专利名称：：一种抗肿瘤生物活性物质及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药领域，具体涉及将心脏组织培养成具有抗肿瘤活性的心肌细胞培养液，以及其制备方法。
背景技术：
：肿瘤是人体组织细胞在内外各种有害的因素长期作用下，发生基因突变，表达紊乱，调节失控，产生过度增生及异常分化所形成的新生物或赘生物，临床上常以胂块形式出现。这种新生物并非机体所需要，不按正常规律生长或不可遏止的生长，已丧失正常组织细胞功能，并可破坏原来器官组织结构，进而危及生命.恶性胂瘤具有三个共同特征即1.自主性生长，2.浸润性生长和转移灶形成，3.癌细胞的特性可传递给它的子代细胞。现有治疗肿瘤的药物一般分为七大类别，分别是烷化剂、抗代谢类、抗胂瘤抗生素、植物碱、杂类常见的药物、激素类常见的药物和生物工程生成的抗肿瘤药物。近几年生物制剂的发展特别迅速，对生物制剂中的活性物质的研究也蓬勃发展，这些活性物质一般包括l.干扰素主要应用于毛细胞白细胞、Kaposi肉瘤、低度恶性淋巴瘤；2.白细胞介素IL-2与LAK细胞联合使用，对癌细胞产生非特异性杀伤作用，IL-11升高血小板，用于化疗药物使用导致的血小板降低的临床治疗；3.单克隆抗体如抗CD20单抗美罗华用于治疗B细胞淋巴瘤；4.生长因子GM-CSF、G-CSF;促进粒细胞、巨噬细胞分化成熟，用于抗肿瘤的辅助治疗用药以及用于化疗药物使用导致的白细胞降低的临床治疗；5.肺瘤坏死因子局部应用，瘤内注射可以起到一定的局部抗肺瘤作用。生物制剂活性物质种类繁多，目前尚无任何药物有效的治疗各类恶性肿瘤，其临床应用受到限制的常见原因为l.大部分生物制剂均有发热、乏力、骨髓功能抑制等毒副作用；2.抗肿瘤作用通常为非特异性，其抗肿瘤作用较弱，部分生物制剂仅有增强或调解免疫力从而起到抗胂瘤辅助作用；3.大部分生物制剂由于受到化学工艺^是^^以及合成的生产成本高等原因，其生物制剂价格昂贵，从而应用于临床受到较大限制。
发明内容本发明的目的在于克服上述现有技术的缺点而提供一种无毒的、广谱的、具有免疫作用的并易于获得的抗肿瘤生物活性物质，本发明的另一目的是提供这种抗肿瘤活性物质的制备方法。本发明的目的是这样实现的本发明的抗胂瘤活性物质是一种心肌细胞培养液，具体的，这种心肌细胞培养液是由心脏组织经以下步骤获得1)制细胞悬液将心脏组织制成细胞悬液；2)计数、接种取细胞悬液以2x107ml接种在50cm2的培养瓶中，在37。C、5%浓度的C(U阵箱中孵育90分钟；3)纯化轻轻振摇后吸出尚未贴壁的心肌细胞，以lxi()Sml接种在50ci^的培养瓶中，继续;^入37。C、5%浓度的C0J哮箱中孵育48小时；4)收集待心肌细胞长至对数期后更换新鲜培养液20ml，继续孵育24小时后取培养液，经过超滤离心后收集分子量小于10KD的滤液即为心肌细胞培养液。更为具体的，所述的心肌细胞培养液是由以下步骤制得l)制细胞悬液将心脏碎块移入玻璃试管中，加入预温37。C的浓度为0.25%胰酶和0.1%的胶原酶各5ml，放入37。