专利名称：一种y优系列杂交水稻种质的鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种Y优系列杂交水稻种质的鉴定方法，属于植物品种鉴定技 术领域。
技术背景有效保证杂交水稻种子纯度，是杂交水稻推广应用的重要环节，而建立一 套快速、准确、高效鉴定杂交水稻种质的技术体系，是解决这一问题的关键。 目前田间种植鉴定被认为是杂交水稻种子纯度鉴定方法中最准确、最可靠的方 法。但是田间种植鉴定周期长而且易受外界环境的影响，存在较大的局限性。 针对这一问题，先后提出了种子籽粒形态鉴定，酯酶同工酶鉴定，DNA (英文 deoxyribonucleic acid的縮写，中文译文为脱氧核糖核酸)分子标记鉴定等方 法用于鉴定杂交稻种子纯度。但前两种方法在品种间变异有限，再加上酯酶同 工酶具有组织特异性，对取材有严格要求，因此这两种方法都无法广泛应用。 DNA分子标记鉴定法则因其反映生物个体在DNA水平的遗传多样性，具有准确可 靠、多态性丰富、取材方便、不受季节和组织特异性限制、操作技术简单等优 点而脱颖而出，成为目前杂交稻种子纯度鉴定方法研究的主要对象。植物品种 鉴定中用多个引物去标记品种，形成特异的DNA片段，经电泳形成的带纹组合 在 -起组成的遗传标记系统称为DNA指纹图谱，是目前标记能力最强的分子标 记系统。从1995年以来，我国各级科研机构和学者，在DNA指纹图谱用于作物 品种鉴定和种子纯度，尤其是杂交种纯度鉴定方面进行了大量的研究。总结目 前的研究成果，SSR (英文simple sequence r印eat的縮写，中文译文为简单 重复序列)分子标记技术因简单、快速、重复性好、信息量相对较大、具有共 显性等特点，能够准确、高效地鉴定种质及分辨品种亲缘关系。随着水稻基因 组测序完成和SSR引物开发技术的发展，使水稻SSR标记技术突破了引物开发 成本高的局限性，更因SSR引物便于交流，适用范围广等诸多优点，而成为建 立DNA指纹图谱的首选分子标记技术。近年来，两系杂交稻研究发展迅速，特别是广适性光温敏不育系Y58S的选 育为高产、优质、多抗的两系杂交稻新品种选育奠定了重要基础， 一批以Y58S为母本配制的Y优系列杂交水稻新品种由于具有高产、优质、多抗等诸多优点， 在生产上迅速得到大面积推广。但是，两系法杂交稻制种因其母本育性受到光、 温等生态因子的调控，制种纯度始终存在一些风险，大面积生产要求制种后获 得的杂交稻种子能够进行快速、准确的纯度检测；同时，Y优系列新品种的品种 权保护也需要分子标记提供新的技术支持。因此，迫切需要建立一种分子标记 组合来为种子纯度的快速检测或Y优系列品种种质的鉴定提供技术支持。 发明内容本发明要解决的技术问题是，针对现有技术存在的不足，提出一种以DNA 分子水平进行Y优系列杂交水稻品种种质鉴定的方法，利用该方法可鉴定Y优 系列杂交水稻及其亲本种质，并可在短时间内检测大量种子的种质，从而达到 鉴定种子纯度的目的，减少杂交水稻种子生产的风险。本发明的技术解决方案是，所述Y优系列杂交水稻种质鉴定的方法为下述 步骤(1) 、以下列方式筛选出可用于Y优系列杂交水稻种质鉴定的引物① 、在Gramene数据库(美国康奈尔大学建)中找到水稻12条染色体， 从每条染色体上随机择出5-10个SSR引物。② 、从步骤①所得SSR引物中择出可用于鉴定Y优系列杂交水稻种质的 引物，这种可用于鉴定Y优系列杂交水稻种质的引物是第5染色体的RM (引 物编号前缀)164，所述RM164的DNA序列为正向序歹U TCTTGCCCGTCACTGCAGATATCC ，反向序列GCAGCCCTAATGCTACAATTCTTC， 或第7染色体的RM18，所述RM18的DNA序列为正向序歹U TTCCCTCTCATGAGCTCCAT，反向序歹ij GAGTGCCTGGCGCTGTAC， 或第10染色体的RM258，所述RM258的DNA序列为正向序列TGCTGTATGTAGCTCGCACC,反向序歹ij TGGCCTTTAAAGCTGTCGC， 或上述引物的组合。