专利名称：一种同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的双重rt－pcr方法及专用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病的方法，尤其涉及一种同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR方法及专用试剂盒。
背景技术：
牛轮状病毒(bovine rotavirus，BRV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrheavirus，BVDV)是两种引起牛病毒性腹泻的重要病原体。BRV可引起新生犊牛严重腹泻，英国的调查显示，其发病率为60-80％，给养牛业造成很大经济损失。BVDV也是一种广泛存在于世界各国牧场牛群中的病原体，国内王新平等对内蒙古、吉林、宁夏等不同地区进行流行病学调查发现其感染率为16.5-89％。目前随着我国奶牛养殖业规模化、集约化程度的提高，牛腹泻病特别是新生犊牛腹泻病成为困扰我国奶牛养殖业的主要疾病之一，严重阻碍了我国奶牛养殖业的发展。腹泻病的病原有多种，主要包括细菌性病原和病毒性病原。近年来随着奶牛养殖规模的扩大，由多种病原的混合感染的病例在临床上屡见不鲜。轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的混合感染就是其中的一种，发病率虽然较低，但死亡率很高，达70％以上。另外由这两种病原引起的腹泻症状相似，临床上很难区分。
目前，已有多种检测BRV和BVDV的方法，如病毒分离法、中和试验、琼扩试验、电镜观察、ELISA、核酸探针、RT-PCR等，但特异性的针对牛腹泻病的快速诊断方法研究较少，传统的病毒分离、电镜观察、中和试验等方法耗时长，需7-10天才能出诊断结果，而ELISA、琼扩试验、核酸探针等方法敏感性和特异性较差。另外，查阅国内文献资料尚没有关于同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的诊断方法的研究。因此，建立一种同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的快速诊断方法对于腹泻病的流行病学调查、实验室快速鉴别诊断及疾病防治具有重要的意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是利用双重RT-PCR技术建立一种同时快速检测牛轮转病毒和牛病毒性腹泻病毒的方法，并进一步细化制备出相应的诊断试剂盒，为牛腹泻病的快速诊断和流行病学调查提供技术支持。
本发明所述的同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR方法，步骤包括样品的采集，病毒RNA的提取，特异性引物的设计，RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，结果判定；其特征在于所述特异性引物包括牛轮状病毒特异性扩增引物和牛病毒性腹泻病毒特异性扩增引物，其序列是牛轮状病毒所用的特异性扩增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹泻病毒所用的特异性扩增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P4 5`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`；所述RT-PCR扩增采用两步法，反转录时使用的引物为长9bp的随机引物(5`-NNNNNNNNN-3`)，PCR反应时在1个PCR反应管中同时加入了牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒的特异性上、下游引物P1、P2、P3、P4，其中RT-PCR反转录反应体系为10μl，包含有RNA模板2μl，MgCl22μl，10倍反转录缓冲液1μl，DEPC处理水2.75μl，dNTP 1μl，RNase抑制剂0.25μl，AMV反转录酶0.5μl，随机引物0.5μl；反应条件为30℃10min，42℃30min，95℃5min，5℃5min；PCR反应体系为50μl，反转录反应后在反转录反应管中加入PCR缓冲液10μl，引物P1、P2、P3、P4各0.1μl，Taq酶0.25μl，灭菌三蒸水29.35μl；PCR反应条件为94℃预变性2min，94℃30s，55℃30s，72 1min，共30个循环，然后72℃10min；所述结果判定是以阳性对照PCR产物电泳后产生的342bp和196bp条带为标准对样品的结果进行判定，样品结果产生342bp条带的，判定为轮状病毒感染；样品结果产生196bp条带的，判定牛病毒性腹泻病毒感染；样品结果同时产生342bp和196bp两个条带的，判定为牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒混合感染；样品结果没有任何条带的，则判为阴性。