C水浴箱中消化20分钟，第一次培养液弃去，重复消化3次，收集每次消化后静置培养液，在1000转/分钟的条件下离心10分钟，再用D-hanks液洗涤细胞两次，然后用完全培养基制成细胞悬液；2)计数、接种取细胞悬液以2x107ml接种在50cm2的培养瓶中，在37t:、5%浓度的C02孵箱中孵育90分钟；3)纯化轻轻振摇后吸出尚未贴壁的心肌细胞，以lxl(^ml接种在50cm2的培养瓶中，继续放入37。C、5%浓度的COJ浮箱中孵育48小时；4)收集待心肌细胞长至对数期后更换新鲜培养液20ml，继续孵育24小时后取培养液，经过超滤离心后收集分子量小于10KD的滤液即为心肌细胞培养液。其中，完全培养基是含20%小牛血清和双抗的液体。本发明通过长达三年的实验研究，证明这种心肌细胞培养液抑瘤(抗癌)作用确切，具体抑瘤(抗癌)实验如下实验l.采用酶解法原代培养新生1-3天Wistar大鼠心肌细胞，取乳大鼠心肌细胞培养液中的上清液用MTT法分析比较心肌细胞培养液对CNE2(鼻咽癌细胞林)的体外生长抑制作用，以顺柏(化学治疗抗癌药)为阳性对照，以DMEM(细胞培养基)为空白对照。以CNE2、鼠正常肾小球系膜细胞(MCs)为耙细胞，观察心肌细胞培养液对CNE2及MCs生长的影响，其试验结果为心肌细胞培养液对鼻咽癌细胞存活率与对照组比较具有显著的抑瘤活性，对正常细胞(MCs)生长无影响。心肌细胞培养液对鼻咽癌细胞存活率与DDP比较其抑瘤活性无显著性差异。实验2:心肌细胞培养液对荷S180肿瘤小鼠体内抑瘤作用的影响，本实验选取剂量60mg/kg作为心肌细胞培养液的给药剂量，腹腔注射每天一次，连续14天，对照组为同样容量的生理盐水，其注射方法及注射时间同心肌细胞条件培养液组。结果表明两组小鼠体重变化无显著性差异，说明心肌细胞培养液对小鼠的生长状态无影响。两组小鼠肿瘤的重量具有非常显著的差异，心肌细胞培养液抑瘤率达81%。从而我们得出心肌细胞培养液是一种抑瘤(抗癌)作用确切、治疗安全、无治疗毒副作用的生物制剂。其剂型分为液体制剂和真空冻干粉剂两种剂型，可望广泛用于恶性肿瘤的临床治疗。从而该生物制剂可以弥补传统生物制剂的不足，在其抗肿瘤作用强度和毒副作用方面都优于传统生物制剂。附困说明图1为本发明的第一次从细胞悬液中提取的接种细胞形态图(倒置像差显微镜放大10x10倍)；说明图1中接种细胞提取方法为将心脏组织碎块移入玻璃试管中，放入预温37。C的0.25%胰酶和0.1%的胶原酶中消化。放入37。C水浴箱中消化20min。第一次培养液弃去，重复消化3次，收集每次消化后静置培养液，1000rpm离心10min，用D-hanks液洗涤细胞两次，然后用完全培养基(含20%小牛血清和双抗)制成细胞悬液。在计数板计数最后以2xi()Sml接种在50ci^的培养瓶中，在37。C、5%的COJ浮箱中孵育30min时的细胞形态。图片视野内含有未贴壁的心肌细胞和部分已经帖壁的成纤维细胞等非心肌细胞成分。图2为本发明的第一次孵育后细胞形态图(倒置像差显微镜放大10xIO倍)；说明图2中细胞第一次孵育方法将心脏组织碎块经过0.25%胰酶和0.1%的胶原酶中消化而成的细胞悬液。再用离心机在条件为1000rpm离心10min，用D-hanks液洗涤细胞两次，然后用完全培养基(含20%小牛血清和双抗)制成细胞悬液。在计数板计数最后以2x105ml接种在50cm2的培养瓶中，在37。C、5%的C(M浮箱中孵育90min时的细胞形态。图片^L野内成纤维细胞为主的非心肌细胞成分已经帖壁，未贴壁的心肌细胞为反光明显的圆形细胞。