专利名称：芦苇γ－谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，尤其涉及芦苇富集重金属相关基因——γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其应用。
背景技术：
随着工业的发展和人类生产活动的加剧，重金属污染已成为全球关注的问题。目前我国存在数千万亩的重金属污染土壤，对人类健康造成了极大地危害。因此，有效地去除重金属污染成为当前一个十分迫切的任务。
利用转基因改良植物技术将新的性状转入高生物量植物中，以此开发高效的转基因植物修复系统，用于重金属污染的土壤修复是一项具有广阔应用前景的技术。
基因工程在植物重金属的富集方面已取得了一些相关的研究进展，已识别和克隆了大量相关基因，并将这些基因转入植物中，用于重金属污染的土壤修复研究。许多实验表明，将细菌、真菌、动物及植物本身与重金属脱毒相关的基因转入高生物量植物，异源表达产物可介导转基因植物耐受和高积累重金属及类似物。
目前，已证明对重金属修复有显著作用的主要有植物络合素(phytochelatins，PCs)。它是由重金属诱导而合成的一类小分子多肽，能鳌合重金属，从而减轻重金属对植物的毒害。PCs并非基因的直接产物，而是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylsysteine synthetase，γ-ECS)、谷胱甘肽合成酶(GS)和植物络合素合酶(PCS)分三步催化而合成。目前，已克隆了多个参与PCs生物合成的基因，并在生物量小的拟南芥和印度芥菜中证实了它们富集重金属的功能。
芦苇(Phragmites communis Trirn)可超富集重金属(Cd2+、Pb2+、Zn2+)，为湿地处理污水的主要植物物种，然而其重金属富集相关基因的克隆特别是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因的克隆尚未见报道。
多花黑麦草、高羊茅、剪股颖为生物量大、生长快的优良草坪草。但是，经检索，将芦苇的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因转入剪股颖以提高它的抗重金属的性能尚未见报道。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种芦苇富集重金属相关基因——γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其应用。
本发明的技术方案在于从芦苇中分离得到γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS，然后将该基因转到高生长量的草坪草中以实现土壤重金属污染的修复。
本发明提供的基因名称为芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS，所述基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。
本发明还提供了一种含上述的芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS的植物表达载体pROK2，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
本发明所述基因PcGCS在培育抗重金属植物中的应用。
将本发明所述基因导入植物细胞，植物就可以获得富集重金属的能力，为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对本发明所述植物表达载体pROK2进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，优选的载体是pROK2。
本发明所述的基因可广泛用于培育抗重金属的生物量大、生长快的植物品种，其中所述植物优选剪股颖。
本发明的有益效果利用现有的植物基因工程技术，本发明首次克隆得到了芦苇的γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS并通过根瘤农杆菌介导的方法将该基因转入生物量大、生长快的植物品种特别是剪股颖中，经过比较分析证明，转基因植株比非转基因植株的富集重金属的能力得到了很大程度的提高。
图1为芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因的cDNA电泳图，其中泳道1为基因的cDNA，M为Marker。