(2) 、使用上述步骤(l)所得可用于Y优系列杂交水稻种质鉴定的引物对送鉴水稻样品进行PCR (英文Polymerase chain reaction的縮写，中文译文为聚合酶 联式反应)扩增①、利用PCR体系进行PCR扩增，所用PCR体系的成份是浓度为25ng/ ti 1的DNA模板 1 U 1PH值为8.3的IOXPCR缓冲液 2ul浓度为2.5mM的dNTPs 1 y 1浓度为5U/tU的Taq酶 0.2 u 1浓度为10pM的正向序列引物 0.5 ul浓度为10pM的负向序列引物 0.5去离子无菌水 14.8②、利用上述步骤①给出的PCR体系按照以下程序实施PCR扩增a. 94。C温度下对上述PCR体系进行4分钟时间的DNA变性处理；b. 94。C温度下对步骤a所得经过DNA变性处理的PCR体系进行45秒 钟DNA变性处理；c. 52-59X:温度下对上述步骤b给出的PCR体系进行45秒钟复性处理；d. 72"C温度下对步骤c所得经过复性处理的PCR体系进行45秒钟DNA 合成延伸处理；e. 依序重复步骤b 步骤d，重复35 40次；f. 72"C温度下对步骤e所得经过35 40次步骤b 步骤d重复处理的 PCR体系进行5分钟DNA合成延伸处理，得DNA特异标记。PCR扩增结束。(3) 、对步骤(2)所得DNA特异标记进行电泳检测① 、使用聚丙稀酰胺含量为6%的凝胶对步骤(2)所得DNA特异标记进行 电泳分离处理，处理时间1.5 2小时；② 、对步骤①所得经过电泳分离处理的DNA特异标记进行银染显色处理 得DNA特异标记分布图。电泳检测结束。(4) 、根据步骤(3)所得DNA特异标记分布图制作与送鉴水稻样品对应的分子 身份证号码。具体制作方法是，DNA特异标记分布图中获得扩增的DNA特异 标记显示的位置标注数字"1 "，未获得扩增的DNA特异标记显示的位置标注数 字"0"，由此组成与送鉴水稻样品对应的分子身份证号码。当分子身份证号码的第一位数为"1"时，只要第二至第五位数中出现一位数为"1"，即可作出该送鉴水稻样品为Y优系列杂交水稻的鉴定结论，否则鉴定结论相反。例如Y优 系列杂交水稻之中的Y优1号、Y优7号和Y优8号的分子身份证号码依序分 别为10010011001100、 100100U001000和10100110001001。对本步骤(4)得到的上述Y优系列杂交水稻分子身份证号码的第一位数为1 的对应标记进行DNA测序，得到Y优系列杂交水稻之一的Y优1号(又称Y两 优l号)的一个序列标签位点，其序列如下该序列标签位点的DNA序列可作为Y优系列杂交水稻之一的Y两优1号 种质鉴定的补充。本发明的有益效果是，利用本方法可鉴定出Y优系列杂交水稻品种及其亲 本种质。检测时间短、数量大、效率高，种子纯度鉴定准确，从而可大大减少 杂交水稻大面积生产的风险。
具体实施例方式实施例1:(1) 、以下列方式筛选出可用于Y优系列杂交水稻种质鉴定的引物① 、在Gmmene数据库中，找到水稻12条染色体，从每条染色体上随机 择出5个SSR引物。② 、从步骤①所得SSR引物中找出第5染色体的RM164，该RM164的 DNA序列为正向序歹U TCTTGCCCGTCACTGCAGATATCC， 反向序列GCAGCCCTAATGCTACAATTCTTC。(2) 、使用上述步骤(l)所得引物对送鉴水稻样品07A1和水稻样品07A2进行 PCR扩增①、利用PCR体系进行PCR扩增，所用PCR体系的成份是 浓度为25ng/n 1的DNA模板 1 n 1PH值为8.3的10 X PCR缓冲液 2 u 1浓度为2.5mM的dNTPs 1 u 1浓度为5U/U 1的Taq酶 0.2 U 1浓度为10pM的正向序列引物 0.5 Ul浓度为10pM的负向序列引物 0.5 yl去离子无菌水 14.8 tU②、利用上述步骤①给出的PCR体系按照以下程序实施PCR扩增a. 94。C温度下对上述PCR体系进行4分钟时间的DNA变性处理；b. 94t:温度下对步骤a所得经过DNA变性处理的PCR体系进行45秒 钟DNA变性处理；c. 52。C温度下对上述步骤b给出的PCR体系进行45秒钟复性处理；d. 72°C温度下对步骤c所得经过复性处理的PCR体系进行45秒钟DNA 合成延伸处理；e. 