专利名称：：尿酸氧化酶的变体形式及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及遗传修饰的具有尿酸分解活性的蛋白质。更具体的说，本发明涉及包含截短的尿酸氧化酶的蛋白质及其生产方法。
背景技术：
：术语尿酸氧化酶(urateoxidase)和尿酸酶(uricase)在本文中可互换使用。尿酸氧化酶(尿酸酶；E.C.1.7.3.3)这种酶能催化尿酸氧化成更具可溶性的产物尿嚢素，尿嚢素是更容易排泄的嘌呤代谢物。人不会产生有酶活性的尿酸酶，这是因为在高等灵长类的进化过程中获得的尿酸酶基因的几个突变所致。Wu,X等，(l"2)/Mo/￡w/34:78-84，该文献通过引用整体结合到本文中。因此，在易感个体中，血液中过量浓度的尿酸(高尿酸血症)会导致疼痛性关节炎(痛风)、毁形性尿酸沉积(结节瘤)和肾衰竭。在一些受侵害个体中，可用的药物如别噪醇(尿酸合成的抑制剂)会产生治疗限制性副作用，或者不能充分减轻这些病症。Hande,KR等，(1984)爿mJA/ed76:47-56;Fam，AG,(1990)Sa"/ze/rSa/7ewwato/4:177-192,每个文献通过引用整体结合到本文中。尿酸酶注射能减少高尿酸血症和高尿酸尿症，至少是短暂地减少。由于尿酸酶在人体中是异种蛋白，在几个百分比的受治疗患者中，即4吏是第一次注射来自黄曲霉(^^7ergz〃w"avw力的未修饰蛋白质就会引起过敏反应(Pui，C-H等，(1997)丄ewy^wz力11:1813-1816,该文献通过引用整体结合到本文中)，免疫应答限制其用于长期或间歇治疗的效用。Donadio,D等，(1981)Wowv10:711-712;Leaustic,M等，(1983)Aev朋腦她/(9对,r"c50:553-554，每个文献通过引用整体结合到本文中。人们认识到可用的高尿酸血症治疗法的次优性能已有几十年。Kissel,P等，(1968)A^mm217:72-74，该文献通过引用整体结合到本文中。同样，人们认识到某些严重痛风症患者群体可从安全和有效形式的可注射尿酸酶受益的可能性也有几十年了。Davis,FF等，(1978)，见GBBroun等，(Eds.)五"gwee"力g，Fo/.4(第169-173页)NewYork,PlenumPress;Nishimura,H等，(1979)五"27me24:261-264;Nishimura,H等，(1981)26:49-53;Davis,S等，(1981)La"cef2(8241):281-283;Abuchowski,A等，(1981)/尸/3arwac0/77"219:352-354;Chen,RH國L等，(1981)说0c/2z附说op/"'660:293-298;Chua,CC等，(1988)/^Mo/109:l14-117;Greenberg,ML等，(]兆9)爿憩/说oc/ewn6:290-293,每个文献通过引用整体结合到本.文中。衍自动物器官的尿酸酶几乎不可溶于适宜于安全注射给药的溶剂中。美国专利第3,616,231号，该专利通过引用整体结合到本文中。某些衍自植物或微生物的尿酸酶更可溶于医学上可接受的溶剂中。但是，微生物酶的注射会快速引起免疫应答，该免疫应答可能会导致致命性变态反应或导致尿酸酶的失活和/或从循环中的加速清除。Donadio等，(1981);Leaustic等，(1983)。基于来自哺乳动物(包括猪和狒狒)或来自昆虫(例如黑腹果蝇(Dra^^/ntowe/a脂ga^er)或拟暗果蜆(Drayo//,7a戸racfooZwcwra))的尿酸酶推导氨基酸序列的酶(Wallrath,LL等，(1990)編Ce//倫/10:5114-5127,该文献通过引用整体结合到本文中)，由于免疫原性和在生理pH下不溶性的问题，未能成为临床使用的合适候选者。之前，研究者已使用注射的尿酸酶来体内催化尿酸向尿嚢素的转化。参见Pui等，(1997)。这在法国和意大利是来自真菌黄曲霉的尿酸酶(Uricozyme⑧)的以下应用的基础预防或临时矫正血液恶性月中瘤的细胞毒性疗法所伴随出现的高尿酸血症，和短暂减少痛风患者的严重高尿酸血症。Potaux,L等，(1975)WowvA/e"4:1109-1112;Legoux，R等，(1992)J肠/C7^w267:8565-8570;美国专利第5,382,518号和第5,541,098号,每个文献通过引用整体结合到本文中。Uricozyme⑧由于循环寿命短，需要每日进行注射。此外，由于其免疫原性，它不能很好地适合于长期疗法。某些尿酸酶可用于制备与聚乙二醇或聚环氧乙烷(两者都称为PEG)的缀合物，以生产蛋白质半寿期增加和免疫原性减少的治疗上有效形式的尿酸酶。美国专利第4,179,337号、第4,766,106号、第4,847,325号和第6,576，235号；美国专利申请出版物US2003/0082786A1,每个专利通过引用整体结合到本文中。尿酸酶与PEG之外的聚合物的缀合物也已有描述。美国专利第4,460,683号，该专利通过引用整体结合到本文中。在几乎所有报道的试图PEG化尿酸酶(即将PEG共价偶联到尿酸酶)的尝试中，主要将PEG连接到氨基，包括氨基末端残基和和可用的赖氨酸残基。在常用的尿酸酶中，四个相同亚单位的每一个中的赖氨酸总数在25(黄曲霉(美国专利第5,382，518号,该专利通过引用整体结合到本文中))至29(猪(Wu,X等，(1989)ProcNatlAcadSciUSA86:9412-9416,该文献通过引用整体结合到本文中)之间。一些赖氨酸在酶的天然构象下并不可供进行PEG化。最普通的减少尿酸酶免疫原性的方法是将大量的低分子量PEG链进行偶联。这总是导致所产生的缀合物的酶活性大大降低。在五名平均注射前血清尿酸浓度为6.2mg/dl(在正常范围内)的人受试者中，单次静脉内注射偶联到5kDaPEG的产朊假丝酵母(a7"&^M"/,力尿酸酶的制剂，将血清尿酸减少到了不可检测的水平。Davis等，(1981)。四星期后受试者接受了再次注射，但他们的反应没有得到报道。在第二次(也是最后一次)注射后，用相对不灵敏的凝胶扩散测定法没有检测出抗尿酸酶抗体。该参考文献没有报道人患者或实验动物的长期或次长期治疗的结果。使用偶联到5kDaPEG的原玻璃蝇节杆菌04rt/ra6acfe厂proto/o/7m'"e)尿酸酶的制品，来临时控制注射前血清尿酸浓度为15mg/dL的单个淋巴瘤患者的高尿酸血症。Chua等，(1988)。由于该患者的病情危急和治疗时间短(14天时间里注射四次)，不可能评估该缀合物的长期功效或安全性。通过用2-10个高分子量PEG(>5kD-120kD)链修饰每个尿酸酶亚单位，实现了保护尿酸酶免受免疫识别方面的改进。Saifer等(美国专利6,576,235;(1994)AdvExpMedBiol366:377-387,各文献通过引用结合到本文中)。这个策略使来自各种物种的尿酸酶的酶活性在PEG化后能够保持>75%，提高了尿酸酶的循环寿命，且使该酶能够在小鼠和兔中重复注射而又不引起抗体。Hershfield和Kelly(国际专利出版物WO00/08196;美国专利申请号60/095,489,这两个专利通过引用整体结合到本文中)开发了提供具有最佳数量PEG化位点的重组哺乳动物尿酸酶蛋白的方法。他们使用PCR技术来增加酶上选定位置处的可用赖氨酸残基的数量，该数量设计来实现酶在随后的PEG化后被免疫系统的识别减少，同时基本上保持酶的尿酸分解活性。他们的尿酸酶蛋白质中有一些在羧基末端和/或氨基末端被截短。他们没有提出蛋白质中其它具体的遗传诱导改变方面的指导。在本申请中，术语"免疫原性"指注射的PEG修饰或未修饰尿酸酶(抗原)的制剂对免疫应答的诱导，而"抗原性"指抗原与先前存在的抗体的反应。抗原性和免疫原性统称"免疫反应性"。在之前的PEG-尿酸酶研究中，免疫反应性通过多种方法来评估，包括l)PEG-尿酸酶与先前形成的抗体的体外反应；2)诱导的抗体合成的测量；和3)反复注射后的加速清除率。先前试图通过籍各种接头来偶联各种数量的PEG链，以消除几种来源的尿酸酶的免疫原性的尝试，成效有限。PEG-尿酸酶最初由FFDavis和由YInada及其同事公开。Davis等，(1978);美国专利第4,179,337号；Nishimura等，(1979);日本专利第55-99189和第62-55079号，每个文献和专利通过引用整体结合到本文中。美国专利第4,179，337号中公开的缀合物是通过使未指明来源的尿酸酶与2,000倍摩尔过量的750道尔顿PEG反应来合成的，表明有大量的聚合物分子很可能连接到了每个尿酸酶亚单位。美国专利第4,179,337号公开了分子量为500-20,000道尔顿、优选约500-5,000道尔顿的PEG或聚丙二醇的偶联，以提供各种多肽激素和酶(包括氧化还原酶，其中尿酸酶是三个实例中的一个)的活性、水溶性、非免疫原性缀合物。另外，美国专利第4，179,337号强调每个酶分子偶联10-100个聚合物链，至少40%的酶活性得到保持。没有报道PEG偶联至尿酸酶可用氨基的程度、缀合物的残余比尿酸分解活性或免疫原性的试验结果。在之前的出版物中，体外测出的尿酸分解活性的显著下降是将各种数量的PEG链偶联到产朊假丝酵母尿酸酶所造成的。如在Chen的出版物和同一小组的专题讨论会报告中所述，将大量的5kDaPEG链偶联到猪肝尿酸酶得出类似的结果。Chen等，(19M);Davis等，(1978)。在七个之前的研究中，据报道PEG化降低尿酸酶的免疫反应性，在五个其它研究中被消除。