图2为剪股颖抗卡那霉素筛选培养基选择压力的确定图，其中1为0mg/L卡那霉素，2为5mg/L卡那霉素，3为10mg/L卡那霉素。
图3为转基因剪股颖的DNA鉴定图，其中泳道1、2、3、4、5均为剪股颖转基因植株的cDNA，泳道6为Marker。
图4为GCS标准曲线。
具体实施例方式
实施例1、PcGCS的克隆1.1 芦苇总RNA的提取(1)芦苇材料放入预冷的研钵中，加入液氮迅速研磨成均匀的粉末。注意研磨过程中要保证材料浸在液氮中。
(2)待液氮挥发后将材料迅速转入预冷的离心管中，每50-100mg组织材料加入1ml TRIZOL溶液，混匀后，于室温放置5min，12000r/min，2-8℃离心10min去沉淀。
(3)每1ml TRIZOL溶液中加入0.2ml氯仿，振荡15sec充分混匀，于室温放置5min，12000r/min，2-8℃离心15min。
(4)取上清，每1ml TRIZOL加入0.5ml的异丙醇，混匀，室温放置10～20min。
(5)2-8℃ 12000r/min离心10min，弃上清。
(6)加1ml 75％乙醇洗涤沉淀2次，4℃不超过7500r/min离心5min，弃上清。
(7)室温放置晾干后，加入15μl DEPC处理的双蒸水溶解RNA。
1.2 逆转录合成第一链cDNA(1)0.2ml Eppendorf管中，加入下列成分用DNaseI纯化的上述总RNA(0.1μg/μl) 2.0μlOlige(dT)anchored primer(2μM) 2.0μl(2)0℃水浴变性10分钟，立即置于冰浴中。
(3)在10μl反应体系中加入下列成分2.0μl 5×MMLV RT buffer；1.0μl 250μmol/L dNTP mix；0.25μl Rnasin；0.5μl(200u/μl)MMLV逆转录酶；2μl上述RNA变性液。42℃进行逆转录反应1hr。反转录第一链cDNA用于后面的反应。
1.3 PCR以上述逆转录合成第一链cDNA为模板，PCR法扩增基因片段。
(1)PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成引物P15′-TTA TCG GTC TCA AGC AGG-3′引物P05′-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-3′(2)PCR反应体系10×PCR buffer2μlMgCl2(25mmol/L) 1.5μldNTP(each 250μmol/L) 0.2μlP0(10μmol/L) 1μlP1(4μmol/L) 1μl逆转录第一链产物 4μlEx Taq0.2μl无菌水10.1μl(3)PCR反应程序94℃ 5min；94℃ 30sec，50℃ 30sec，72℃ 2min，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物电泳如图1所示。
1.4 5′-RACE按照TaKaRa 5′-Full RACE Core Set说明书所示步骤操作。电泳5′-RACE产物。
1.5 目的片段的回收(1)用刀片切下上述电泳结果中含目的条带的胶条置于1.5ml Eppendorf管中。
(2)称重，加入3-4倍体积的DR-I Buffer，65℃加热10min融化胶块，每隔2min混匀一次保证胶块能充分融化。
(3)加入DR-I Buffer量的1/2体积的DR-II Buffer，均匀混合。
(4)将Spin Cloumn安置于Collection Tube上，将上述溶液转移至Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。
(5)将500μl Rinse A加入Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。
(6)将700μl Rinse B加入Spin Column中，5000rpm离心1min，弃滤液。
(7)重复步骤6，然后12000rpm再离心1min。
(8)将Spin Cloumn安置于新的1.5ml的离心管上，在Spin Cloumn膜的中央处加入预热到60℃的25μl的水或洗脱缓冲液，室温静置1min。
(9)12000rpm离心1min洗脱DNA。
(10)重复步骤9，2次，将所有洗脱液集中收集于一管内，混匀，取少量电泳检查回收效率，其余加入1/10体积的3mol/L NaAc(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1hr。