依序重复步骤b 步骤d，重复35次；f. 72卩温度下对步骤e所得经过35次步骤b 步骤d重复处理的PCR 体系进行5分钟DNA合成延伸处理，得DNA特异标记。PCR扩增结束。(3) 、对步骤(2)所得DNA特异标记进行电泳检测.-① 、使用聚丙稀酰胺含量为6%的凝胶对步骤(2)所得DNA特异标记进行 电泳分离处理，处理时间1.5小时；② 、对步骤①所得经过电泳分离处理的DNA特异标记进行银染显色处理 得DNA特异标记分布图。电泳检测结束。(4) 、根据步骤(2)所得DNA特异标记分布图制作与送鉴水稻样品07A1和水 稻样品07A2对应的分子身份证号码。DNA特异标记分布图中获得扩增的DNA 特异标记显示的位置标注数字"1 ",未获得扩增的DNA特异标记显示的位置标 注数字"0"，由此组成与送鉴水稻样品对应的分子身份证号码。鉴定结果显示， 水稻样品07A1的分子身份证号码的前五位数为10010，故可得出送鉴水稻样品 07A1的种质是Y优系列杂交水稻的鉴定结论；水稻样品07A2的分子身份证号 码的前五位数为00011，故送鉴水稻样品07A2为非Y优系列杂交水稻品种。实施例2:
(1) 、以下列方式筛选出可用于Y优系列杂交水稻种质鉴定的引物
① 、在Gramene数据库中，找到水稻12条染色体，从每条染色体上随机 择出IO个SSR引物。
② 、从步骤①所得SSR引物中找出可用于鉴定Y优系列杂交水稻种质的 引物第5染色体的RM164、第7染色体的RM18和第10染色体的RM258,其 中，
第5染色体的RM164的DNA序列为
正向序列TCTTGCCCGTCACTGCAGATATCC，
反向序歹ij GCAGCCCTAATGCTACAATTCTTC, 第7染色体的RM18的DNA序列为
正向序列TTCCCTCTCATGAGCTCCAT，
反向序列GAGTGCCTGGCGCTGTAC， 第10染色体的RM258的DNA序列为
正向序列TGCTGTATGTAGCTCGCACC，
反向序列TGGCCTTTAAAGCTGTCGC。
(2) 、使用上述步骤(l)所得引物对送鉴水稻样品07B1和水稻样品07B2进行 PCR扩增
①、利用PCR体系进行PCR扩增，所用PCR体系的成份是
浓度为25ng/ tx 1的DNA模板 1 y 1
PH值为8.3的IOXPCR缓冲液 2ul 浓度为2.5mM的dNTPs 1 u 1
浓度为5U/"的Taq酶 0.2 u 1
浓度为10pM的正向序列引物 0.5 U 1
浓度为10pM的负向序列引物 0.5 ul
去离子无菌水 14.8 ul
②、利用上述步骤①给出的PCR体系按照以下程序实施PCR扩增
a. 94-C温度下对上述PCR体系进行4分钟时间的DNA变性处理；
b. 94t:温度下对步骤a所得经过DNA变性处理的PCR体系进行45秒钟DNA变性处理；
c. 59。C温度下对上述步骤b给出的PCR体系进行45秒钟复性处理；
d. 72。C温度下对步骤c所得经过复性处理的PCR体系进行45秒钟DNA
合成延伸处理；
e. 依序重复步骤b 步骤d，重复40次；
f. 72。C温度下对步骤e所得经过40次步骤b 步骤d重复处理的PCR 体系进行5分钟DNA合成延伸处理，得DNA特异标记，PCR扩增结束。
(3)、对步骤(2)所得DNA特异标记进行电泳检测
① 、使用聚丙稀酰胺含量为6%的凝胶对步骤(2)所得DNA特异标记进行 电泳分离处理，处理时间2小时；
② 、对步骤①所得经过电泳分离处理的DNA特异标记进行银染显色处理 得DNA特异标记分布图，电泳检测结束。
(4)、根据步骤(2)所得DNA特异标记分布图制作与送鉴水稻样品07B1和 水稻07B2对应的分子身份证号码。DNA特异标记分布图中获得扩增的DNA特 异标记显示的位置标注数字"1 "，未获得扩增的DNA特异标记显示的位置标注 数字"0"，由此组成与送鉴水稻样品对应的分子身份证号码。鉴定结果显示， 送鉴水稻样品07B1的分子身份证号码为10100110001001，故可得出水稻样品 07B1是Y优系列杂交水稻的鉴定结论。将该分子身份证号码10100110001001 与上述Y优系列杂交水稻分子身份证号码对比可进一步得出该送鉴水稻样品 07B1为Y优系列杂交水稻之一的Y优8号的鉴定结论；送鉴水稻样品07B2的 分子身份证号码为10010011001000，故可得出水稻样品07B2亦为Y优系列杂 交水稻的鉴定结论。将该分子身份证号码10010011001000与上述Y优系列杂交 水稻分子身份证号码对比可进一步得出该送鉴水稻样品07B2为Y优系列杂交水 稻之一的Y优7号的鉴定结论。