图3为本发明的第二次接种时的细胞形态图(倒置像差显微镜放大10x40倍)；说明图3中显示的细胞为纯化后的心肌细胞形态，将含有心肌细胞和非心肌细胞的细胞混悬液的培养^f瓦置37°C、5%的C02孵箱中孵育90min,轻轻振摇后吸出尚未贴壁的心肌细胞，以1x105ml重新接种，并于显微镜下观察，刚接种的心肌细胞呈圓形，计数心肌细胞比例为95%。继续放入37。C5。/。的C0J浮箱中孵育，心肌细胞贴壁后伸展由圆型细胞变形呈梭状。图4为本发明的第二次孵育后的细胞形态图(倒置像差显微镜放大10x40倍)；说明图4为将差速贴壁法纯化后心肌细胞孵育在37°C、5%的C02孵箱中孵育48小时后的细胞形态。图中细胞已经生长至对数期，心肌细胞贴附培养瓶底约占80%的瓶底面积，图中细胞均为心肌细胞，呈现梭状以及多角形和不规则等多种形态。图5为本发明的心肌细胞培养液的细胞形态图(倒置像差显微镜放大10x40倍)。说明图5为将差速贴壁法纯化后心肌细胞孵育在37°C、5%的C02孵箱中聘育48小时后更换新鲜培养液。待心肌细胞长至对数期(大约铺满瓶底80%)后更换新鲜培养液20ml，继续孵育24小时后取培养液时的心肌细胞形态。细胞已心肌细胞贴附培养瓶底约占90°/。的瓶底面积，图中细胞为对数期心肌细胞，呈现梭状以及多角形和不规则等多种细胞形态。具体实施例方式下面结合附图和具体实验对本发明作进一步的详细说明心肌细胞培养液的作用从理论上分析为骨骼肌系统体积庞大，血流丰富，尤其是剧烈运动时，因此经血流向骨骼月几播散的恶性肿瘤数目应颇为可观，但骨骼肌转移瘤却罕见。心脏作为全身血液循环的主要器官，其血液供应非常丰富，而转移瘤较少，其中主要是心包转移，心肌转移罕见。心肌和骨骼肌同属于横紋肌系统，均具有恶性肿瘤不易转移到^^黄紋月几系统特性，以色列的Djaldetti等国外学者，周乃康、罗成华等国内学者通过实验并证明骨骼肌条件培养液中存在低分子抑瘤活性物质，其对恶性肿瘤细胞具有广泛的抑制作用，而非肿瘤的增殖则未受到明显抑制，甚至还受到一定的促进作用，认为这可能是骨骼肌抵御转移瘤形成的主要机制。而心肌与骨骼肌同属于横紋肌，而心肌转移瘤也罕见，从理论上推测心肌的微环境中是也存在着相关的抑瘤物质。通过一系列的相关实验证明了心肌细胞培养液具有抑瘤活性，并证明了心肌细胞培养液存在低分子抑瘤活性物质。因此，本发明首先提出一种心肌细胞培养液，它是由以下步骤制3曰付二l)制细胞悬液将心脏碎块移入玻璃试管中，加入预温37。C的浓度为0.25%胰酶和0.1%的胶原酶各5ml,放入37。C水浴箱中消化20分钟，第一次培养液弃去，重复消化3次，收集每次消化后静置培养液，在1000转/分钟的条件下离心10分钟，再用D-hanks液洗涤细胞两次，然后用完全培养基制成细胞悬液；2)计数、接种取细胞悬液以2xloVml接种在50cr^的培养瓶中，在37。C、5%浓度的C02孵箱中孵育90分钟；3)纯化轻轻振摇后吸出尚未贴壁的心肌细胞，以1><1051111接种在50cW的培养瓶中，继续放入37。C、5%浓度的C02孵箱中孵育48小时；4)收集待心肌细胞长至对数期后更换新鲜培养液20ml，继续孵育24小时后取培养液，经过超滤离心后收集分子量小于10KD的滤液即为心肌细胞培养液。