在后面五个研究中的三个中，免疫反应性的消除伴随着尿酸分解活性的极度降低——降低至初始活性的至多15%、28%或45%。Nishimura等，(1979)(15。/。活性)；Chen等，(1981)(28%活性)；Nishimura等，(1981)(45%活性)。在第四报告中，PEG据报道偶联到61%的可用赖氨酸残基，但没有述及残余比活性。Abuchowski等，(1981)。但是，一包括该两名科学家并使用相同方法的研究小组在别处报道说，这个偶联程度致使残余活性只剩下23-28%。Chen等，(1981)。Abuchowski等和Chen等1981年的出版物指出，为大大减少尿酸酶的免疫原性，PEG必须偶联到大约60%的可用赖氨酸残基。第五个出版物报道说尿酸酶的免疫反应性已被消除，但没有公开PEG偶联程度、残余尿酸分解活性或PEG-蛋白质键合的性质。Veronese,FM等，(1997)，见JMHarris等，(编辑)，Poly(ethyleneglycol)ChemistryandBiologicalApplications.ACSSymposiumSeries680(第182-192页)Washington,DC:AmericanChemicalSociety,该文献通过引用整体结合到本文中。在实验动物中，将PEG缀合到尿酸酶中较少部分的赖氨酸残基，减少但并没有消除尿酸酶的免疫反应性。Tsuji,J等，(1985)IntJImmimopharmacol7:725-730,该文献通过引用整体结合到本文中(28-45%的氨基酸发生偶联)；Yasuda,Y等，(1990)ChemPharmBull38:2053-2056,该文献通过引用整体结合到本文中(38%的氨基酸发生偶联)。相应加合物的残余尿酸分解活性在它们初始值的<33%(Tsuji等)至60%(Yasuda等)之间。Tsuji等除用5kDaPEG夕卜，还用7.5kDa和10kDaPEG合成了PEG-尿酸酶缀合物。所有得到的缀合物都具有一些免疫原性和抗原性，同时显示酶活性明显减少。两次安全地给予五个人中每一个的产朊假丝酵母尿酸酶的PEG化制剂，据报道其只保持其初始活性的11°/。。Davis等，(1981)。几年后，将PEG修饰的原玻璃蝇节杆菌尿酸酶四次给予一名晚期淋巴瘤和严重高尿酸血症患者。Chua等，(1988)。虽然该酶制剂的残余活性没有进行测量，但Chua等用酶联免疫吸附测定(ELISA)证实，在第一次PEG-尿酸酶注射后26天，患者血清中没有抗尿酸酶抗体存在。之前有关PEG化尿酸酶的研究表明，通过偶联大量的PEG链来大大降低尿酸酶的免疫反应性，其催化活性也明显降低。此外，大多数之前的PEG-尿酸酶制剂用氰尿酰氯活化的PEG合成，氰尿酰氯是一种三。秦衍生物(2,4，6-三氯-l，3，5-三嗪)，已证实它在兔中能引入新的抗原决定簇和诱导抗体的形成。Tsiyi等，(1985)。ASano等的日本专利第3-l48298号(该专利通过引进整体结合到本文中)公开了用分子量为1-12kDa的PEG衍生化的修饰蛋白质(包括尿酸酶)，其显示降低的抗原性和"改进的延长的"作用，该专利还公开了制备这种衍生化肽的方法。但是，在链计数、酶测定、生物试验或"改进的延长的"含义方面没有进行公开。YInada的日本专利55-99189和62-55079(这两个专利通过引用整体结合到本文中)分别公开了用PEG-三嗪或双PEG-三嗪(表示为PEG力制备的尿酸酶缀合物。参见Nishimura等，(1979和1981)。在第一种类型的缀合物中，PEG的分子量是2kDa和5kDa,而在第二种中，只使用5kDaPEG。Nishimura等，(1979)报道说，用线性5kDaPEG修饰43%的可用赖氨酸后回收到15%的尿酸分解活性，而Nishimura等，(1981)报道说，用PEG2分别修饰46%或36。/。的赖氨酸后回收到31%或45%的尿酸分解活性。先前研究的尿酸酶蛋白是天然蛋白质或重组蛋白质。但是，使用SDS-PAGE和/或蛋白质印迹技术进行的研究揭示了意想不到的低分子量肽的存在，这些肽似乎是降解产物，随时间推移出现频率增加。本发明涉及发生截短和结构稳定性增强的突变重组尿酸酶蛋白。发明概述本发明提供新型的重組尿酸酶蛋白。在一个实施方案中，所设想的本发明蛋白质相对于天然尿酸酶蛋白是截短的，且具有突变的氨基酸。在具体的实施方案中，突变在氨基酸7、46、291和301的分。本发明提供突变重组尿酸酶，其中所述尿酸酶已截短1-20个氨基酸，并保持天然尿酸酶的尿酸分解活性。截短出现在序列末端处或周围，这样蛋白质可含有终末氨基酸。这些突变和截短可增强包含这种突变的蛋白质的稳定性。在另一个实施方案中，本发明提供代谢尿酸的方法，所述方法包括给予具有尿酸分解活性的新型重组尿酸酶蛋白。尿酸分解活性在本文中用以指尿酸向尿嚢素的酶促转化。本发明还提供宿主细胞，其有能力产生已截短1-20个氨基酸且具有突变的氨基酸并保持尿酸分解活性的尿酸酶。在一个实施方案中，提供了分离的截短的哺乳动物尿酸酶，其包含在氨基末端或羧基末端或在氨基和羧基末端两者截短约1-13个氨基酸的哺乳动物尿酸酶氨基酸序列，还包含在大约46位处的氨基酸置换。在具体的实施方案中，所述尿酸酶包含氨基末端氨基酸，其中所述氨基末端氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。本发明还提供其中在大约46位处具有苏氨酸或丙氨酸置换的尿酸酶。在一个实施方案中，所述尿酸酶包含SEQIDNO.8氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述尿酸酶与聚合物缀合形成例如聚乙二醇-尿酸酶缀合物。在具体的实施方案中，聚乙二醇-尿酸酶缀合物在每个尿酸酶亚单位上包含2-12个聚乙二醇分子，优选每个尿酸酶亚单位3-10个聚乙二醇分子。在具体的实施方案中，聚乙二醇-尿酸酶缀合物的每个聚乙二醇分子的分子量为约1kD至100kD、约1kD至50kD、约5kD至20kD或约10kD。本发明还提供包含本发明尿酸酶(包括聚乙二醇-尿酸酶缀合物)的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物适合于反复给药。本发明还提供减少有需要受试者的生物流体中尿酸水平的方法，所述方法包括给予包含本发明尿酸酶的药物组合物。在具体的实施方案中，生物流体是血液。在一个实施方案中，所述尿酸酶包含具有猪-KS-AN的44位至56位序列的肽(SEQIDNO.44)。在一个实施方案中，羧酸尿酸酶蛋白包含N末端曱硫氨酸。在一个具体的实施方案中，该尿酸酶包含SEQIDNO.7的氨基酸序列。本发明还提供分离的核酸，其包含编码本发明尿酸酶的核酸序列，所述尿酸酶例如具有或包含SEQIDNO.7、SEQIDNO.8、SEQIDNO.12或SEQIDNO.13的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述分离的核酸有效连接到异源启动子，例如osmB启动子。本发明还提供包含尿酸酶编码核酸的载体和包含这种载体的宿主细胞。在一个实施方案中，所述核酸具有SEQIDNO.7的序列。本发明还提供产生尿酸酶的方法，所述方法包括在尿酸酶得以被宿主细胞表达的条件下培养宿主细胞以及分离表达的尿酸酶的步骤。附图简述图1说明质粒pOUR-P-AN-ks-l的结构。限制位点旁的数字表示核香酸位置，该位置相对于指定为1的HaeH位点而言。在克隆过程中丢失的限制位点在括号中标出。图2显示猪-KS-AN尿酸酶的DNA和推导氨基酸序歹'j(分别为SEQIDNO.9和SEQIDNO.7)。图2中的氨基酸编号是相对于完全猪尿酸酶序列进行的。在起始密码子曱硫氨酸残基之后，苏氨酸置换猪尿酸酶序列中的天冬氨酸7。指出了用于亚克隆的各个步骤的限制位点。3'非翻译序列用小写字母显示。翻译终止密码子由星号表示。图3显示各种重组猪(SEQIDNO.ll)、PBC-ANC(SEQIDNO.12)和猪-KS-AN(SEQIDNO.7)尿酸酶序列的推导氨基酸序列的相对比对。星号表示与公开的猪尿酸酶序列相比猪-KS-AN中氨基酸有差异的位置；圓圈表示与PBC-AN相比猪-KS-厶N中氨基酸有差异的位置。虛线表示氨基酸的缺失。图4显示根据实施例1-3产生的猪尿酸酶和高度纯化尿酸酶变体的SDS-PAGE。每个样品的生产日期(月/年)和相关泳道号码在下方的图例(key)中表示。Y轴标以分子量的重量标记，图的顶部标以泳道号码。各泳道如下泳道l-分子量标记；泳道2-猪KS-AN(7/98);泳道3-猪(9/98);泳道4-猪KS(6/99);泳道5-猪KS(6/99);泳道6-猪-AN(6/99);泳道7-PigKS-AN(7/99);泳道8-PigKS-AN(8/99)。图5描绘PEG化(9xl0kD)猪-KS-AN尿酸酶在大鼠中IM(肌肉内)、SC(皮下)和IV(静脉内)注射后的药物动力学曲线，通过监测血液样品中的酶活性测出。在指定时间点收集的血浆样品中的尿酸酶活性用比色测定法进行测定。活性值(mAU二毫吸光度单位)代表每l^血浆样品的酶反应速度。注射的尿酸酶的生物利用度(相对于IV注射到达循环的药物量)从图的曲线下面积计算。图6描绘PEG化(W10kD)猪-KS-AN尿酸酶在兔中IM(肌肉内)、SC(皮下)和IV(静脉内)注射后的药物动力学曲线，通过监测血液样品中的酶活性测出。在指定时间点收集的血浆样品中的尿酸酶活性用比色测《法进行测定。