(11)然后4℃，12000rpm离心15min，用70％冷乙醇洗涤沉淀，弃尽液体，用40μl无菌水溶解沉淀。回收的片段用于后面的连接反应。
1.6 连接用上述的回收目的片段与pGMT载体(购自宝生物工程有限公司，下同)按摩尔比约1∶1的比例进行连接，连接体系如下目的片段 7μlT-vector 1μl10×T4 DNA Ligase Buffer 1μlT4 DNA Ligase1μl混匀并短暂离心，16℃连接过夜。得到重组质粒pGEM-GCS，用于后面的反应。
1.7 CaCl2法制备感受态细胞(1)挑取DH10B单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。
(2)按1∶100-1∶50的比例，取1ml菌液接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养至菌液OD600为0.3-0.6。
(3)将菌液冰浴10min，4℃ 4000rpm离心10min，收集菌体。
(4)沉淀加10ml预冷的0.1M CaCl2悬浮后，冰浴30min。
(5)4℃4000rpm离心10min。沉淀重悬浮于1ml预冷的0.1M CaCl2，混匀并冰水浴中保存，备用或加入15％的甘油置于-70℃中保存。
1.8 热击法转化Ecoli DH10B(1)在无菌条件下吸取100μl感受态细胞，加入1.5ml预冷的无菌Eppendorf管中，加入10μl连接产物(1.6中的重组质粒)，轻轻混匀，立即置于冰上30min。
(2)在42℃恒温水浴中热激90sec(准确记时)。
(3)冰浴3-5min。
(4)加入800μl不含抗生素的LB液体培养基，混匀，37℃振荡培养45-60min。
(5)短暂离心收集菌体，用150μl LB液体培养基重悬菌体，转至含抗生素Amp、X-gal、IPTG的LB固体平板上，用无菌涂布棒涂布。
(6)将平板于37℃正向放置15-30min至液体被吸收，倒置平板，于37℃培养12-16hr，观察平板会有蓝白斑。白斑用于后面的质粒提取。
1.9 碱裂解法提取大肠杆菌质粒(1)挑取白色单菌落，接入含抗生素Amp(50mg/L)的3ml LB液体培养基中，同时也要保存所挑取的白色单菌落于含抗生素Amp(50mg/L)的固体LB平板中，37℃震荡培养12-16h；(2)12000rpm离心30sec，收集培养物中的菌体，尽量弃尽上清；(3)加入100μl冰预冷的溶液I，在涡旋器上使菌体充分重悬；(4)加入200μl溶液II，立即将离心管缓缓颠倒数次，冰浴5-10min；(5)加入150μl冰预冷的溶液III，缓缓颠倒离心管数次直至白色沉淀充分形成，冰浴5-10min；(6)12000rpm离心3min，取上清转入另一微量离心管中，加入2倍体积95％乙醇，混匀后，室温静置3min；12000rpm离心3min，使质粒DNA沉淀；(7)弃尽上清，取200μl TE溶液溶解沉淀；(8)加入等体积冰预冷的5mol/L LiCl溶液，冰浴5min，沉淀大量的RNA；(9)12000rpm，离心3min；(10)转移上清到另一离心管中，加入2倍体积的95％乙醇，混匀后于室温静置3min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；(11)弃上清后用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，弃尽液体；(12)室温干燥后，取20μl含RNaseA(20μg/ml)的TE溶液溶解沉淀，37℃水浴30～60min消化RNA。
(13)为减少损失，可先用TE将总体积补充至200μl，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇，充分振荡5-10min，12000rpm离心5min；(14)取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇，重复以上操作；(15)取上清，加入1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.3)和2倍体积的无水乙醇，混匀后-20℃放置15min，12000rpm离心3min使质粒沉淀；(16)弃上清用1ml 70％乙醇洗涤沉淀，弃液体，用40μl TE或无菌水溶解沉淀。质粒用于后面的反应。
1.10 质粒酶切验证用EcoRI酶切上述质粒，酶切反应体系如下表所示重组质粒pGEM-GCS 16μlEcoRI限制性内切酶 2μl10×Buffer 2μl将上述反应体系混匀并5000rpm离心1min，37℃水浴反应过夜，然后进行1％的TAE琼脂糖凝胶电泳检测。