所述的完全培养基是含20%小牛血清和双抗的液体。下面以心肌细胞培养液对鼻咽癌细胞生长抑制作用体外实验以及对荷S180昆明小鼠肿瘤生长的影响实验证明本发明的效果1、实验材料与仪器1.1实验动物Wistar大鼠(1~3天)由沪州医学院动物中心提供1.2实验细胞鼻咽癌细胞(CNE2)购自中山大学医学院肾小球系膜细胞(MCs)由〉卢州医学院传染免疫室提供1.3主要实验仪器超净工作台(苏州净化设备公司)倒置相差显孩t镜(IMT-2日本OLYMPUS公司)5%0)2恒温孵育箱(TC2323美国Coulter公司)低温自动平衡离心机(LDZ5-2北京医用离心机厂)冷冻干燥机(FD-1eyelatokyorikakikaico"1td)电热恒温水浴箱(DSY-1-2北京爱琦霞商贸中心)酶联免疫检测仪(EXL美国)电热鼓风干燥箱(上海浦东荣丰科学仪器有限公司)电热恒温培养箱(DG-407型成都电烘厂)低温冰箱(BCD-228B青岛海尔集团)细胞计数板、盖玻片、载玻片、湿盒、染色缸(江苏大仓医疗仪器厂)6孔培养板、96孔培养板(北京华美公司)2主要实验试剂2.1细胞培养试剂DMEM(北京华美公司)新生小牛血清(北京华美公司)0.25%胰蛋白酶(泸州医学院附属医院传染免疫室提供)0.1%胶原酶(sigma产品北京华美公司提供)D-hanks液(泸州医学院附属医院传染免疫室提供)PBS(磷酸緩冲液，PH=7.0)MTT(北京华美^^司)DMS0(北京华美^^司)2.2免疫组织化学试剂10%多聚赖氨酸(成都云鸿科技发展公司)O.01mol/l，PH7.2:称取NaCl8g,Na2HP041.15g，KH2P040.2g，加蒸馏水至1Q00ml溶解后，调PH值至7.2底物溶液DAB试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司产品，包括浓缩緩沖液，DAB溶液，浓缩过氧化氩溶液)ABC试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司产品，包括封闭用正常血清工作液，生物素标记羊抗小鼠IgG，辣才艮过氧化酶标记链酶卵白素工作液S-A/HRP)小鼠抗大鼠横紋肌单克隆肌动蛋白抗体MouseAnti-SarcomericActin5C5;IgM(武汉博士德试剂有限公司)3、本发明的详细工艺步骤3.1剪取心脏出生1-3天的Wistar(或SD)大鼠若干只，将其整个浸入盛有75%酒精的烧杯中，5分钟后取出，放在无菌泡沫上，用无菌大头针固定四肢及头部，用剪刀剪开皮肤并剥离胸部，换剪刀于剑突上一肋处入剪，剪开胸腔，暴露胸腔，剪取心尖组织，迅速置入盛有预冷的D-hans液(含双抗)的培;^a中。或用出生30天的Wistar(或SD)大鼠若干只用断颈法处死，用细绳固定其四肢及头部于木板上，用剪刀剪去胸部腹部鼠毛，以碘酒和75%的酒精消毒胸部腹部皮肤，用剪刀剪开皮肤并剥离胸部，换剪刀于剑突上一肋处入剪，剪开胸腔，暴露胸腔，剪取心尖组织，迅速置入盛有预冷的D-hans液(含双抗)的培养JIL中。3.2清洗心脏用预冷的D-hans液清洗心脏，洗去心脏表面的血液及冠脉中的残存血细胞，将心房及右心室剪除，仅留左心室，将其剪成lmn^大小的组织块，再次清洗，洗去心腔内残留的血细胞。