活性值(mAU二毫吸光度单位)代表每l^血浆样品的酶反应速度。注射的尿酸酶的生物利用度(相对于IV注射到达循环的药物量)从图的曲线下面积计算。图7描绘PEG化(9xl0kD)猪-KS-AN尿酸酶在犬中IM(肌肉内)、SC(皮下)和IV(静脉内)注射后的药物动力学曲线，通过监测血液样品中的酶活性测出。在指定时间点收集的血浆样品中的尿酸酶活性用比色测定法进行测定。活性值(mAU-毫吸光度单位)代表每l)Lll血浆样品的酶反应速度。注射的尿酸酶的生物利用度(相对于IV注射到达循环的药物量)从图的曲线下面积计算。图8描绘PEG化(9xl0kD)猪-KS-AN尿酸酶在猪中IM(肌肉内)、SC(皮下)和IV(静脉内)注射后的药物动力学曲线，通过监测血液样品中的酶活性测出。在指定时间点收集的血浆样品中的尿酸酶活性用比色测定法进行测定。活性值(mAU=毫吸光度单位)代表每1pi血浆样品的酶反应速度。注射的尿酸酶的生物利用度(相对于IV注射到达循环的药物量)从图的曲线下面积计算。发明详述先前的研究教导，当通过PEG化实现尿酸酶免疫原性和/或抗原性的显著降低时，总是伴随着尿酸分解活性的明显损失。生物药物的安全性、方便性和成本效益都受到其功效下降和由此所致的需要增加给药剂量的不利影响。因此，需要有安全有效的用以降低身体流体(包括血液)中高水平尿酸的替代方法。本发明提供突变重组尿酸酶，其中所述尿酸酶已在氨基末端或羧基末端或两个末端截短1-20个氨基酸，并基本上保持天然尿酸酶的尿酸分解活性。本文所用的尿酸酶包括单个亚单位以及四聚体，除非另有指明。本文所用的突变尿酸酶指有氨基酸与其它氨基酸发生交换的尿酸酶分子。本文所用的保守突变是在某个位置处或周围的一个或多个氨基酸的突变，其基本上不会改变蛋白质行为。在一个优选的实施方案中，包含至少一个保守突变的尿酸酶和不具这种突变的尿酸酶具有相同的尿酸酶活性。在替代性实施方案中，包含至少一个保守突变的尿酸酶的活性与不具这种突变的尿酸酶的活性基本相同、在后者活性的5%内、10%内或30%内。保守氨基酸置换定义为通过改变肽、多肽或蛋白质或其片断的氨基酸造成的氨基酸组成变化。在具体的实施方案中，所述尿酸酶具有一个、两个、三个或四个保守突变。置换是具有一般类似特性(例如酸性、碱性、芳香性、大小、正电荷或负电荷、极性、非极性)的氨基酸的置换，使得置换基本上不会改变肽、多肽或蛋白质特性(例如电荷、IEF、亲和力、亲合力、构象、溶解性)或活性。可为这种保守氨基酸置换进行的典型置换可以是以下各组氨基酸当中的置换甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)和异亮氨酸(I)天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)和苏氨酸(T)组氨酸(H)、赖氨酸(K)和精氨酸(R)天冬酰胺(N)和谷氨酰胺(Q)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)和色氨酸(W)具有一个或多个保守置换的蛋白质保持其结构稳定性并能催化反应，即使其DNA序列与原始蛋白质的不相同。本文所用的截短尿酸酶指具有缩短的一级氨基酸序列的尿酸酶分子。在可能的截短当中，有出现在氨基和/或羧基末端处或周围的截短。这种类型的具体截短可使得天然蛋白质的终末氨基酸(氨基和/或羧基末端的氨基酸)存在于截短蛋白质中。氨基末端截短可在l、2、3、4、5或6位处开始。优选地，氨基末端截短在2位处开始，从而留下氨基末端甲硫氨酸。这个曱硫氨酸可通过翻译后修饰除去。在具体的实施方案中，氨基末端甲硫氨酸在尿酸酶产生后除去。在具体的实施方案中，曱硫氨酸通过内源细菌氨基肽酶除去。相对于全长序列，截短的尿酸酶有一个或多个氨基酸序列被去除。包含截短尿酸酶的蛋白质除截短的尿酸酶序列外还可包括任何氨基酸序列，但不包括包含尿酸酶序列的蛋白质，所述尿酸酶序列含有任何另外序贯的野生型氨基酸序列。换句话说，包含其中截短在6位处开始的截短尿酸酶(即截短的尿酸酶在7位处开始)的蛋白质，在截短尿酸酶的紧接上游处没有野生型尿酸酶在6位处所具有的无论哪种氨基酸。除非对别的序列和特定SEQIDNO.的具体提及另有指明，本文所述的对尿酸酶氨基酸的编号位置的引用是相对于猪尿酸酶序列的氨基酸编号作出的。猪尿酸酶的氨基酸序列和构成该序列的各氨基酸的编号位置可见图3。本文所用的对氨基酸或核酸"从X位到Y位，，的引用意指在X位开始和在Y位结束的连续序列，包括在X位和Y位两处的氨基酸或核酸。尿酸酶基因和蛋白质在几种哺乳动物物种例如猪、狒狒、大鼠、兔、小鼠和猕猴中已得到鉴定。各种尿酸酶蛋白质的序列在本文中以引用其公共数据库检索号的方式进行描述>所迷检索号如下gii50403728|sp|P25689;gi|20513634idbj|BAB91555.1;gi|176610|gb|AAA35395.1;gi|20513654|dbj|BAB91557.1;gi|47523606|reflNP_999435.1;gi|6678509|reflNP—033500.1;gi|57463|emb|CAA31490.1;gi|20127395|reflNP—446220.1;gi|137107|sp|P11645;gi|51458661|ref]XP_497688.1;gi|207619|gb|AAA42318.1;gi|26340770|dbj|BAC34047.1和gi|57459|emb|CAA30378.1。在可通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,NCBI)"i方问的/>共凄史据库中的每个这些序列及其注解通过引用整体结合到本文中。在本发明的一个实施方案中，尿酸酶在其氨基末端截短4-13个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，尿酸酶在其羧基末端截短4-13个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，尿酸酶在其羧基和氨基末端两处都截短4-13个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，尿酸酶在其氨基末端截短6个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，尿酸酶在其羧基末端截短6个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，尿酸酶在其羧基和氨基末端两处都截短6个氨基酸。在一个具体的实施方案中，尿酸酶蛋白包含猪尿酸酶氨基酸序列(SEQIDNO.n)的13位到292位的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，尿酸酶蛋白包含PBC-ANC氨基酸序列(SEQIDNO.12)的8位到287位的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，尿酸酶蛋白包含猪-KS-AN氨基酸序列(SEQIDNO.7)的8位到287位的氨基酸序列。在另一个实施方案中，尿酸酶蛋白包含猪-KS-AN(SEQIDNO.4)的44位到56位的氨基酸序列。尿酸酶的这个区域与尿酸酶的隧道折叠(tunnelingfold,T-fold)结构域中的序列具有同源性,且其中在相对于天然猪尿酸酶序列的46位处具有突变。这个突变意外地并不显著改变蛋白质的尿酸酶活性。在本发明的一个实施方案中，在任何氨基酸7、46、291和301处或周围的氨基酸发生突变。在本发明的一个优选实施方案中，氨基酸7、46、291和301本身发生突变。在具体的实施方案中，该蛋白质由编码N-末端曱硫氨酸的核酸编码。优选地，N-末端甲硫氨酸之后接着密码子，该密码子能让此N-末端曱硫氨酸被细菌曱硫氨酸氨基肽酶(MAP)除去。(Ben-Bassat和Bauer(1987)Nature326:315,该文献通过引用整体结合到本文中)。能让N-末端曱硫氨酸得以最完全地除去的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸。在本发明的一个实施方案中，在7位和/或46位处或周围的氨基酸被苏氨酸置换。意外的是，用这些突变制备出的截短尿酸酶的酶活性与非截短尿酸酶的相似。在本发明的又一个实施方案中，氨基酸突变包括分别在7、46、291和301位处的苏氨酸、苏氨酸、赖氨酸和丝氨酸。本文公开的截短哺乳动物尿酸酶还可在氨基末端包含甲硫氨酸。倒数第二个氨基酸可以是能让细菌甲硫氨酸氨基肽酶(MAP)除去N-末端曱硫氨酸的氨基酸。能让N-末端曱硫氨酸得以最完全地除去的氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸。在一个具体的实施方案中，尿酸酶包含两个氨基末端氨基酸，其中两个氨基末端氨基酸是曱硫氨酸和紧接其后的选自丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和苏氨酸的氨基酸。在本发明的另一个实施方案中，被置换的氨基酸已由苏氨酸置换。在本发明的一个实施方案中，尿酸酶是哺乳动物尿酸酶。在本发明的一个实施方案中，哺乳动物尿酸酶包含猪、牛、绵羊或狒狒肝脏尿酸酶的序列。在本发明的一个实施方案中，尿酸酶是两种或多种哺乳动物尿酸酶的嵌合尿酸酶。在本发明的一个实施方案中，哺乳动物尿酸酶选自猪、牛、绵羊或狒狒肝脏尿酸酶。