1.11 DNA测序挑取含有重组质粒的阳性单菌落用含有Amp(50mg/L)的液体LB摇过夜，然后送上海博亚生物技术有限公司测序，得到测序结果基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。
经过NCBIblast分析，上述cDNA序列与禾本科的GSHI同源，证明实验得到的就是芦苇的γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因，命名为芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS。
实施例2、植物表达载体的构建2.1目的基因的获得引物设计及PCR反应的体系和条件(1)设计如下一对PCR扩增引物，引入植物表达载体pROK2(购自宝生物工程有限公司)中所含有的两个酶切位点SacI和XbalI。
P115’-CGAGCTCGA TGG AAG AAA ACC ATG TTA TCG-3’SacIP125’-GCTCTAGAGCTCA GTA TAA CAA GTG CTC G-3’XbalI(2)PCR反应体系10×PCR buffer 2μlMgCl2(25mmol/L) 1.5μldNTP(each 250μmol/L)0.2μlP11(4μmol/L)1μlP12(4μmol/L)1μl重组质粒pGEM-GCS 1μlrTaq(TaKaRa) 0.2μl无菌水 13.1μl(3)PCR反应条件为94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物电泳回收后用于后面的反应。
2.2表达载体的构建将带有SacI，XbalI酶切位点的cDNA与质粒分别进行SacI和XbalI的双酶切，再按照5∶1的比例在T4连接酶的催化下进行过夜连接。反应体系及条件如下(1)酶切反应体系和条件
cDNA/SacI+XbalI6μlSacI 1μl10X Buffer 2μlddH2O 1μl上表体系30℃1h，下表体系37℃1h原反应液 10μlXbalI 1μl0.1％BSA 2μl0.1％TritonX-100 2μl10X Buffer 2μlddH2O 3μl(2)质粒酶切反应体系和条件pROK2质粒 6μlSacI 1μl10X k Buffer 2μlddH2O 1μl上表体系30℃1h，下表体系37℃1h原反应液 10μlXbalI 1μl0.1％BSA 2μl0.1％TritonX-100 2μl10X H Buffer 2μlddH2O 3μl连接反应用T4 DNA Ligase进行，体系和条件同pGEM-T的连接体系和条件。用连接产物转化大肠杆菌，从卡那霉素抗性的菌落中筛选出重组子，提取阳性克隆pROK-GCS的质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，反应体系和条件同鉴定重组子。
2.3测序将含有重组质粒的阳性菌株送上海博亚生物技术有限公司测序，得到的测序结果经过NCBIblast分析，阳性质粒中确实含有芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS的cDNA序列。至此得到了重组表达载体，即含基因PcGCS的植物表达载体pROK-GCS。
实施例3、芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS的功能验证3.1酵母表达载体的构建3.1.1目的基因的获得(1)引物设计设计一对PCR扩增引物(P9、P10)引入酵母表达载体pDR195(购自宝生物工程有限公司)中所含有的两个酶切位点BamHI和NotI。
P95’CGG GAT CCA TGG AAG AAA ACC ATG TTA TCG 3’BamHIP105’ATT TGC GGC CGC TCA GTA TAA CAA GTG CTC G 3’NotI
(2)PCR反应体系10×PCR buffer2μlMgCl2(25mmol/L) 1.5μldNTP(each 250μmol/L) 0.2μlP9(4μmol/L) 1μlP10(4μmol/L) 1μl重组质粒pGEM-GCS 1μlrTaq(TaKaRa) 0.2μl无菌水13.1μl(3)PCR反应条件为94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，35个循环；最后72℃延伸7min。PCR产物电泳回收后用于后面的反应。