本发明所述的同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR专用试剂盒，包括样品病毒RNA提取试剂，反转录试剂盒，PCR试剂盒，阳性对照品和阴性对照品；其特征在于所述反转录试剂盒由15mM MgCl2，10倍反转录缓冲液，DEPC处理水；dNTP；RNase抑制剂；AMV反转录酶；50μM随机引物组成，保存温度-20℃；其反应体系为MgCl22μl，10倍反转录缓冲液1μl，DEPC处理水2.75μl，dNTP 1μl，RNase抑制剂0.25μl，AMV反转录酶0.5μl，随机引物0.5μl，RNA模板2μl；所述PCR试剂盒由PCR缓冲液，20mM牛轮状病毒特异性扩增引物和牛病毒性腹泻病毒特异性扩增引物P1、P2、P3、P4，Taq酶，灭菌三蒸水组成，保存温度-20℃；其反应体系为PCR缓冲液10μl，牛轮状病毒所用的特异性扩增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹泻病毒所用的特异性扩增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P45`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`各0.1μl，Taq酶0.25μl，灭菌三蒸水29.35μl。
RT-PCR方法可以针对不同的靶序列进行快速、准确的诊断，在国内外得到了广泛应用。本发明依据RT-PCR方法针对牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒设计了两对特异性引物，建立了能够同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR方法，可在一次RT-PCR反应中同时检测出引起牛腹泻的两种病毒(牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒)，检测敏感性为1pg病毒RNA，具有很好的特异性和敏感性，本发明方法与病毒分离、中和试验、ELISA、核酸探针等方法相比，明显地降低了检测成本和检测时间，非常适于牛病毒性腹泻病的试验室快速诊断和流行病学研究。
本发明方法与分别检测两种病毒的RT-PCR方法相比，同样很大程度上降低了检测时间和检测成本，本发明方法仅需4个多小时即可出结果，每份样品的检测费用也只有约30元。
图11％琼脂糖凝胶电泳示各个毒株RT-PCR检测结果其中1.BVDV分离株；2.BVDV标准株；3.BRV和BVDV分离株；4.BRV和BVDV标准株(oregon C24v)；5.BRV CHLY分离株；6.BRV标准株(NCDV)。
图2琼脂糖凝胶电泳示分别提取牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒的细胞培养物、鸡轮状病毒、猪瘟病毒以及正常细胞培养物RNA进行RT-PCR试验结果(特异性扩增结果)其中1.正常细胞培养物；2.猪瘟病毒；3.鸡轮状病毒；4.BRV和BVDV。
结果BRV和BVDV组能得到目的条带，其它均没有扩增出任何条带。
图3琼脂糖凝胶电泳示对不同浓度的RNA进行RT-PCR扩增检测敏感性试验结果其中1. 1pg RNA；2. 10pgRNA；3. 100pg RNA；4. 1μg RNA。
结果发现本方法能检测出1pg的病毒RNA。
具体实施例方式
实施例11.样品采集与处理采腹泻牛粪便样品约10g，将粪便样品加灭菌生理盐水制备成1∶5粪便悬液，4000rpm/min，离心10min，取上清备用；或尸体剖检时采取肠系膜淋巴结、肠管粘膜或脾脏低温保存送试验室，取以上组织样品约5g，剪碎，加灭菌生理盐水研磨，然后，4000rpm/min，离心10min，取上清备用。
2.样品RNA模板的提取(1)取步骤1上清液500μl加入1.5ml离心管，然后加入500μl TRIZOL LS，充分混匀，室温放置10min。
(2)加入200μl氯仿，用力振荡，使溶液呈乳白色，无分相，室温放置10min。
(3)4℃13000rpm/min离心15min，取上层液相移入另一离心管(勿吸动白色中间相)。
(4)加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，室温放置10min。
(5)4℃13000rpm/min离心15min，小心吸去上清。
(6)1ml 75％乙醇洗一遍，4℃ 8000rpm/min离心10min，小心吸去上清，干燥5min。
(7)加入10μl DEPC处理水，然后立即做反转录。若要保存，置-20℃，可保存1个月左右。
3.使用本发明所述RT-PCR方专用试剂盒进行以下试验(1)反转录反应反应体系为10μl，在200μl的PCR反应管中依次加入10倍反转录缓冲液1μl，DEPC处理水2.75μl，MgCl22μl，dNTP 1μl，随机引物(5`-NNNNNNNNN-3`)0.5μl，RNA模板2μl，RNase抑制剂0.25μl，AMV反转录酶0.5μl。
反应条件为30℃10min，42℃30min，95℃5min，5℃5min。
同时设1个阳性对照和1个阴性对照，反应体系和反应条件同上，不同的是分别以该试剂盒的阳性对照品(轮状病毒和病毒性腹泻病毒的RNA模板，其浓度为100ng/ul)和阴性对照品(DEPC水)代替样品RNA。
(2)PCR反应反应体系为50μl。反转录反应后在反转录管中加入PCR缓冲液10μl，牛轮状病毒所用的特异性扩增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹泻病毒所用的特异性扩增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P4 5`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`各0.1μl，Taq酶0.25μl，灭菌三蒸水29.35μl。
PCR反应条件为94℃预变性2min，94℃30s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，然后72℃10min。