在本发明的一个实施方案中，尿酸酶包含SEQIDNO.8的序列。在本发明的一个实施方案中，尿酸酶包含SEQIDNO.13的序列。本发明提供包含SEQIDNO.10的序列的尿酸酶编码核酸。在本发明的一个实施方案中，尿酸酶包括真菌或细菌尿酸酶。在本发明的一个实施方案中，真菌或细菌尿酸酶是黄曲霉、球形节杆菌(Arthrobacterglobiformis)或产朊假丝酵母的尿酸酶。在本发明的一个实施方案中，尿酸酶包括无脊推动物尿酸酶。在本发明的一个实施方案中，无脊推动物尿酸酶是黑腹果蝇或拟暗果蝇的尿酸酶。在本发明的一个实施方案中，尿酸酶包括植物尿酸酶。在本发明的一个实施方案中，植物尿酸酶是栽培大豆(Glycinemax)才艮瘤尿酸酶。本发明提供编码尿酸酶的核酸序列。本发明提供包含该核酸序列的载体。在一个具体的实施方案中，尿酸酶是分离的。在一个具体的实施方案中，尿酸酶是纯化的。在具体的实施方案中，尿酸酶是分离且纯化的。本发明提供包含载体的宿主细胞。本发明提供产生该核酸序列的方法，所述方法包括通过PCR(聚合酶链反应)技术修饰编码非截短尿酸酶的核酸序列。本领域技术人员知道，所需要的核酸序列籍合成寡核苷酸引物通过PCR制备，这些引物与待扩增的靶DNA(每条链一个)的各区域互补。在过量的脱氧核普酸和Taq聚合酶(一种热稳定DNA聚合物)存在下，将引物加入到草巴DNA(不需要是纯的)中。在一系列(通常30个)温度循环中，耙DNA反复进行变性(90。C左右)，与引物退火(通常在50-60。(3)和从引物延伸出子链(72。C)。由于子链本身能充当后续各循环的模板，与两个引物匹配的DNA片断以指数方式而不是线性方式得到扩增。本发明提供产生突变重组尿酸酶的方法，所述方法包括用该载体转染宿主细胞，其中所述宿主细胞表达该尿酸酶，从宿主细胞分离突变重组尿酸酶，用例如色谦技术分离出純化的突变重组尿酸酶，和纯化该突变重组尿酸酶。例如，可按照国际专利出版物WO00/08196(其通过引用整体结合到本文中)描述的方法制备该尿酸酶。该尿酸酶可通过本领域技术人员公知的任何方法进行分离和/或纯化。本发明的表达多肽通常分离成基本上纯的形式。优选地，该多肽分离至纯度为至少80%重量，更优选至纯度为至少95%重量，最优选至纯度为至少99%重量。一般来说，这种纯化可用例如硫酸铵分级分离、SDS-PAGE电泳和亲和层析的标准技术来实现。该尿酸酶优选按照2005年4月11日提交的共同待审美国专利申请(申请号为60/670,520，代理人案号为103864.146644，标题为"用阳离子型表面活性剂纯化蛋白质"，其通过引用整体结合到本文中)中描述的方法，用阳离子型表面活性剂例如氯化十六烷基呲啶输(CPC)来分离D在一个优选的实施方案中，处理宿主细胞以导致突变重组尿酸酶的表达。本领域技术人员知道，用载体转染细胞通常用钙离子沉淀的DNA来实现，不过也可使用各种其它方法(例如电穿孔)。在本发明的一个实施方案中，载体在渗透压敏感启动子的控制之下。启动子是DNA的一个区域，RNA聚合酶在启动DNA向RNA的转录之前与它结合。渗透压敏感启动子由于细胞所感受到的渗透压的增加而启动转录。在本发明的一个实施方案中，启动子是修饰的osmB启动子。在具体的实施方案中，本发明的尿酸酶是与聚合物缀合的尿酸酶。在本发明的一个实施方案中，提供包含该尿酸酶的药物组合物。在一个实施方案中，该组合物是尿酸酶的溶液。在一个优选的实施方案中，该溶液是无菌的，适合于注射。在一个实施方案中，这种组合物包含作为磷酸緩冲盐水溶液的尿酸酶。在一个实施方案中，该组合物在小瓶中提供，该小瓶任选具有橡胶注射塞。在具体的实施方案中，该组合物包含在溶液中的尿酸酶，溶液浓度为2-16毫克尿酸酶每毫升溶液、4-12毫克尿酸酶每毫升溶液或6-10毫克尿酸酶每毫升溶液。在一个优选的实施方案中，该组合物包含浓度为8毫克每毫升溶液的尿酸酶。优选地，尿酸酶的质量相对于蛋白质质量来测量。本发明组合物的有效给药方案可由本领域技术人员来确定。评估给定方案的有效性的合适指标是本领域技术人员所熟知的。这种指标的实例包括血浆尿酸水平(PUA)的正常化或降低，和PUA降低或维持在6.8mg/dL或以下，优选6mg/dL或以下。在一个优选的实施方案中，接受本发明组合物处理的受试者在总治疗时间的至少70%、至少80%或至少90%中，其PUA为6mg/dL或以下。例如，对于24周的治疗时间，受试者优选在24周治疗时间的至少80%中，即在至少等于天(24周x7天/周x0.8=1M.4天)的时间中，其PUA为6mg/dL或以下。在具体的实施方案中，每2-4周给予一次0.5-24mg的尿酸酶溶液。尿酸酶可用本领域技术人员公知的任何适当方式给予，例如静脉内、肌肉内或皮下给予。优选地，当进行静脉内给予时，给予0.5mg-12mg的尿酸酶。优选地，当进行皮下给予时，给予4mg-24mg的尿酸酶。在一个优选的实施方案中，尿酸酶通过静脉输注在30-240分钟时间内给予。在一个实施方案中，每两周给予一次8mg尿酸酶。在具体的实施方案中，输注可用100-500mL的盐水溶液来进行。在一个优选的实施方案中，每2周一次或每4周一次在120分钟时间里给予8mg的尿酸酶溶液；^尤选该尿酸酶溶于250mL盐水溶液中进行输注。在具体的实施方案中，尿酸酶给予在3个月、6个月、8个月或12个月的治疗时间里进行。在其它实施方案中，治疗时间是12周、24周、36周或48周。在一个具体的实施方案中，治疗时间是长时间治疗，例如2年或更长时间，直至受治疗的受试者的一生。另外，可采用穿插不治疗时间的多个治疗周期，例如6个月的治疗后是3个月的不治疗，接着又是6个月的治疗，等等。在某些实施方案中，可将抗炎化合物进行预防性给予，以消除或减少因尿酸酶的给予引起的输注反应的出现。在一个实施方案中，如此给予至少一种皮质类固醇、至少一种抗组胺剂、至少一种NSAID或它们的组合。可用的皮质类固醇包括倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氬化可的松、曱基泼尼松龙、泼尼松龙、泼尼松和曲安西龙。可用的NSAID包括布洛芬、吲咮美辛、萘普生、阿司匹林、乙酰氨基酚、塞来考昔和伐地考昔。可用的抗组胺剂包括阿扎他定、溴苯那敏、西替力嗪、氯苯那敏、氯马斯汀、赛庚啶、地氯雷他定、右氯苯那敏、茶苯海明、苯海拉明、多西拉敏、非索非那定、羟溱、氯雷他定和苯茚胺。在一个优选的实施方案中，抗组胺剂是非索非那定，NSAID是对乙酰氨基酚，皮质类固醇是氢化可的松和/或泼尼松。优选地，在输注尿酸酶溶液前给予所有三类的组合(不一定伴随在一起)。在一个优选的实施方案中，在尿酸酶输注前1-4小时口服给予NSAID和抗组胺剂。非索非那定的合适剂量包括约30至约180mg、约40至约150mg、约50至约120mg、约60至约90mg、约60mg,优选60mg。对乙酰氨基酚的合适剂量包括约500至约1500mg、约700至约1200mg、约800至约1100mg、约1000mg,优选1000mg。氢化可的松的合适剂量包括约100至约500mg、约150至约300mg、约200mg,优选200mg。在一个实施方案中，抗组胺剂不是苯海拉明。在另一个实施方案中，NSAID不是对乙酰氨基酚。在一个优选的实施方案中，在尿酸酶输注前一天晚上口服给予60mg非索非那定；在第二天早上口服给予60mg非索非那定和1000mg对乙酰氨基酚，最后，在就要输注尿酸酶溶液前给予200mg氢化可的松。在一个实施方案中，在给予尿酸酶前一天、优选在晚上给予泼尼松。泼尼松的适当剂量包括5-50mg,优选20mg。在某些实施方案中，将这些用于消除或减少输注反应出现的预防性治疗应用于接受或将要接受尿酸酶(包括PEG化尿酸酶和非PEG化尿酸酶)的受试者。在具体的实施方案中，将这些预防性治疗应用于接受或将要接受接受尿酸酶之外的治疗性肽的受试者，其中所述其它治疗性肽是PEG化的或非PEG化的。在本发明的一个实施方案中，药物组合物包含已通过与聚合物缀合进行修饰的尿酸酶，该修饰的尿酸酶保持尿酸分解活性。在一个具体的实施方案中，聚合物-尿酸酶缀合物按国际专利出版物WO01/59078和美国专利申请第09/501730号(i^个专利通过引用整体结合到本文中)的描述进行制备。在本发明的一个实施方案中，聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖、聚丙二醇、羟丙基曱基纤维素、羧曱基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙烯醇。在本发明的一个实施方案中，该组合物在每个尿酸酶亚单位上包含2-12个聚合物分子，优选每个尿酸酶亚单位3-10个聚合物分子。在本发明的一个实施方案中，每个聚合物分子的分子量在约1kD至约100kD之间。在本发明的另一个实施方案中，每个聚合物分子的分子量在约1kD至约50kD之间。在本发明的一个优选实施方案中，每个聚合物分子的分子量在约5kD至约20kD之间、约8kD至约15kD之间、约10kD至约12kD之间，优选约10kD。在一个优选的实施方案中，每个聚合物分子的分子量为约5kD或约20kD。在本发明一个特别优选的实施方案中，每个聚合物分子的分子量为10kD。还设想了不同重量分子的混合物。在本发明的一个实施方案中，该组合物适合于反复给予。在一个具体的实施方案中，尿酸酶与聚合物的缀合物包含选自尿烷键、仲胺键和酰胺键的键。本发明提供有能力产生具有重组尿酸酶氨基酸序列的尿酸酶的细胞，其中所述尿酸酶截短了1-20个氨基酸，且具有突变氨基酸和尿酸分解活性。