3.1.2表达载体的构建步骤将带有BamHI和NotI酶切位点的cDNA与质粒分别进行BamHI和NotI的双酶切，再按照5∶1的比例在T4连接酶的催化下进行过夜连接。反应体系及条件如下(1)cDNA酶切反应体系和条件cDNA/BamHI+Notl 6μlBamHI 1μl10X k Buffer2μlddH2O 1μl上表体系30℃1h，下表体系37℃1h原反应液10μlNotI1μl0.1％BSA2μl0.1％TritonX-1002μl10x H Buffer2μlddH2O 3μl(2)质粒酶切反应体系和条件pDR195质粒 6μlBamHI 1μl10x k Buffer2μlddH2O 1μl上表体系30℃1h，下表体系37℃1h原反应液10μlNotl1μl0.1％BSA2μl0.1％TritonX-1002μl10X H Buffer2μlddH2O 3μl
连接反应用T4 DNA Ligase进行，体系和条件同T载体的连接体系和条件。用连接产物转化大肠杆菌，从卡那霉素抗性的菌落中筛选出重组子，得到酵母表达载体pDR-GCS。提取阳性克隆pDR-GCS的质粒进行PCR鉴定和双酶切鉴定，反应体系和条件同鉴定重组子。
3.2DNA导入酵母(1)挑取酵母菌株(野生型酿酒酵母)的单克隆，接种至10ml液体YPD培养基，30℃，200rpm，培养2-3天；(2)按照1∶50的比例将菌液转移至50ml YPD液体培养基中30℃，200rpm，培养3～5h，此时的菌液OD0.4～0.6。
(3)将菌液分装至10ml无菌离心管中，每管5ml；(4)3000rpm离心5min，收集细胞。用2.5ml无菌ddH2O重悬菌体；(5)3000rpm离心5min，收集细胞。用0.1ml 100mM(1×)LiAc/TE buffer重悬菌体；(6)3000rpm离心1～2min沉淀细胞(仅需将菌体离心至离心管底即可)，用微量移液器小心吸走上清；(7)用50μl 100mM(1×)LiAc/TE buffer重悬菌体，将菌悬液移至灭菌的1.5mlEppendorf管中；(8)将1ml单链担体DNA煮沸5min，快速在冰水中冷却；(注无需每次使用时都煮沸担体DNA，可分装成小份冻存；冻融3～4次后应再煮沸，取出后应保持在冰上)(9)将步骤7准备的样品，3000rpm离心1～2min沉淀细胞，用微量取样器小心吸走上清；(10)按下列顺序加入240μl PEG(50％w/v)(加入后用枪头上下吹打，尽量将菌体悬浮)；36μl 1M(10×)LiAc；25μl单链担体DNA(2.0mg/ml)50μl水和质粒DNA(0.1～10μg)(一般情况下，质粒加入10～40μl即可)；(11)涡旋振荡Eppendorf管1min，直到细胞完全混匀，30℃水浴30min；(12)42℃水浴中热激20～25min；(13)5000rpm离心1～2min，用微量移液器除去转化混合液；(14)吸取0.2～1.0ml无菌水加到每个反应管中，用移液器轻轻抽提以悬浮沉淀；(15)取50μl转化液，均匀涂布在含卡那霉素抗性的培养基上，30℃培养2～4d。用未转化的酵母做对照。
3.3酵母重组子的鉴定3.3.1菌落PCR鉴定初筛(1)平板上的菌落长到肉眼可见时。
(2)将除了模板以外的其他PCR反应液组分准备好，并分装。
(3)用一根灭菌牙签挑取菌落，在PCR管中测一下，放入一个灭菌的1.5ml离心管，对PCR管和1.5ml离心管编号。
(4)PCR扩增，0.8％琼脂糖凝胶电泳。对PCR扩增显现特异性条带的克隆，置于1.5ml离心管中的半截牙签扔到5mlYPD培养基中，30℃培养，24±1小时提取DNA，用DNA作为模板再进行PCR进一步确定。
PCR反应体系及条件如下10×PCR buffer 2μlMgCl2(25mmol/L)1.5μl
dNTP(each 250μmol/L) 0.2μlP0(4μmol/L) 1μlP1(4μmol/L) 1μl菌液 1μlrTaq(TaKaRa) 0.2μl无菌水 13.1μlPCR反应条件为94℃5min；94℃30sec，60℃30sec，72℃2min，35个循环；最后72℃延伸7min。
3.3.2酵母总DNA为模板进行二次鉴定酵母基因组的提取(1)接种重组和空质粒转化子于5ml MD培养基，菌于YPD培养基作对照，30℃，培养16-18小时。
(2)室温下，1500g离心5-10min收集菌体。
(3)100uL TE(pH7.0)重悬后1500g离心5-10min收集菌体。
