专利名称：半滑舌鳎微卫星标记HSTS_lx的检测方法
技术领域：
本发明属于半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)DNA分子遗传标记技术，涉及一种检测半滑舌鳎微卫星标记HSTS_lx的技术方法，具体是半滑舌鳎微卫星标记HSTS_lx的检测方法。
背景技术：
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)属鲽形目、舌鳎科、舌鳎属，是一种暖温性近海大型底层鱼类，终年生活栖息在我国近海海区，是我国重要的海水养殖新品种。为合理利用和保护野生半滑舌鳎种质资源，一些学者利用同工酶技术、RAPD技术及AFLP技术研究了半滑舌鳎的遗传结构及其遗传多样性(庄志猛等，《海洋水产研究》，2006，2期，10-16页；韩志强等，《中国水产科学》，2007，2期，192-200页)。然而由于同工酶标记、RAPD标记和AFLP标记都属于显性遗传标记，检测效率不如微卫星标记等共显性标记高。另外，同工酶标记的缺点是多态性低，RAPD标记的稳定性不好，AFLP标记操作繁琐，这些都大大限制了它们的应用。而微卫星序列广泛分布于真核生物基因组中，其特点是种类多，等位基因数目多，多态性高，共显性，孟德尔遗传方式，并随机分布于基因组中，而且微卫星际记检测效率高，结果稳定。但由于缺乏半滑舌鳎微卫星标记，限制了其分子遗传学研究的发展，所以迫切需要获取微卫星标记以进行半滑舌鳎遗传多样性和系谱认证等方面的研究和应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种半滑舌鳎DNA分子遗传标记技术，即半滑舌鳎微卫星标记HSTS_lx的快速检测方法，以弥补已有技术的不足。
本发明的基本构思主要是利用半滑舌鳎EST序列中含有的微卫星核心序列，在其两端设计特异性引物并进行PCR检测，从而快速地检测半滑舌鳎每个个体在此微卫星区的遗传变异，获得该引物(微卫星标记HSTS_lx)对半滑舌鳎的多态性图谱，通过图谱直观地检测出每个个体的基因型。基于上述背景现状和实际要求，本发明从半滑舌鳎EST序列中获取了一个微卫星标记，命名为HSTS_lx，该微卫星标记HSTS_lx可用于半滑舌鳎遗传多样性分析和系谱认证。
本发明是按照以下操作技术方案完成的首先提取半滑舌鳎血液中的基因组DNA并稀释备用；再利用半滑舌鳎EST序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对半滑舌鳎不同地理群或半滑舌鳎群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定每个个体的基因型，获得半滑舌鳎的遗传多态性图谱。
提取半滑舌鳎基因组DNA，将其稀释为50ng/μl，每个PCR反应中加入1μl，反应总体积为25μl。
含有微卫星序列的EST序列为1 attcgttttt tttttttttt ttagaatgaa tcacaaaaat ctttatttct ttttcttaga61 cactgaaaga ctgagcatca taaccagcag aaatgaatcc tttttagaag ttttcttttt121 ctaattcttg ttaaaagaca gaaatgcaga gaagagagta aaaccaggag cagagtctca181 gagagtcaga tcaggactga gaacactggt ttgtccacag tgtctctgtg agtggagtgt241 gggagccctg ggtggcctca caggtcacag tggtcacctt catccactgg tcagcaggga301 gcctcagcgt gctgctccag ctgtagtggc cgtccttctc catcagccca cggctcctgc361 tctcctccca gctgctgctg ctgctgctgc tgataccgcc caccttccag gacagagtcc421 agtctgaggg gaagcccttg ttggccagac acgtgagcgt ggccttaccc tgctgcagct481 cctggctgga gggaggcagc actgtcaggg tggggggggc aaaaactgta ggagacagca541 gtcactttag aggacagtga ggagacagat gtcagtccaa caacacacac ccagacacat其中微卫星核心序列为gctgctgctgctgctgctgctHSTS_lx微卫星引物序列为正链5’-TAGTGGCCGTCCTTCTCCAT-3’，负链5’-TGACAGTGCTGCCTCCCTCC-3’，使用该引物时的退火温度为58℃。
微卫星核心序列和引物序列是本发明的核心，在半滑舌鳎遗传多样性检测中呈现多态性。
PCR扩增的加样参数为每个PCR反应总体积为25μl，包括50ng半滑舌鳎基因组DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；上述的引物各10pmol；加ddH2O至25μl。使用该引物时设置PCR仪的程序参数为94℃变性5min；94℃45sec，58℃1min，72℃40sec，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
PCR产物的检测步骤将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶中以15W恒功率电泳1.5小时进行分离。电泳结束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，再以0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，用3％的碳酸钠溶液显色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到半滑舌鳎微卫星标记HSTS_lx的多态性图谱。
因此，本发明的特点是可快捷的获得半滑舌鳎的HSTS_lx微卫星标记的遗传变异图谱，方法简便。而且，相对于其它分子遗传标记技术而言，微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，所得结果可直观地检测出半滑舌鳎每个个体的基因型；而应用于不同地理群或半滑舌鳎群内个体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。
图1是本发明微卫星标记HSTS_lx对半滑舌鳎23个个体的检测图谱(编号1-23是半滑舌鳎的23个个体)。
具体实施例方式