3.3消化、收集细胞将心脏碎块移入玻璃试管中，加入预温37。C的0.25%胰酶和0.1。/o的胶原酶各5ml。放入37。C水浴箱中消化20min。第一次培养液弃去，重复消化3次，收集每次消化后静置培养液，lOOOrpm离心10min,用D-hanks液洗涤细胞两次，然后用完全培养基(含20%小牛血清和双抗)制成细力包悬液。3.4计数、接种用吸管轻轻吹打细胞悬液取少许，在计数板盖玻片一侧加樣i量细胞悬液，在显微镜下用10x物镜观察计数最后以2xio5/ml接种在50cm2的培养瓶中,37°C、5%的C(y浮箱中孵育。3.5差速贴壁法纯化心肌细胞其原理是根据心肌细胞和成纤维细胞在培养皿表面贴壁生长的速度不同而进行分离的方法，成纤维细胞贴壁时间早，而心肌贴壁时间晚，用此方法可得纯度大于95%的心肌细胞。将培养^f瓦置37°C、5%的C0J浮箱中孵育90min，轻轻振摇后吸出尚未贴壁的心肌细胞，以1x105/ml重新接种，并于显微镜下观察，刚接种的心肌细胞呈圆形，成纤维细胞呈棒状。计数心肌细胞比例为95%。继续力文入37。C5%的0)2孵箱中孵育，48小时后观察，心肌细胞贴壁并伸展呈梭状。3.6收集心肌细胞培养液37°C、5%的C02孵箱中孵育48小时后换液，及时观察心肌细胞生长情况和更换新鲜培养液。待心肌细胞长至对数期(大约铺满瓶底80%)后更换新鲜培养液20ml。继续孵育24小时后取培养液，经过超滤离心后收集分子量小于的滤液即为心肌细胞培养液。过滤除菌后置于-20。C水箱低温冻存备用。进一步的，可将该心肌细胞培养液制成冻干粉剂，具体方法如下取原代培养心肌细胞培养液经过超滤离心，收集分子量小于10KD的滤液。过滤除菌后的原代培养心肌细胞培养液放置入冷冻千燥机(牙几型为FD-1eyelatokyorikakikaico.,ltd)中进4亍真空冷冻干燥处理，然后收集到外观呈菊黄色疏松粉末状粉剂。具体方法为(1)预冻将心肌细胞培养液装入特定的磨口圆底玻璃瓶中，浸放在低温热传导液体内旋转，使其均匀的固化在瓶内壁上，以便在真空下进行升华。如果没有冻实，则抽真空时制品会溢出瓶外。(2)升华阶段也称一次干燥阶段，制品装入干燥箱，启动真空泵，使干燥箱、捕水器获得必需的真空度，建立真空冻干的压力条件；给加热板升温，向制品提供冰晶升华需要的热量。干燥箱的真空度以控制在10-30Pa为宜，捕水器温度应小于-40。C;搁板温度在-10°C-+10。C之间。(3)解吸阶段也称二次干燥阶段，尽管在一次干燥中，绝大部分水能随冰晶体的升华而排除，但为了获得尽可能好的干燥效果，应进行二次干燥。冻干箱真空度保持在10-30Pa范围；迅速升高搁板温度，使产品温度迅速上升到该产品允许的最高温度(<25°C),直至干燥结束。整个干燥过程约需IO多个小时。4、实验l:采用酶解法原代培养新生Wistar大鼠心肌细胞，取上清液用MTT法分析比较心肌细胞培养液对CNE2的体外生长抑制作用，以顺铂为阳性对照，以DMEM为空白对照。以CNE2、鼠正常肾小球系膜细胞(MCs)为靶细胞，观察心肌细胞培养液对鼻咽癌细胞抹(CNE2)及鼠正常肾小球系膜细胞(MCs)生长的影响。采用胰酶消化法，热灭活法初步纟笨讨心肌细胞培养液的理化性质。