(4)用2ml的SCED(PH7.5)重悬。
(5)加入1～3mg蜗牛酶，37℃，50min。
(6)加入2ml 1％SDS，轻摇混匀，然后置于冰上5min。
(7)加入1.5ml 5M醋酸钾，轻轻混匀。
(8)10000g离心5-10min，弃上清。
(9)加入2倍体积无水乙醇，室温放置15min。
(10)10000g离心20min，弃上清。
(11)加入0.7mlTE缓冲液。
(12)加入等体积的苯酚∶氯仿(1∶1 V/V)。
(13)加入1/2体积的7.5M醋酸铵溶液。
(14)加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置1hr。
(15)10000g离心20min。
(16)加入lml 75％乙醇漂洗沉淀一次。
(17)干燥后，加入50ul的TE或H2O溶解，-20℃备用。
PCR反应体系的组成和反应条件同菌落PCR，PCR产物0.8％琼脂糖凝胶电泳分析。
3.4GCS含量测定3.4.1温差破碎法提取GCS酵母发酵液4000r/min离心5min，收集菌体，菌体加水-20冰冻过夜，沸水浴煮沸5min，离心上清液用于测定。
DTNB处理方法每1mL待测样品或标准品加入3mL 0.15mol/LNaOH溶液中，摇匀，加入体积分数U＝0.03甲醛1mL，摇匀，静置2min加入5mLDTNB分析溶液，摇匀，在25水浴保温5min。
3.4.2标准品的制备准确称量1.00g/L GCS标准溶液，50.00mg GCS溶于双蒸水中，在50mL容量瓶中定容，避光放置，当日现配。分别取0.10，0.20，0.40，0.80，1.00mL的GCS标准溶液经DTNB处理后，进行测定，制作标准曲线。见图4
3.4.3样品的测定挑取六个转基因阳性克隆J-1，J-2，J-3，J-4，J-5，J-6和六个未转基因克隆w-1，w-2，w-3，w-4，w-5，w-6，进行测量统计。
(1)分别挑取阳性克隆和未转化的克隆至30ml培养基中，培养过夜。
(2)取15ml菌液4000r/min离心5min，水洗两次，收集菌体。
(3)85℃烘干至恒重，称量。
(4)另外15ml菌液用温差破碎法处理。
(5)上清液由DTNB处理。
(6)测定样品在波长412nm处的吸光度，通过计算或从标准曲线上得出GCS含量。
表1样品中GCS的质量浓度
表2样品干重
表3样品中GCS的含量
对表2和3中的两组数据进行分析，可以得出结论，转基因酵母与未转基因的酵母相比，干重并无显著变化而GCS含量提高了30％。
实施例4、农杆菌介导的芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS的剪股颖转化4.1DNA导入农杆菌4.1.1农杆菌感受态细胞的制备(1)活化农杆菌AGL1(购自宝生物工程有限公司)，然后挑取单菌落到10mlYEP中，28℃振摇过夜。
(2)取2ml菌液于100mlYEP中稀释，28℃振摇过夜。将菌液倒入离心管后，冰上放置10min，然后于4℃下3000g离心10min后去上清。
(3)用预冷的0.05mol/L的CaCl2溶液每管5ml轻轻悬浮细胞，冰上放置15-30min后，4℃下3000g离心10min。
(4)弃去上清，用含15％甘油的预冷的。0.05mol/L的CaCl2溶液每管1ml轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟后，即成感受态细胞悬液。
(5)将感受态细胞分装成200μl的小份，-70℃保存待用。
4.1.2转化(1)向200μl农杆菌感受态细胞中加入0.5-1.0μg重组质粒pGEM-GCS，冰上放置5min后，立即放入液氮中5min。取出离心管，37℃保温5min后，用1mLYEP在无菌条件下稀释，28℃振摇2-4h。
(2)取200涂布于含50mg/L卡那霉素(Kan)和40mg/L利福平(Rio)的YEP平板中，28℃培养得到单菌落。
4.1.3转化鉴定(1)挑取农杆菌单菌落，扩增抽提重组质粒pGEM-GCS。
(2)将重组质粒pGEM-GCS转化至DH10B感受态细胞并进行鉴定。
4.2农杆菌介导的剪股颖转化(1)草坪草愈伤组织的诱导剪股颖种子在70％乙醇中浸泡30sec，经10％NaClO消毒10min，无菌水漂洗8次，接种于愈伤诱导培养基上，得到的愈伤用同样的培养基继代。
(2)筛选培养基选择压力的确定将未转化的剪股颖愈伤组织转移到含不同卡那霉素浓度(0，5，10mg/L)的继代培养基上，25℃暗培养两周，然后转移到新的含相应卡那霉素浓度的继代培养基上继续25℃暗培养两周。结果如图2所示。