本发明提供用尿酸酶代谢尿酸的方法。本发明提供尿酸酶的组合物用于减少生物流体中的尿酸水平的用途。在本发明的一个实施方案中，将尿酸酶的组合物用于减少包括血液的生物流体中的尿酸水平。本发明还提供编码尿酸酶多肽的新型核酸分子。导致这些核酸分子产生的操作是本领域技术人员公知的。例如，尿酸酶核酸序列可通过任何本领域知的多种策略进行修饰(Maniatis,T.,1990,MolecularCloning,ALaboratoryManual,2ded.,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,N.Y.)。该序列可在体外用限制性内切核酸酶在适当位点进行切割，然后如有需要进一步进行酶促修饰，分离，连接。在产生编码尿酸酶的基因时，应注意确保修饰基因保持在适当的翻译阅读框当中，不被翻译终止信号所间断。另外，尿酸酶编码核酸序列可在体外或体内突变，以产生和/或破坏翻译序列、起始序列和/或终止序列，或者产生编码区域中的变异和/或形成新的限制性内切核酸酶位点或破坏现有位点，以促进进一步的体外修饰。可使用本领域公知的任何诱变技术，包括但不限午定点诱变(Hutchinson,C.等，1978,J.Biol.Chem253:6551)、TAB⑧接头(Pharmacia)的使用等。可将编码尿酸酶蛋白的核普酸序列插入到适当的表达载体，即含有插入的蛋白质编码序列的转录和翻译必需元件的载体。可利用有各种宿主-载体系统来表达蛋白质编码序列。这些系统包括但不限于用病毒(例如痘苗病毒、腺病毒等)转染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如杆状病毒)转染的昆虫细胞系统；微生物如含酵母载体的酵母或用噬菌体DNA、质粒DNA或黏粒DNA转化的细菌。这些载体的表达元件其强度和特异性各不相同。取决于所采用的宿主-载体系统，可使用多种合适的转录和翻译元件中的任何一种。可使用任何公知用以将DNA片断插入到载体中的方法，来构建含有由适当转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列组成的嵌合基因的表'€'栽体。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术以及体内重组(遗传重组)。编码尿酸酶蛋白的核酸序列的表达可通过第二种核酸序列来调节，使得尿酸酶蛋白在用重组DNA分子转化的宿主中得到表达。例如，尿酸酶的表达可通过本领域公知的任何启动子/增强子元件来控制。可用来控制尿酸酶表达的启动子包括但不限于SV40早期启动子区域(Bernoist和Chambon,1981,Nature290:304-310)、Rous肉瘤病毒的3'长末端重复序列中所含的启动子(Yamamoto等，l兆0，Cell22:787-797)、疱渗胸苷激酶启动子(Wagner等，1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:144-1445)、金属硫蛋白(metallothionme)基因的调节序列(Brmster等，1982，Nature296:39-42);原核生物表达载体如(3-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等，1978,Pro"Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731)、tac启动子(DeBoer等，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25)和osmB启动子。在具体的实施方案中，核酸包含有效连接到异源启动子的尿酸酶编码核酸序列。一旦制备和分离出包含尿酸酶编码核酸序列的特定重组DNA分子，可用本领域公知的几种方法来使它增殖。一旦确立了合适的宿主系统和生长条件，可大量增殖和制备重组表达载体。如前文所说明，可使用的表达载体包括但不限于以下载体或其衍生物人或动物病毒如痘苗病毒或腺病毒；昆虫病毒如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(例如人噬菌体)、质粒和黏粒DNA载体，在此仅举几例。另外，可选择宿主细胞株，其调节插入序列的表达，或者以所需的特定方式修饰或加工基因产物。在某些诱导物的存在下可提高来自某些启动子的表达；由此，遗传工程改造的尿酸酶蛋白的表达可得以控制。此外，不同的宿主细胞对蛋白质翻译以及翻译后加工和修饰(例如糖基化、切割)具有特征性和特异性的机制。可选择适当的细胞系或宿主系统来确保所需的对所表达异种蛋白的修饰和加工。不同的载体/宿主表达系统可实现不同程度的加工反应如蛋白水解切割。在本发明的具体实施方案中，尿酸酶在大肠杆菌中的表达优选用包含osmB启动子的载体来进行。实施例实施例l.用于尿酸酶表达的基因和表达质粒的构建将重组猪尿酸酶(尿酸氧化酶)、猪-KS-AN(氨基末端截短的猪尿酸酶蛋白，氨基酸291和301分别用赖氨酸和丝氨酸置换)在大肠杆菌K-12抹W3110F-中表达。构建终止于pOUR-P-AN-ks-l的一系列质粒，它们在大肠杆菌宿主细胞的转化时能够指导尿酸酶的有效表达。从猪和狒狒肝脏的分离和亚克隆尿酸酶cDNA通过相关RNA的分离和亚克隆从猪和狒狒肝脏制备尿酸酶cDNA。从猪和狒狒肝脏提取总细胞RNA(Erlich，H.A.(1989).PCRTechnology;PrinciplesandApplicationforDNAAmplification;Sambrook,J.等(1989).MolecularCloning:ALaboratoryManual,2ndedition;Ausubel,F.M.等(1998).CurrentprotocolsinmolecularBiology),然后用首链cDNA合成试剂盒(PharmaciaBiotech)进行反转录。用TaqDNA聚合酶(GibcoBRL,LifeTechnologies)进行PCR扩增。用于猪和狒狒尿酸氧化酶(尿酸酶)的PCR扩增的合成寡核苷酸引物在表l中显示。表1.尿酸酶cDNA的PCR扩增用引物猪肝脏尿酸S^^正义5'gcgcgaattccATGGCTCATTACCGTAATGACTACA3'(SEQIDNO.1)反义5'gcgctctagaagcttccatggTCACAGCCTTGAAGTCAGC3'(SEQIDNO.2)狒狒(D3H)肝脏尿酸酶正义5'gcgcgaattccATGGCCCACTACCATAACAACTAT3'(SEQIDNO.3)反义5'gcgcccatggtctagaTCACAGTCTTGAAGACAACTTCCT3'(SEQIDNO.4)在各引物的末端引入的、在表1中用小写字母显示的限制性内切核酸酶序列为正义EcoRI和Ncol(猪和狒狒)及反义Ncol、HmdIII和XbaI(猪)、XbaI和NcoI(狒狒)。在狒狒正义引物中，存在于狒狒尿酸酶中的第三密码子GAC(天冬氨酸)被CAC(组氨酸)置换，CAC密码子存在于人尿酸氧化酶假基因的编码序列中的这个位置。用这些引物产生的重组狒狒尿酸酶构建物命名为D3H狒狒尿酸酶。将猪尿酸酶PCR产物用EcoRI和Hmdin消化并克隆到pUC18中，产生pUC18-猪尿酸酶。将D3H狒狒尿酸酶PCR产物用TACloning(Invitrogen,Carlsbad,CA)直接克隆到pCRTMII载体中，产生pCRTMII-D3H狒狒尿酸。用连接的cDNA转化大肠杆菌XL1-Blue株(Stratagene,LaJolla,CA)。制备含有克隆的尿酸酶cDNA的质粒DNA,选择并分离出具有公开的尿酸酶DNA编码序列(除表1所示的狒狒尿酸酶中的D3H置换外)的克隆。在所选出的pCRII-D3H狒狒尿酸酶克隆中，pCRII序列邻^妄尿酸酶终止密码子，这由缺失PCR引入的序列所致。因此，3'非翻译区的Xbal和Ncol限制位点被消除，从而使得可以用PCR产物5'末端的Ncol和衍自pCRTMII载体的BamHI进行定向克隆。尿酸醉cDNA向pET表达载体中的亚克隆狒狒尿酸酶亚克隆将含有全长尿酸酶编码序列的D3H狒狒cDNA引入到pET-3d表达载体(Novagen,Madison,WI)中。用Ncol和BamHI消化pCRTMII-D3H狒狒尿酸酶，分离960bp片断。用Ncol和BamHI消化表达质粒pET-3d，分离4600bp片断。将两个片断连接，产生pET-3d-D3H-狒狒。猪-狒狒嵌合尿酸酶亚克隆构建猪-狒狒嵌合(PBC)尿酸酶，以获得重组基因的更高表达、稳定性和活性。这样构建PBC:从pET-3d-D3H-狒狒克隆分离出4936bpNcoI-Apal片断，将分离的片断与从pUC18-猪尿酸酶分离的624bpNcol-Apal片断连接，导致pET-3d-PBC的形成。PBC尿酸酶cDNA由猪尿酸酶密码子1-225和框内连接的狒狒尿酸酶密码子226-304组成。猪-KS尿酸酶亚克隆构建猪-KS尿酸酶，以加入一个赖氨酸残基，该残基可提供另外的PEG化位点。KS指猪尿酸酶位处赖氨酸置换精氨酸(R2WK)的氨基酸插入。另外，301位的苏氨酸被丝氨酸置换(T301S)。如下构建PigKS尿酸酶质粒分离pET-3d-D3H-狒狒的4696bpNcol-Ndel片断，然后将其与从pU18C-猪尿酸酶分离的864bpNcol-Ndel片断连接，导致pET-3d-PigKS的形成。