-D-XfX2-T-F-X3-V-X4-X5-X6-G(SEQIDNO:17)，其中Xi表示天冬氨酸或丙氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸，其中X3表示缬氨酸或异亮氨酸，其中X,表示苏氨酸或谷氨酸或赖氨酸，其中Xs表示丝氨酸或甘氨酸，其中X6表示谷氨酰胺或丝氨酸或谷氨酸或苏氨酸；结构域IIa:E-P-D-X广X广T-F-X3-V(SEQIDNO:18)，其中X!表示天冬氨酸或丙氨酸，其中X2表示丝氨酸或苏氨酸，其中X3表示缬氨酸或异亮氨酸；结构域lib:X「X广X3-G(SEQIDNO:19)，其中X!表示苏氨酸或谷氨酸或赖氨酸，其中X2表示丝氨酸或甘氨酸，其中X3表示谷氨酰胺或丝氨酸或谷氨酸或苏氨酸；结构域III:肌TAA卿IDNO:20);结构域IV:，1(G/M)P卿IDNO:21)K-v-P-I-XrP,其中)d表示甘氨酸或甲硫氨酸或亮氨酸；结构域V:X广G-C-P-P-V(SEQIDNO:22)，其中X!表示苏氨酸或丝氨酸；结构域VI:I-G-A-X广G-Y-X2-D-L-T(SEQIDNO:23)，其中X:表示精氨酸或赖氨酸或亮氨酸，并且其中X2表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域VII:W-X「V-X2-X3-T-G(SEQIDNO:24)，其中X:表示精氨酸或赖氨酸，其中X2表示丙氨酸或组氨酸或谷氨酸或丝氨酸，其中X3表示脯氨酸或丙氨酸；结构域VIII:E-P-ZHV-S-A-A-T-Y-L-W-X广A-X2-X3-L(SEQIDNO:25)，其中X!表示丙氨酸或甘氨酸，其中X2表示谷氨酸或谷氨酰胺，其中X3表示缬氨酸或亮氨酸或丙氨酸；结构域Villa:E-P-Z^A-S-A-A-T-Y-L-W(SEQIDNO:26);结构域IX:I-D-X广G(SEQIDNO:27),其中X!表示异亮氨酸或亮氨酸；结构域X:F-X广Q-P-D-A-K-A(SEQIDNO:28)，其中X!表示苏氨酸或丝氨酸；结构域XI:XrF-P-XfXfXrA—Xs-Xe—X^G-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T-Xs-A-V-X9A-A-F-N(SEQIDNO:29),其中t表示谷氨酰胺或赖氨酸或丝氨酸，其中X2表示天冬酰胺或组氨酸，其中L表示甲硫氨酸或亮氨酸，其中X4表示脯氨酸或谷氨酰胺，其中Xs表示苏氨酸或谷氨酸或缬氨酸，其中X6表示缬氨酸或异亮氨酸，其中X7表示天冬氨酸或缬氨酸，其中Xs表示亮氨酸或异亮氨酸，其中X,表示亮氨酸或异亮氨酸；结构域XIa:X,-F-P-X2-X3-X广A(SEQIDNO:30)，其中X〗表示谷氨酰胺或赖氨酸或丝氨酸，其中X2表示天冬酰胺或组氨酸，其中X3表示甲硫氨酸或亮氨酸，其中X,表示脯氨酸或谷氨酰胺；结构域XIb:X广X广X3一G一S-Q-M-(hD-A-I一P一T—X广A-V-X5A-A—F-N(SEQIDNO:31)，其中Xi表示苏氨酸或谷氨酸或缬氨酸，其中X2指缬氨酸或异亮氨酸，其中X3指天冬氨酸或缬氨酸，其中X4指亮氨酸或异亮氨酸，其中Xs指亮氨酸或异亮氨酸；结构域XIc:G-S-Q-M-Q-D-A-I-P-T(SEQIDNO:32);结构域XII:P-V-R-F-X!-X2-X3-X4-N-L+V-K-E-C-D-H5(SEQIDNO:33)，其中X!表示缬氨酸或苏氨酸，其中X2表示谷氨酸或甘氨酸，其中X3表示亮氨酸或异亮氨酸，其中L表示丙氨酸或谷氨酸，其中Xs表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域XIIa:P-V-R-F(SEQIDNO:34);结构域XIIb:Xi-X2-X广X广N-L-R-V-K-E-C-D-W-X5(SEQIDNO:35)，其中X!表示缬氨酸或苏氨酸，其中X2表示谷氨酸或甘氨酸，其中L表示亮氨酸或异亮氨酸，其中L表示丙氨酸或谷氨酸，其中Xs表示异亮氨酸或缬氨酸；结构域XIIc:N-L+V-K-E-C-D-y(SEQIDNO:36);结构域XIII:E-G-D-D-L-X广t(SEQIDNO:37)，其中l表示亮氨酸或异亮氨酸，其中&表示缬氨酸或异亮氨酸；结构域XIV:X广P-X广L-A-G(SEQIDNO:38)，其中Xi表示天冬氨酸或天冬酰胺,其中X2表示丙氨酸或丝氨酸或苏氨酸；结构域XV:A-X「I-D-X2-X3-X4-M(SEQIDNO:39)，其中X!