4.2.1农杆菌准备(1)从-70℃冰箱取出含重组质粒的农杆菌AGL1，于含有抗生素的LB固体培养基上活化。
(2)两天后YEP培养基上长出农杆菌单菌落，挑取单菌落于含有抗生素的10ml液体培养基中振摇培养。
(3)两天后，液体培养的农杆菌OD600为0.8±0.01，将农杆菌划线培养于含有抗生素的固体培养基上。用来转化的农杆菌在培养基上需要生长3天左右。
4.2.2转化方法(1)草坪草愈伤组织转移到新鲜的继代培养基上预培养7天。
(2)农杆菌在固体培养基上生长3天后，离心收集农杆菌再悬浮培养在含乙酰丁香酮的继代培养基上，使初始的OD600＝0.8。
(3)将预培养的愈伤收集到无菌的三角瓶中，倒入上述的农杆菌液，浸没愈伤，静置30min，接着用无菌滤纸吸干愈伤表面多余菌液后，转移到铺有滤纸的共培养基上共培养3天。
(4)共培养3天后，从共培养基上收集愈伤到三角瓶中，经过如下洗涤先用无菌水漂洗愈伤，然后用加有Cef(头孢霉素)的继代培养基洗，这样作为一个循坏，洗2-3个循环，然后无菌滤纸吸干。
(5)然后将愈伤组织转移到选择培养基上，进行筛选。
(6)经过一个月(两轮)的筛选后，将愈伤组织转移到分化培养基上进行再分化。
(7)再分化的愈伤转移到生根培养基上进行生根培养。
4.3CTAB法提取转基因植株基因组DNA(1)称取0.5g的剪股颖叶子，剪碎后用液氮研磨，迅速将粉末转移至1.5ml离心管中，然后加入700μl预热至65℃的2xCTAB提取缓冲液及0.1％的疏基乙醇，轻轻颠倒离心管混匀，然后置于65℃水浴保温2h，不时颠倒混匀。
(2)混合物冷却至室温后加入等体积的酚∶氛仿∶异戊醇(25∶24∶1)，4℃下10000g离心10min。
(3)将水相转移至一干净离心管中，加入等体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，4℃下10000g离心10min。
(4)将水相转移至一干净离心管中，加入两倍体积无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA。
(5)4℃下10000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入100闪含无DNA酶的RNA酶的TE液溶解，37℃水浴30min(6)加入200μl无水乙醇，温和混匀，-20℃放置30min沉淀DNA.4℃下10000g离心10min，弃去液体，并用70％乙醇洗涤两次，室温干燥DNA后，加入40μl无菌水溶解DNA，4℃保存待用。
4.4PCR检测转基因植株以CTAB法提取的DNA为模板，PCR法扩增芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS(1)PCR反应体系10×PCR buffer 2μlMgCl2(25mmol/L) 1.5μldNTP(each 250μmol/L) 0.2μlP11(4μmol/L) 1μlP12(4μmol/L) 1μlDNA模板1μlrTaq(TaKaRa) 0.2μl无菌水 13.1μl(2)PCR反应程序94℃5min；94℃30sec，50℃30sec，72℃2min，35个循环；最后72℃延伸7min。
反应结束后，反应液于0.8％TAE琼脂糖凝胶电泳检测。结果如图3所示，得到了5株阳性植株。
4.5阳性植株富集Cd离子的能力将阳性植株和非转基因植株分别转到含有5mM的CdCl2IB培养基中生长，结果转基因的阳性植株能够存活11天，而非转基因植株生长到6天时间叶子几乎全变黄而死去。
注上述实验中用到的试剂等购自TAKARA、Promega、Sigma等公司。
实验中用到的LB培养基配方0.5％酵母粉、1％NaCl、1％蛋白胨。
继代培养基配方MS培养基+2ppm2，4-D。
生根培养基配方MS培养基+0.5ppmIAA+0.5ppm6-BA。
其它试剂配方见《分子克隆》第三版。