所得的PigKS尿酸酶序列由猪尿酸酶密码子1-288和框内连接的狒狒尿酸酶密码子289-304组成。在osmB启动子调节下的尿酸酶序列的亚克隆将尿酸酶基因亚克隆到含有osmB启动子的表达载体中(按照美国专利第5,795,776号的教导，该专利通过引用整体结合到本文中)。这个载体能够响应高渗透压或培养物衰老诱导下止子序列(ter)。它赋予氨千青霉素抗性(AmpR)和表达重组人乙酰胆碱酯酶(AChE)。D3H-狒狒尿酸酶的亚克隆用Ncol和BamHI消化质粒pMFOA-18，分离大片断。用Ncol和BamHI消化构建物pET-3d-D3H-狒狒，分离包括D3H狒狒尿酸酶基因的960bp片断。将这两个片断连接，产生pMFOU18。表达质粒pMFXT133含有osmB启动子、rbs(大肠杆菌deo操纵子)、ter(大肠杆菌TrypA)、重组因子Xa抑制剂多肽(FxaI),其赋予四环素抗性基因(TetR)。将狒狒尿酸酶基因插入到这个质粒中，以交换抗生素抗性基因。用Ncol消化质粒pMFOU18,补平，然后用Xhol消化，分离1030bp片断。用Ndel消化质粒pMFXT133，补平，然后用Xhol消化，分离大片断。将两个片断连接，产生狒狒尿酸酶表达载体pURBA16。猪狒狒嵌合尿酸酶的亚克隆用Apal和AlwNI消化质粒pURBA16,分离2320bp片断。用Ndel消化质粒pMFXT133,补平，然后用AlwNI消化，分离620bp片断。用Xbal消化构建物pET-3d-PBC,补平，然后用Apal消化，分离710bp片断。将三个片断连接产生pUR-PB，这个质粒在osmB启动子和rbs以及T7rbs(衍自pET-3d载体)的控制下表达PBC尿酸酶。T7rbs在另外的步骤中进行切除。用Ncol消化pUR-PB,补平，然后用AlwNI消化，分离3000bp片断。用Ndel消化质粒pMFXT133,补平，然后用AlwNI消化，分离620bp片断。将两个片断连接形成pDUR-PB，它在osmB启动子的控制下表达PBC。pOUR-PB-ANC的构建向尿酸酶cDNA中引入几个变化，这些变化导致重组酶稳定性的大大提高。构建质粒pOUR-PBC-ANC,其中N末端六残基成熟肽(maturationpeptide)和在体内起到过氧化物酶体靶向信号作用的C末端三肽都被去除。这通过采用质粒pDUR-PB中的PBC序列和表所列的用于PCR扩增的特异性寡核苷酸引物进行。表2.用于PCR扩增PBC-ANC尿酸酶的引物<table>complextableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在表2中，在引物末端引入的限制性内切核酸酶序列用粗体显示，非编码区用小写字母显示。Ndel为正义，Xbal为反义。反义引物还通过引入不会影响氨基酸序列的点突变(下划线处)用来去除内部Ndel限制位点，从而促进用Ndel进行的亚克隆。用Ndel和Xbal切割pDUR-PB的PCR扩增所产生的900碱基对片断，进行分离。然后将所获得的片断插入到deo表达质粒pDBAST-RAT-N中，该质粒含有衍自大肠杆菌的deo-PlP2启动子和rbs,能组成型表达人重組胰岛素前体。用Ndel和Xbal消化该质粒，分离4035bp片断，连接到PBC-尿酸酶PCR产物。用所得的构建物pDUR-PB-ANC转化大肠杆菌K-12S小733(F-cytRstrA)，该菌表达高水平的活性截短尿酸酶。双重截短的PBC-ANC序列也在osmB启动子控制下表达。用AlwNI-NdeI消化质粒pDUR-PB-ANC,分离3459bp片断。用Ndel-AlwNI消化上述质粒pMFXT133,分离660bp片断。然后将各片断连接产生pOUR-PB-ANC,将其引入到大肠杆菌K-12抹W3110F-，表达高水平的活性截短尿酸酶。尿酸酶表达质粒pOUR-P-AN-ks-1的构建构建这个质粒，以改进重组酶的活性和稳定性。猪-KS-AN尿酸酶只在N末端截短(AN),此处去除六残基N末端成熟肽，它还含有突变S46T、R291K和T301S。由于PCR扩增和克隆过程中出现的保守突变，在46位处是苏氨酸残基而不是丝氨酸。在291位，赖氨酸置换精氨酸，在301位，插入了丝氨酸置换苏氨酸。两者均衍自狒狒尿酸酶序列。R291K和T301S修饰表示为KS,讨论如上。额外的赖氨酸残基提供另外的潜在PEG化位点。为构建pOUR-P-AN-ks-l(图1)，用Apal-Xbal消化质粒pOUR-PB-ANC,分离3873bp片断。用Apal-Spel消化质粒pET-3d-PKS(构造在图4中显示)，分离270bp片断。Spel切割留下5'CTAG突出端，将其有效地连接到Xbal所产生的DNA片断。将两个片断连接，产生pOUR-P墜AN-ks陶l。连接后，Spel和Xbal识别位点丢失(它们的位点在图9中用括号显示)。将构建物pOUR-P-AN-ks-l引入到大肠杆菌K-12林W3110F-(原养型，ATCC#27325)中。在osmB启动子控制下表达得到猪-KS-AN尿酸酶，产生出具有优越活性和稳定性的高水平重组酶。图1说明质粒pOUR-P-AN-ks-l的结构。限制位点旁的数字表示核苷酸位置，该位置相对于指定为1的HaeII位点而言；在克隆过程中丢失的限制位点在括号中标出。编码猪-KS-AN尿酸酶的质粒pOUR-P-AN-ks-l有4143i成基对(bp)长，由以下元件组成1.113bp长的DNA片断，其从核苷酸号码1延伸到Ndel位点(l13位)，包括osmB启动子和核糖体结合位点(rbs)。2.932bp长的DNA片断，其从Ndel位点(113位)延伸到Spel/Xbal连接处(1045位)，包括卯Obp的猪-KS-AN(氨基末端截短的猪尿酸酶蛋白的核酸序列，其中氨基酸291和301分别被赖氨酸和丝氨酸置换)编码区和衍自pCRII的32bp侧翼序列，自Spel/Xbal限制位点上游的TA克隆位点。3.从Spel/Xbal连接处(1045位)到HindIII(1070位)的25bp多克隆位点序列(MCS)。4.含有TrpA转录终止子(ter)的合成40bp寡核苷酸，其具有Hmdm(1070位)和AatII(1110位)末端。5.1519bp长的DNA片断，其从AatII(1110位)延伸到包括四环素抗性基因(TetR)的pBR322上的Mscl/Scal(2629位)位点。6.1514bp长的DNA片断，其从Seal(2629位)延伸到包括DNA复制原点的pBR322上的HaeII(4143位)位点。图2显示猪-KS-AN尿酸酶的DNA和推导氨基酸序列。在这个图中，氨基酸编号按照完全猪尿酸酶序列进行。在起始密码子曱硫氨酸残基之后，插入苏氨酸置换猪尿酸酶序列中的天冬氨酸。这个苏氨酸残基使得曱硫氨酸能被细菌氨基肽酶除去。氨基酸序列中的缺口说明缺失的N末端成熟肽。指出了用于不同尿酸酶序列亚克隆的各个步骤的限制位点(ApaI、Ndel、BamHI、EcoRI和Spel)。小写字母显示的3'非翻译序列衍自pCRTMII序列。翻译终止密码子由星号表示。图3显示各种重组尿酸酶序列的氨基酸序列的比对。上面一行代表猪尿酸酶，其包括全长氨基酸序列。第二行是双重截短的猪-狒狒嵌合尿酸酶(PBC-ANC)的序列。第三行显示猪-KS-AN尿酸酶的序列，该酶只在N末端截短，且含有突变S46T和氨基酸变化R291K和T301S,这两个变化都反映尿酸酶编码序列的羧基末端的狒狒起源。星号表示与公开的猪尿酸酶序列相比猪-KS-AN中氨基酸有差异的位置；圓圈表示与猪-狒狒嵌合体PBC-AN相比猪-KS-AN中氨基酸有差异的位置；虛线表示氨基酸的缺失。构建了具有Y97H突变的天然狒狒、猪和兔尿酸酶以及猪/狒狒嵌合体(PBC)的cDNA，用以克隆到大肠杆菌中。构建并选择表达高水平尿酸酶变体的克隆，使得所有克隆均为W3110F-大肠杆菌，且表达受osmB调节、。分离质粒DNA,通过DNA测序和限制性内切核酸酶分析进行验证，培养细胞。截短的尿酸酶(包括猪-AN和猪-KS-AN)的构建如下进行PBC-△NC和猪-KS之间交叉连接，然后分别用限制性内切核酸酶Apal和Xbal以及Apal加Spel切割。合理的是这些截短突变体会保持活性，因为N末端六个残基"成熟肽"(l-2)和C末端三肽"过氧化物酶体靶向信号"(3-5)不具有显著影响酶活性的功能，有可能这些序列可具有免疫原性。选择出表达高水平尿酸酶变体的克隆。实施例2.表达质粒向细菌宿主细胞中的转化将表达质粒pOUR-P-AN-ks-l引入到大肠杆菌K-12林W3110F-中。制备转化用细菌细胞，包括在Luria肉汤(LB)中使细胞生长至对数中期，然后离心收获细胞，在冷水中洗涤，悬浮于10%甘油水溶液中，浓度为约3xl0"个细胞/ml。将细胞分等份保存于刁0。C。在乙醇中沉淀出质粒DNA,溶于水中。将细菌细胞和质粒DNA混合，用BIO-RAD的GenePulserII通过高压电穿孑L进行转化(Trevorsetal(1992).ElectrotmnsformationofbacteriabyplasmidDNA,GuidetoElectroporationandElectrofusion(D.C.Chang,B.M.Chassy,J.A.Saunders和A.E.Sowers编)中，第265-290页，AcademicPressInc.,SanDiego;Hanahan等(l991)Meth.Enzymol.,204,63-113)。将转化的细胞悬浮在SOC培养基(2。/。