表示亮氨酸或丝氨酸或谷氨酸，其中X2表示苏氨酸或丝氨酸，其中X3表示组氨酸或苯丙氨酸，其中X,表示丙氨酸或丝氨酸；结构域XVI:F-A-L-A-X广L-K-X广X厂G-I(SEQIDNO:40)，其中表示甘氨酸或丙氨酸，其中X2表示异亮氨酸或缬氨酸，其中X3表示丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸或赖氨酸；结构域XVIa:F-A-L-A-X「L-K(SEQIDNO:41)，其中X:表示甘氨酸或丙氨酸；结构域XVIb:L-K-X「X2-G-I(SEQIDNO:42)，其中X:表示异亮氨酸或缬氨酸，其中X2表示丝氨酸或甘氨酸或丙氨酸或赖氨酸；结构域XVII:-X广P-X广C-V-X3-/(SEQIDNO:43)，其中X!表示天冬酰胺或天冬氨酸，其中X2表示丙氨酸或天冬氨酸，其中X3表示丙氨酸或甘氨酸；结构域XVIII:X广S-L-G-V(SEQIDNO:44)，其中X!表示丙氨酸或丝氨酸或脯氨酸；iii)3，非翻译多核苷酸，其在植物细胞中起作用而导致一段多腺苷酸化核苷酸添加在RNA序列的3，末端；以及b)施用给田间的植物和杂草足够量的草甘膦除草剂，来控制杂草而不会显著地影响植物。18.权利要求17的方法，其中所述的植物或植物种子包括农作物。19.权利要求17的方法，其中所述的启动子相对于所述多核苷酸是异源的，并且适用于导致EPSPS酶的充分表达来增强用该多核苷酸转化的植物的草甘膦耐受性。20.—种生产对草甘膦除草剂耐受的遗传转化植物的方法，所述的方法包括步骤a)将权利要求1的多核苷酸插入至植物细胞的基因组中；b)获得转化的植物细胞；以及c)从转化的植物细胞再生出具有增强的草甘膦除草剂耐受性的遗传转化植物。21.—种产生对草甘膦耐受的遗传转化植物的方法，所述的方法包括用含有选自SEQIDN0:1、3、9、11、45、47、55、57、58或60的多核苷酸的DNA构建体转化植物细胞，以及再生转化的植物。22.权利要求21的方法，其中所述的DM构建体还含有启动子，该启动子在植物细胞中起作用而导致RNA序列的产生，所述RNA序列使得能充分表达编码的EPSPS酶，来增强用该多核苷酸转化的植物细胞的草甘膦耐受性。23.权利要求21的方法，其中所述的多核苷酸编码含有氨基-末端叶绿体转运肽和EPSPS酶的融合多肽。24.—种草甘膦耐受的植物细胞，所述的植物细胞含有选自SEQIDN0:1、3、9、11、45、47、55、57、58和60的多核苷酸。25.权利要求24的草甘膦耐受的植物细胞，所述的植物细胞选自玉米、小麦、水稻、大麦、大豆、棉花、甜菜、油菜、芸莒、亚麻、向曰葵、马铃薯、烟草、番茄、苜蓿、杨树、松树、桉树、苹果树、莴苣、豌豆、小扁豆、葡萄和草坪草。26.—种含有权利要求24的植物细胞的草甘膦耐受植物。27.权利要求26的草甘膦耐受植物，所述的植物选自玉米、小麦、水稻、大麦、大豆、棉花、甜菜、油菜、芸苜、亚麻、向日葵、马铃薯、烟草、番茄、苜蓿、杨树、松树、桉树、苹果树、莴苣、豌豆、小扁豆、葡萄和草坪草。28.权利要求26的植物的转化种子。29.—种用于选择性控制具有种植的种子或植物的田地中的杂草的方法，所述的方法包括a)栽培权利要求26的植物或源自其的转化种子，以及b)施用给田间的植物和杂草足够量的草甘膦除草剂，来控制杂草而不会显著地影响植物。30.权利要求29的方法，其中所述的植物或植物种子包括农作物。31.权利要求29的方法，其中所述的多核苷酸编码含有氨基-末端叶绿体转运肽和EPSPS酶的融合多肽。全文摘要提供了用于赋予细菌、植物、植物细胞、组织和种子草甘膦耐受性的组合物和方法。所述组合物包含一类称为III型的新型EPSPS酶，和编码该酶的多核苷酸、含有那些多核苷酸的载体，以及含有该载体的宿主细胞。这种新的蛋白质含有至少一个选自在此提供的III型结构域的序列结构域。这些序列结构域可用来鉴定具有抗草甘膦活性的EPSP合酶。文档编号C12N9/10GK101175850SQ200680016320公开日2008年5月7日申请日期2006年4月7日优先权日2005年4月8日发明者B·卡尔,N·卡洛兹,P·E·哈默申请人:阿则耐克斯公司