序列表<110>山东大学<120>芦苇γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因PcGCS及其应用<141>2007-5-22<210>1<211>1125<212>cDNA<213>芦苇<400>1atggaagaaa accatgttat cggtctcaag cagggaaagc aaagcatttc gctagaacct60ggtggccagt ttgaacttag cggtgctcct cttgaaacat tacatcaaac ttgtgctgag120gtcaattcac atctttatca ggtcaaagca gttggagaag aaatgggtat aggatttctt180ggacttggtt ttcagccgaa gtgggcgctg agtgatatac caataatgcc caagggaaga240tacgaaataa tgaggaatta catgcctaaa gttggttctc ttggccttga tatgatgttc300cgcacgtgca ctgttcaggt taatcttgac ttcagttcag agaaggatat gataaggaaa360tttcgtgcta gccttgcatt gcaacctatt gcaacagcaa tatttgctaa ttctcccttt420aaagaaggaa aaccaaatgg gtttctcagc ttaagaagcc atatctggac agatactgat480aacaaccgct ctgggatgct tccttttgtc tttgatgact cgtttggatt tgagcaatat540gtggattatg cattagatgt cccaatgtat tttgtatatc gaaataagaa gtacattgac600tgtaccggaa tgccatttcg ggattttatg gaaggaaagc tcccacaagc tcctggggag660ttgcctactc taaatgattg ggagaaccat ctaacaacaa tttttcctga ggttaggttg720aagagataca tagagatgcg gggtgctgat ggtggcccat ggaggagatt gtgtgctttg780cctgcatttt gggttgggct gttatatgac gaggaatcat tacaaagcat tttggatatg840acttttgatt ggacaaagga agagagagag atgctacgac ggaaggtacc gttgactggt900ttgaagacac catttcgtga cggatatgta agagatttag gtgaagatgt tctaaaatta960gccaagagtg gactagaaag aagaggatac aaggaggttg gtttcttgag agaggtcgac1020gaagtagtga gaacaggagt gacaccttct gagaggcttt tgaatctgta cgagaccaag1080tggcaacgca gcgtggaccc tgtcttcgag cacttgttat actga1125<210>2<211>12883<212>DNA<213>人工序列<400>2ccgggctggt tgccctcgcc gctgggctgg cggccgtcta tggccctgca aacgcgccag60aaacgccgtc gaagccgtgt gcgagacacc gcggccgccg gcgttgtgga tacctcgcgg120
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1.芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS，其特征在于所述基因cDNA序列如序列表SEQ ID No.1所示。
2.一种含有权利要求1所述基因PcGCS的植物表达载体pROK2，其特征在于所述载体克隆区域核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。
3.权利要求1所述芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS在培育抗重金属植物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述植物是剪股颖，其含有权利要求1所述的芦苇γ-谷氨酰-半胱氨酸合成酶基因PcGCS。
全文摘要
本发明公开了一种芦苇γ－谷氨酰－半胱氨酸合成酶基因PcGCS及所述基因PcGCS的植物表达载体，本发明还公开了所述基因PcGCS在培育抗重金属植物特别是剪股颖中的应用。实验证明，本发明所述转基因植株比非转基因植株的富集重金属的能力得到了很大程度的提高。
文档编号C12N9/00GK101067136SQ200710014450
公开日2007年11月7日 申请日期2007年5月23日 优先权日2007年5月23日
发明者向凤宁, 赵翠珠, 夏光敏, 于延冲, 乔孟 申请人:山东大学