胰蛋白胨、0.5%酵母膏、]0mMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgS04、20mM葡萄糖)中，37。C下温育l小时，用四环素抗性进行选择。选出高表达克隆。实施例3.重组尿酸酶制品将细菌例如转化的细菌(见上)在含葡萄糖培养基中进行培养；pH维持在7.2士0.2，温度大约37。C。接近培养的最后5-6小时时，培养基补加KC1至最终浓度为0.3M。继续进行培养，以让尿酸酶积累。重组尿酸酶在细菌细胞当中积累为类似于内含体(IB)的不溶性沉淀。离心洗涤细胞悬浮物，悬浮于50mMTns緩沖液(pH8.0)和10mMEDTA中，使最终体积达干细胞重量的大约40倍。用溶菌酶和高压^^开细菌细胞后，离心分离含重组尿酸酶的内含体(IB)。溶菌酶(2000-3000单位/ml)处理在pH8.0和7±3°C下搅拌进行16-20小时。用水洗涤粒状沉淀，-20°(^下保藏备用。富集的IB悬浮于50mMNaHC03緩冲液(pH10.3士0.1)后作进一步的加工。将悬浮液在室温下温育过夜，以让IB衍生的尿酸酶溶解，随后进行离心澄清。尿酸酶通过几个色语步骤作进一步的纯化。首先，在Q-SepharoseFF柱上进行色谱。用含150mMNaCl的碳酸氢盐緩沖液洗涤已加样的柱，用含250mMNaCl的碳酸氢盐緩冲液洗脱尿酸酶。然后，用黄。票呤-琼脂糖树脂(Sigma)除去尿酸酶制品中的少量杂质。用50mM甘氨酸緩沖液(pH10.3士0.1)将Q-SepharoseFF洗脱液稀释至蛋白质浓度为大约0.25mg/ml，加样。用含100mMNaCl的碳酸氢盐緩沖液(pH10.3士0.1)洗涤柱，用补充有60fiM黄嘌呤的同一緩沖液洗脱尿酸酶。在这个阶段，通过Q-Sepharose色谱再纯化尿酸酶，以除去聚集体形式。各尿酸酶制品的纯度由大小排阻层析测出大于95%。用Superdex200柱检测出各制品中聚集体形式少于0.5%。表3总结了来自25L发酵液的IB的猪-KSAN尿酸酶的纯化。<table>complextableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>实施例4.重组尿酸酶的特性SDS誦PAGE高度纯化的尿酸酶变体的SDS-PAGE分析(图4)显示了相当独特的模式。样品在碳酸盐緩沖液(pH10.3)中4。C下保藏直至几个月。全长变体Pig、'猪-KS和PBS显示有两种分子量约20和15kD的主要降解产物积累。这个观察结果提示，至少有单个切口裂解了尿酸酶亚单位分子。在氨基末端缩短的克隆中以及在兔尿酸酶中检测到不同的降解模式，但比例较低。兔的氨基末端类似于缩短的克隆的氨基末端。测定了在纯化和保藏过程中产生的尿酸酶片断的氨基末端序列。肽测序用Edman降解方法进行主体(bulk)尿酸酶制品的N末端测序。进行了IO个循环。与猪-KS-AN相比重组猪尿酸酶(全长克隆)产生了更为丰富的降解片断。导致降解片断的推导切割位点如下1)168位处具有以下序列的主要位点-QSGiFEGFI—2)142位处具有以下序列的次要位点-IRNIGPPVI-以上序列并不显出任何已知的蛋白酶解切割。不过，切割可能源于蛋白酶解或一些化学反应。氨基截短的尿酸酶意外地比非氨基截短的尿酸酶更稳定。PBC-ANC的稳定性还类似于其它AN分子，小于非氨基截短的PBC。功效用uv方法测量尿酸酶的活性。酶促反应速度通过测量由尿酸氧化成尿囊素所致的292nm处吸光度減少来测定。一活力单位定义为25°C下在指定条件下每分钟氧化一微摩尔尿酸所需的尿酸酶的量。尿酸酶功效以每mg蛋白质的活力单位(U/mg)表示。1mM尿酸在292nm处的消光系数为12.2mM"cm-1。因此，1pmol尿酸/ml反应混合物的氧化导致^^光度减少12.2mA292。吸光度随时间的变化(AA^每分钟)从曲线的线性部分导出。ChimActa122:93-101)测定。尿酸酶的比活性(功效)通过将活性(U/ml)除以蛋白质浓度(mg/ml)来计算。各种重组尿酸酶的酶活性结果在表4中总结。该表中包括市售制品的结果作为参考值。从这些结果显现，尿酸酶蛋白的截短对其酶活性没有显著影响。表4.重组和天然尿酸酶的动力学参数总结〈table>Complextableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>表4注释(1)蛋白质浓度通过278nm出测量的吸光度来测定，对于10mg/ml尿酸酶溶液使用11.3的消光系数(Mahler,1963)。(2)1单位的尿酸酶活性定义为25°C下每分钟氧化ljLimol尿酸成尿嚢素的酶量。(3)比活性值从Lineweaver-Burk图导出，底物浓度等于60^M。(4)反应混合物由以下储备溶液的各种组合所组成lOOmM硼酸钠緩沖液，pH9.2300尿酸的50mM硼酸钠緩冲液(pH9.2)溶液1mg/mlBSA的50mM硼酸钠緩沖液(pH9.2)溶液(5)Kcat通过将Vmax(从各个Lineweaver-Burk图求出)除以尿酸酶在反应混合物中的浓度(以摩尔当量表示，基于尿酸酶的四聚体分子量)来计算。实施例5.尿酸酶与m-PEG的缀合(PEG化)用m-PEG-NPC(—曱氧基-聚乙二醇-硝基苯基碳酸酯)缀合猪-KS-AN尿酸酶。确立能导致每尿酸酶亚单位2-12个5、10或20kDPEG链的条件。将m-PEG-NPC逐渐加入到蛋白质溶液中。PEG加入结束后，接着将尿酸酶/m-PEG-NPC反应混合物在2-8°C下温育l6-18小时，直到最多的未结合m-PEG链缀合到尿酸酶。每PEG-尿酸酶单体的PEG链数用PEG和尿酸酶标准品通过Superose6大小排阻层析(SEC)进行测定。每亚单位的结合PEG链数由以下方程式确定3.42x注射样品中PEG的量Og)PEG链数/亚单位=-注射样品中蛋白质的量Oig)PEG-尿酸酶样品中PEG和蛋白质部分的浓度用串联排列的紫外(UV)检测器和折光指数(RI)检测器(Kumtam等，1991所开发)通过大小排阻层析(SEC)测定。产生三个校准曲线蛋白质曲线(在220nm处测量吸收)；蛋白质曲线(通过RI测量)和PEG曲线(通过RI测量)。然后，用相同的系统分析PEG-尿酸酶样品。用实验样品的所得UV和RI峰面积值计算PEG和蛋白质相对于校准曲线的浓度。3.42的指数是尿酸酶单体的分子量(34,192道尔顿)与10kDPEG的分子量之间的比。连接的PEG改进了尿酸酶在具有生理PH值的溶液中的溶解度。表5指出了各批PEG化猪-KS-AN尿酸酶产物之间的差异。一般来说，所连接的PEG链数和所保留的酶比活性(SA)之间存在反比关系。表5.PEG化猪-KS-AN尿酸酶缀合物的酶活性<table>complextableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>实施例6.用1000D和100,000DPEG对尿酸酶的PEG化用1000D和100,000Dm-PEG-NPC按实施例5的描述缀合猪-KS-AN尿酸酶。使用能导致每尿酸酶亚单位2-11个PEG链的条件。PEG加入结束后，接着将尿酸酶/m-PEG-NPC反应混合物在2-8°C下温育16-18小时，直到最多的未结合m-PEG链缀合到尿酸酶。每PEG-尿酸酶单体的PEG链数如上所述进行测定。连接的PEG改进了尿酸酶在具有生理pH值的溶液中的溶解度。实施例7.与PEG缀合的猪-KS-AN尿酸酶的药物动力学进行生物学实验，以确定为提供疗效所需的PEG化的最佳程度和数量。在大鼠药物动力学研究中，在第1天和笫8天静脉内注射给予0.4mg(2U)/kg体重的未修饰尿酸酶，产生约IO分钟的循环半寿期。但是，每周一次注射共9次后，用2-x〗OkDPEG-猪-KS-AN尿酸酶进行的大鼠清除速度研究表明，清除不取决于PEG链数(在这个范围内)，在整个研究期间保持相对恒定(见表6;半寿期约30小时)。周与周的差异在实验误差范围内。9次注射10x5kDPEG和10x20kDPEG-尿酸酶缀合物后，也显现相同的模式。此结果表明，不管尿酸酶PEG化的程度如何，在这个范围内在大鼠模型中观察到相似的生物效应。表6.PEG化猪-KS-AN尿酸酶制品在大鼠中的半寿期<table>complextableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>表6注释结果作为平均值士标准误差以小时表示。括号中的数字表示试验的动物数量。如表中所示大鼠每周一次接受静脉内注射0.4mg/kg体重的修饰猪-KS-AN尿酸酶。每组一开始包括15只大鼠，以5只为次组轮流放血。有几只大鼠在研究过程中因麻醉致死。通过测量注射后5分钟及6、24和48小时收集的血浆样品中的尿酸酶活性(比色测定)来测定半寿期。表5描述研究中所用的各批PEG化尿酸酶。用6x5kDPEG-猪-KS-AN尿酸酶在兔中进行的生物利用度研究表明，首次注射后，循环半寿期为98.2±1.8小时(静脉内)，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为71%和52%。但是，在第二次肌肉内和皮下注射后，在所有兔中检测出显著的抗尿酸酶抗体滴度，随后各次注射后清除加速。用相同的缀合物注射大鼠，导致的半寿期为26±1.6小时(静脉内)，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为33%和22%。