权利要求
1、一种Y优系列杂交水稻种质的鉴定方法，该方法为下述步骤(1)、以下列方式筛选出可用于Y优系列杂交水稻种质鉴定的引物①、在Gramene数据库中，找到水稻12条染色体，从每条染色体上随机择出5-10个SSR引物，②、从步骤①所得SSR引物中择出可用于鉴定Y优系列杂交水稻种质的引物，这种可用于鉴定Y优系列杂交水稻种质的引物是第5染色体的RM164，所述RM164的DNA序列为正向序列TCTTGCCCGTCACTGCAGATATCC，反向序列GCAGCCCTAATGCTACAATTCTTC，或第7染色体的RM18，所述RM18的DNA序列为正向序列TTCCCTCTCATGAGCTCCAT，反向序列GAGTGCCTGGCGCTGTAC，或第10染色体的RM258，所述RM258的DNA序列为正向序列TGCTGTATGTAGCTCGCACC，反向序列TGGCCTTTAAAGCTGTCGC，或上述引物的组合，(2)、使用上述步骤(1)所得可用于Y优系列杂交水稻种质鉴定的引物对送鉴水稻样品进行PCR扩增①、利用PCR体系进行PCR扩增，所用PCR体系的成份是浓度为25ng/μl的DNA模板1μlPH值为8.3的10×PCR缓冲液 2μl浓度为2.5mM的dNTPs 1μl浓度为5U/μl的Taq酶0.2μl浓度为10pM的正向序列引物 0.5μl浓度为10pM的负向序列引物 0.5μl去离子无菌水 14.8μl②、利用上述步骤①给出的PCR体系按照以下程序实施PCR扩增a.94℃温度下对上述PCR体系进行4分钟时间的DNA变性处理；b.94℃温度下对步骤a所得经过DNA变性处理的PCR体系进行45秒钟DNA变性处理；c.52-59℃温度下对上述步骤b给出的PCR体系进行45秒钟复性处理；d.72℃温度下对步骤c所得经过复性处理的PCR体系进行45秒钟DNA合成延伸处理；e.依序重复步骤b～步骤d，重复35～40次；f.72℃温度下对步骤e所得经过35～40次步骤b～步骤d重复处理的PCR体系进行5分钟DNA合成延伸处理，得DNA特异标记，PCR扩增结束，(3)、对步骤(2)所得DNA特异标记进行电泳检测①、使用聚丙稀酰胺含量为6％的凝胶对步骤(2)所得DNA特异标记进行电泳分离处理，处理时间1.5～2小时；②、对步骤①所得经过电泳分离处理的DNA特异标记进行银染显色处理得DNA特异标记分布图，电泳检测结束，(4)、根据步骤(3)所得DNA特异标记分布图制作与送鉴水稻样品对应的分子身份证号码，具体制作方法是，DNA特异标记分布图中获得扩增的DNA特异标记显示的位置标注数字“1”，未获得扩增的DNA特异标记显示的位置标注数字“0”，由此组成与送鉴水稻样品对应的分子身份证号码，当分子身份证号码的第一位数为“1”时，只要第二至第五位数中出现一位数为“1”，即可作出该送鉴水稻样品为Y优系列杂交水稻的鉴定结论，否则鉴定结论相反。
全文摘要
本发明介绍了一种Y优系列杂交水稻种质的鉴定方法，该方法为下述步骤(1)选出可用于Y优系列杂交水稻种质鉴定的引物；(2)用所得引物对送鉴水稻样品进行PCR扩增；(3)对所得DNA特异标记进行电泳检测；(4)根据所得DNA特异标记分布图制作与送鉴水稻样品对应的分子身份证号码，号码的第一位数为“1”时，只要第二至第五位数中出现一位数为“1”，该送鉴水稻样品为Y优系列杂交水稻，否则鉴定结论相反。利用本方法可鉴定出Y优系列杂交水稻品种及其亲本种质。检测时间短、数量大、效率高，种子纯度鉴定准确，可大大减少杂交水稻大面积生产的风险。
文档编号C12Q1/68GK101408528SQ20071003587
公开日2009年4月15日 申请日期2007年10月10日 优先权日2007年10月10日
发明者文 庄, 文 武, 熊跃东, 斌 王, 邓启云 申请人:湖南杂交水稻研究中心