下面通过实施例详细叙述本发明在半滑舌鳎HSTS_lx微卫星核心序列DNA分子遗传标记技术方法。首先提取半滑舌鳎血液中的基因组DNA并稀释备用；再利用半滑舌鳎EST序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对半滑舌鳎不同地理群或半滑舌鳎群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，确定每个个体的基因型，即获得半滑舌鳎的遗传多态性图谱。
1、半滑舌鳎基因组DNA的提取将100μl半滑舌鳎血液加入Eppendorf管中，再加入细胞裂解液500μl和20mg/ml的蛋白酶K 5μl，轻轻摇匀，37℃过夜。然后在裂解好的样品中加入600μl酚氯∶仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合液，晃动20min后12000rpm离心10min，取上清液。再加入酚∶氯仿∶异戊醇混合液，重复上述操作3次。再取上清液，加入2倍体积冷却的无水乙醇和1/10体积的3mol/L的醋酸钠，12000rpm离心10min，弃去上清液，保留DNA沉淀，再用70％乙醇洗涤该沉淀2次，待乙醇挥发完全后，以TE缓冲液溶解DNA，4℃保存。
2、微卫星引物的设计在半滑舌鳎EST序列基础上，利用微卫星DNA两侧的序列在同一物种相对于核心序列的高度保守性，据此在其两端设计特异性引物，用其扩增出该位点的微卫星片段。由于微卫星核心序列突变率相对较高，造成微卫星DNA核心序列重复次数的增加或减少，即微卫星DNA序列长度的变化，这是检测微卫星多态性的根源。本发明的微卫星区核心序列两端的特异性引物序列为正链5’-TAGTGGCCGTCCTTCTCCAT-3’，负链5’-TGACAGTGCTGCCTCCCTCC-3’，使用该引物时的退火温度为58℃。
3、PCR扩增首先加样，加样量如下半滑舌鳎基因组DNA(50ng/L)，1μl；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+(25mmol/L)，1.5μl；Taq酶(5u/μl)，0.2μl；dNTP(各2.5mmo/L)，1μl；引物(各10pmol/μl)，1μl；加灭菌水至25μl。其次，进行PCR反应，其PCR扩增仪程序参数为94℃变性5min；94℃45sec，58℃1min，72℃40sec，35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
4、PCR产物的检测将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，电泳仪功率为15W，电泳时间为1.5小时左右。电泳结束后，首先用10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，3％的碳酸钠溶液显色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min即可得到半滑舌鳎在HSTS_lx微卫星核心序列的多态性图谱，如图1所示。
<110>中国海洋大学<120>半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)微卫星标记HSTS_lx的检测方法<160>1<210>1<211>600<212>DNA<213>半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)<220>
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权利要求
1.一种半滑舌鳎微卫星标记HSTS_lx的检测方法，其特征在于首先提取半滑舌鳎血液中的基因组DNA并稀释备用；再利用半滑舌鳎EST序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对半滑舌鳎不同地理群或半滑舌鳎群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，从而确定每个个体的基因型，获得半滑舌鳎的遗传多态性图谱。
2.如权利要求1所述的半滑舌鳎微卫星标记HSTS_lx的检测方法，其特征在于上述提取的半滑舌鳎基因组DNA稀释为50ng/μl。
3.如权利要求1所述的半滑舌鳎微卫星标记HSTS_lx的检测方法，其特征在于微卫星核心序列两端设计的特异性引物序列分别为正链5’-TAGTGGCCGTCCTTCTCCAT-3’，负链5’-TGACAGTGCTGCCTCCCTCC-3’，使用该引物时的退火温度为58℃。
4.如权利要求1所述的半滑舌鳎微卫星标记HSTS_lx的检测方法，其特征在于对半滑舌鳎不同地理群或半滑舌鳎群内个体的基因组DNA进行的PCR扩增，其加样参数为每个PCR反应总体积为25μl，包括50ng半滑舌鳎基因组DNA；10×PCR Buffer，2.5μl；Mg2+1.5mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；上述特异性引物各10pmol；最后加ddH2O至25μl；使用该引物时设置PCR仪的程序参数为94℃变性5min；94℃45sec，58℃1min，72℃，40sec，该反应进行35个循环；72℃延伸5min，4℃保存。
5.如权利要求1所述的半滑舌鳎微卫星标记HSTS_lx的检测方法，其特征在于对PCR产物进行检测的步骤将PCR产物在8％的变性聚丙烯酰胺凝胶中以15W恒功率电泳1.5小时进行分离，以10％的冰醋酸溶液浸泡30min，然后蒸馏水冲洗5min，再以0.1％的硝酸银溶液浸泡30min，用3％的碳酸钠溶液显色5min，最后用10％的冰醋酸溶液浸泡5min，即可得到半滑舌鳎在HSTS_lx微卫星核心序列的多态性图谱。
6.半滑舌鳎微卫星标记HSTS_lx应用于半滑舌鳎群体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建。
全文摘要
一种半滑舌鳎微卫星标记HSTS_lx的检测方法。首先提取半滑舌鳎血液中的基因组DNA并稀释备用；再利用半滑舌鳎EST序列中含有的微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对半滑舌鳎不同地理群或半滑舌鳎群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，并获得半滑舌鳎的遗传多态性图谱。本发明的特点是可快捷的获得半滑舌鳎遗传标记HSTS_lx的遗传变异图谱，方法简便。而且，相对于其它分子遗传标记技术而言微卫星标记符合孟德尔遗传模式，呈共显性遗传，所得结果可直观地检测出半滑舌鳎每个个体的基因型；应用于不同地理群或半滑舌鳎群内个体间遗传标记、系谱认证和遗传图谱的构建等。
文档编号C12Q1/68GK101038269SQ20071001419
公开日2007年9月19日 申请日期2007年4月16日 优先权日2007年4月16日
发明者刘云国, 李八方 申请人:中国海洋大学