用9x10kDPEG-猪-KS-AN尿酸酶在大鼠中进行的研究表明，首次注射后的循环半寿期为42.4小时(静脉内)，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为28.9%和".5%(见图5和表7)。在第四次注射后，循环半寿期为32.1士2.4小时，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为26.1%和14.9%。用9xl0kDPEG-猪-KS-AN尿酸酶在兔中进行的类似药物动力学研究表明，在注射此缀合物(每两周注射一次共4次)后没有观察到加速清除。在这些动物中，第一次注射后的循环半寿期为88.5小时(静脉内)，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为98.3%和84.4%(见图6和表7)。在第四次注射后，循环半寿期为Ml.l士l5.4小时，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为85%和83%。用9xl0kDPEG-猪-KS-AN进行了类似的研究，以评估在小猎犬(每组两雄两雌)中的生物利用度。第一次静脉内注射后记录到的循环半寿期为70±11.7小时，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为69.5%和50.4%(见图7和表7)。用猪进行9x10kDPEG-猪-KS-AN制品的研究。每组三只动物用于通过静脉内、皮下和肌肉内途径给予。第一次静脉内注射后记录到的循环半寿期为178±24小时，肌肉内和皮下注射后的生物利用度分别为71.6%和76.8%(见图8和表7)。表7.9xl0kDPEG-猪-KS-AN尿酸酶的药物动力学研究<table>complextableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table>用1251按Bolton&Hunter方法碘化9xl0kDPEG-猪-KS-AN尿酸酶后，进行吸收、分布、代谢和排泄(ADME)研究。将标记的缀合物注射到7组的每组4只大鼠(2雄2雌)中。在1小时后和每24小时分析放射性的分布，持续7天(除第5天外)。将每组依次处死，切除不同器官进行分析。将第7组保持在代谢笼中，由其收集尿液和粪便。通过测量可获自TCA沉淀(即结合的蛋白质，归一化到器官大小)的每个器官(肾、肝、肺和脾)中的总放射性和计数分数，评估(放射性)材料在动物全部身体内的分布。在所切除的器官中，没有器官的比放射性高于其它器官，因此例如在肝脏或肾脏中未见显著积累。到第7天为止，有70%的放射性被排泄。实施例8.临床试验结果进行了随机化、非盲、多中心、平行组研究，以评估在对常规疗法无响应或不耐受的高尿酸血症和严重痛风人患者中PEG-尿酸酶(Puricase,SavientPharmaceuticals)的尿酸响应以及药物动力学和安全曲线。疾病的平均持续时间是14年，70%的研究群体有一个或多个结节瘤。在本研究中，将41名患者(平均年龄58.1岁)随机至采取以下四种给药方案之一的12周静脉内PEG-尿酸酶治疗每两周4mg(7名患者)；每两周8mg(8名患者)；每四周8mg(l3名患者)或每四周12mg(13名患者)。在确定的时间间隔测量血浆尿酸酶活性和尿酸水平。药物动力学参数、平均血浆尿酸浓度和血浆尿酸小于或等于6mg/dL的时间百分比从尿酸酶活性和尿酸水平的分析结果得出。每两周接受8mg的PEG-尿酸酶的患者其PUA降低最大，92%的治疗时间其水平低于6mg/dL(处理前血浆尿酸为9.1mg/dL，与此对比，12周期间的平均血浆尿酸为1.4mg/dL)。在其它PEG-尿酸酶治疗剂量组中也观察到显著和持续的较低血浆尿酸水平在每四周8mg的组中86%的治疗时间PUA低于6mg/ml(处理前血浆尿酸为9.1mg/dL，与此对比，12周期间的平均血浆尿酸为2.6mg/dL);在每四周]2mg的组中84%的治疗时间PUA低于6mg/ml(处理前血浆尿酸为8.5mg/dL，与此对比，12周期间的平均血浆尿酸为2.6mg/dL);在每两周4mg的组中73%的治疗时间PUA低于6mg/ml(处理前血浆尿酸为7.6mg/dL,与此对比，12周期间的平均血浆尿酸为4.2mg/dL)。在给予PEG-尿酸酶的第一个24小时内血浆尿酸从基线的最大降低百分比，对于接受4mg/2周的受试者为72%(p=0.0002);对于接受8mg/2周的受试者为94%(p小于0.0001);对于接受8mg/4周的受试者为87%(p小于0.0001);对于接受12mg/4周的受试者为93%(p小于0.0001)。在12周治疗周期内血浆尿酸从基线的降低百分比，对于接受4mg/2周的受试者为38%(p=0.0002);对于接受8mg/2周的受试者为86%(p小于0.0001);对于接受8mg/4周的受试者为58%(p=0.0003);对于接受12mg/4周的受试者为67%(p小于0.0001)。意外地，一些接受PEG-尿酸酶的受试者经历了输注相关的不利事件，即输注反应。这些反应在总输注中出现14%。文中，引用的程度如同每个单独的出版物或专利或专利申请具体地和个别地被指明对于所有目的通过引用整体结合到本文中。本领域技术人员知道，可只寸本发明作出许多修改和变化而不偏离本发明的精神和范围。本文描述的具体实施方案只是通过举例方式提供，本发明只受到所附权利要求的条款以及这些权利要求享有的等效要求全部范围的限定。权利要求1.一种分离的截短的哺乳动物尿酸酶，所述尿酸酶包含在氨基末端或羧基末端或氨基和羧基末端两者截短约1-13个氨基酸的哺乳动物尿酸酶氨基酸序列，还包含在大约46位的氨基酸置换。2.权利要求1的尿酸酶，所述尿酸酶还包含氨基末端氨基酸，其中所述氨基末端氨基酸是丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。3.权利要求2的尿酸酶，其中所述氨基末端氨基酸是苏氨酸。4.权利要求l的尿酸酶，其中所述置换用苏氨酸或丙氨酸进行。5.权利要求3的尿酸酶，其中所述置换用苏氨酸进行。6.权利要求5的尿酸酶，所述尿酸酶包含SEQIDNO.8的氨基酸序列。7.权利要求1-6中任一项的尿酸酶，其中所述尿酸酶与聚合物缀合。8.—种聚乙二醇-尿酸酶缀合物，所述缀合物包含权利要求1-6中任一项的尿酸酶。9.权利要求8的缀合物，所述缀合物在每个尿酸酶亚单位上包含2-12个聚乙二醇分子。10.权利要求9的缀合物，所述缀合物每尿酸酶亚单位包含3-10个聚乙二醇分子。11.权利要求8的缀合物，其中每个聚乙二醇分子的分子量为约1kD至100kD。12.权利要求11的缀合物，其中每个聚乙约1kD至50kD。13.权利要求12的缀合物，其中每个聚乙约5kD至20kD。14.权利要求13的缀合物，其中每个聚乙二醇分子的分子量为二醇分子的分子量为二醇分子的分子量为约10kD。15.—种药物组合物，所逸药物组合物包含权利要求1-5中任一项的尿酸酶。16.—种药物组合物，所逸药物组合物包含权利要求8的缀合物。17.权利要求15的组合物，所述组合物适合于反复给药。18.权利要求16的组合物，所述组合物适合于反复给药。19.一种减少有需要受试者的生物流体中尿酸水平的方法，所述方法包括给予受试者权利要求15的组合物。20.—种减少有需要受试者的生物流体中尿酸水平的方法，所述方法包括给予受试者权利要求16的组合物。21.权利要求19的方法，其中所述生物流体是血液。22.权利要求20的方法，其中所述生物流体是血液。23.—种分离的尿酸酶，所述尿酸酶包含SEQIDNO.14的氨基酸序列。24.权利要求1的分离的截短的哺乳动物尿酸酶蛋白，其中所述N末端氨基酸是甲硫氨酸。25.权利要求24的尿酸酶，所述尿酸酶包含SEQIDNO.7的氨基酸序列。26.—种分离的核酸，所述核酸包含编码权利要求1、权利要求3、权利要求6、权利要求24或权利要求25的蛋白质的核酸序列。27.权利要求26的分离的核酸，其中所述核酸序列有效连接到异源启动子。28.权利要求27的核酸，其中所述启动子是osmB启动子。29.—种核酸载体，所述核酸载体包含权利要求27的核酸。30.—种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求29的载体。31.—种分离的核酸，所述核酸包含编码尿酸酶的核酸序列，所述尿酸酶包含SEQIDNO.7或SEQIDNO.8的氨基酸序列。32.权利要求31的分离的核酸，其中所述核酸序列包含SEQIDNO.9或SEQIDNO.10。33.权利要求31的分离的核酸，其中所述核酸序列有效连接到异源启动子。34.权利要求33的核酸，其中所述启动子是osmB启动子。35.—种核酸载体，所述核酸载体包含权利要求33的核酸。36.—种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求35的载体。37.—种产生尿酸酶的方法，所述方法包括在宿主细胞表达所述核酸序列的条件下培养权利要求30或权利要求36的宿主细胞的步骤，以及分离所表达的尿酸酶的步骤。全文摘要本发明涉及具有尿酸分解活性的遗传修饰蛋白质。更具体地说，本发明涉及包含截短的尿酸氧化酶的蛋白质及其生产方法，包括包含截短的尿酸氧化酶的PEG化蛋白质。文档编号C12N9/06GK101198693SQ200680021018公开日2008年6月11日申请日期2006年4月11日优先权日2005年4月11日发明者J·哈特曼,S·门德洛维茨申请人:萨文特医药公司