(3)琼脂糖凝胶电泳检测各取5μl PCR产物与DL 2000Marker，分别与1μl加样缓冲液混匀后加样于1％的琼脂糖凝胶，80V电泳30-40min，利用凝胶成像系统照相，分析电泳结果。
(4)结果判定首先看阳性管与阴性管PCR产物的电泳结果，阳性管PCR产物电泳后应产生两条带，分别为342bp和196bp，而阴性管没有条带。然后再看样品管的结果，如果产生342bp的条带，判定为轮状病毒感染；如果产生196bp的条带，判定牛病毒性腹泻病毒感染，如果产生342bp和196bp两个条带，判定轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒混合感染；如果没有任何条带则判为阴性。
权利要求
1.一种同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR方法，步骤包括样品的采集，病毒RNA的提取，特异性引物的设计，RT-PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，结果判定；其特征在于所述特异性引物包括牛轮状病毒特异性扩增引物和牛病毒性腹泻病毒特异性扩增引物，其序列是牛轮状病毒所用的特异性扩增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹泻病毒所用的特异性扩增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P4 5`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`；所述RT-PCR扩增采用两步法，反转录时使用的引物为长9bp的随机引物(5`-NNNNNNNNN-3`)，PCR反应时在1个PCR反应管中同时加入了牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒的特异性上、下游引物P1、P2、P3、P4，其中RT-PCR反转录反应体系为10μl，包含有RNA模板2μl，MgCl22μl，10倍反转录缓冲液1μl，DEPC处理水2.75μl，dNTP 1μl，RNase抑制剂0.25μl，AMV反转录酶0.5μl，随机引物0.5μl；反应条件为30℃ 10min，42℃ 30min，95℃ 5min，5℃ 5min；PCR反应体系为50μl，反转录反应后在反转录反应管中加入PCR缓冲液10μl，引物P1、P2、P3、P4各0.1μl，Taq酶0.25μl，灭菌三蒸水29.35μl；PCR反应条件为94℃预变性2min，94℃ 30s，55℃ 30s，72 1min，共30个循环，然后72℃ 10min；所述结果判定是以阳性对照PCR产物电泳后产生的342bp和196bp条带为标准对样品的结果进行判定，样品结果产生342bp条带的，判定为轮状病毒感染；样品结果产生196bp条带的，判定牛病毒性腹泻病毒感染；样品结果同时产生342bp和196bp两个条带的，判定为牛轮状病毒和牛病毒性腹泻病毒混合感染；样品结果没有任何条带的，则判为阴性。
2.权利要求1所述的同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR专用试剂盒，包括样品病毒RNA提取试剂，反转录试剂盒，PCR试剂盒，阳性对照品和阴性对照品；其特征在于所述反转录试剂盒由15mM MgCl2，10倍反转录缓冲液，DEPC处理水；dNTP；RNase抑制剂；AMV反转录酶；50μM随机引物组成，保存温度-20℃；其反应体系为MgCl22μl，10倍反转录缓冲液1μl，DEPC处理水2.75μl，dNTP 1μl，RNase抑制剂0.25μl，AMV反转录酶0.5μl，随机引物0.5μl，RNA模板2μl；所述PCR试剂盒由PCR缓冲液，20mM牛轮状病毒特异性扩增引物和牛病毒性腹泻病毒特异性扩增引物P1、P2、P3、P4，Taq酶，灭菌三蒸水组成，保存温度-20℃；其反应体系为PCR缓冲液10μl，牛轮状病毒所用的特异性扩增引物P15`-GTATGGTATTGAATATACCAC-3`，P25`-GATCCTGTTGGCCATCC-3`；牛病毒性腹泻病毒所用的特异性扩增引物P35`-GTAGTCGTCAGTGGTTCG-3`，P4 5`-GCCATGTACAGCAGAGAT-3`各0.1μl，Taq酶0.25μl，灭菌三蒸水29.35μl。
全文摘要
本发明公开了一种同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的双重RT－PCR方法，包括样品的采集，病毒RNA的提取，特异性引物的设计，RT－PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，结果判定等步骤；本发明同时还公开了同时检测牛轮状病毒与牛病毒性腹泻病毒的专用试剂盒，包括样品病毒RNA提取试剂，反转录试剂盒，PCR试剂盒，阳性对照品和阴性对照品。利用本发明方法和试剂盒可在一次RT－PCR反应中同时检测出引起牛腹泻的两种病毒，检测敏感性为1pg病毒RNA，具有很好的特异性和敏感性，本发明方法与病毒分离、中和试验、ELISA、核酸探针等方法相比，明显地降低了检测成本和检测时间，非常适于牛病毒性腹泻病的试验室快速诊断和流行病学研究。
文档编号C12Q1/68GK101063176SQ20071001445
公开日2007年10月31日 申请日期2007年5月23日 优先权日2007年5月23日
发明者杨少华, 王长法, 高运东, 杨宏军 申请人:山东奥克斯生物技术有限公司