表1:不同培养液对鼻咽癌细胞和肾小球系膜细胞存活率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>CMCM对鼻咽癌细胞存活率与对照组比较均有显著性差异(P<0.05),具有显著的抑瘤活性，对正常细胞(MCs)生长无影响(P>0.05)。心肌细胞培养液对鼻咽癌细胞存活率与DDP比较其抑瘤活性无显著性差异(P>0.05)。表2:不同处理心肌细胞培养液原液对鼻咽癌细胞存活率的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>CMCM经过经胰酶消化后与CMCM原液比较细胞存活率P>0.05，经过热灭活后与CMCM原液比较细胞存活率P<0.05，与对照组比较P>0.05，心肌细胞培养液理化特性为经胰酶消化不影响活性，而不耐热。实验2:心肌细胞培养液对荷S180肿瘤小鼠体内抑瘤作用的影响培养液的收集参考我们体外实验中心肌细胞培养液的收集标准收集上清液，本实验选取剂量60mg/kg作为心肌细胞条件培养液的给药剂量，腹腔注射每天一次，连续14天，对照组为同样容量的生理盐水，其注射方法及注射时间同心肌细胞条件培养液组。结果表明两组小鼠体重变化无显著性差异，说明CMCM对小鼠的生长状态无影响。两组小鼠肿瘤的重量具有非常显著的差异，CMCM抑瘤率达81%。(见表3)表3:心肌细胞条件培养液对荷S180昆明小鼠肿瘤生长的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实验结果表明1.心肌细胞培养液对鼻咽癌细胞具有显著的抑瘤活性，对对小鼠正常细胞(肾小球系膜细胞)生长活性无影响，其抑瘤活性与DDP比较无显著性差异，胰酶消化不影响抑瘤活性，加热可使活性下降。2.心肌细胞条件培养液对荷S180肿瘤小鼠具有显著的体内抑瘤作用，对小鼠的生长状态无影响。本发明使用时将心肌细胞培养液液体制剂经静脉注射，或者将心肌细胞培养液的真空冻千粉剂溶解于注射用水后经静脉注射给药，或者将心肌细胞培养液的真空冻干粉剂溶解于0.9%氯化钠溶液(即生理盐水)后经静脉注射给药途径从而实现抗肿瘤治疗目的。权利要求1、一种抗肿瘤生物活性物质，其特征在于，其为心肌细胞培养液，所述心肌细胞培养液由心脏组织经以下步骤获得1)制细胞悬液将心脏组织制成细胞悬液；2)计数、接种取细胞悬液以2×105/ml接种在50cm2的培养瓶中，在37℃、5％浓度的CO2孵箱中孵育90分钟；3)纯化轻轻振摇后吸出尚未贴壁的心肌细胞，以1×105ml接种在50cm2的培养瓶中，继续放入37℃、5％浓度的CO2孵箱中孵育48小时；4)收集待心肌细胞长至对数期后更换新鲜培养液20ml，继续孵育24小时后取培养液，经过超滤离心后收集分子量小于10KD的滤液即为心肌细胞培养液。2、一种抗肿瘤生物活性物质的制备方法，其特征在于由以下步骤获得'.l)制细胞悬液将心脏碎块移入玻璃试管中，加入预温37。C的浓度为0.25%胰酶和0.1%的胶原酶各5ml，放入37。C水浴箱中消化20分钟，第一次培养液弃去，重复消化3次，收集每次消化后静置培养液，在1000转/分钟的条件下离心10分钟，再用D-hanks液洗涤细胞两次，然后用完全培养基制成细胞悬液；2)计数、接种取细胞悬液以2x107ml接种在50cW的培养瓶中，在37。C、5%浓度的C02孵箱中孵育90分钟；3)纯化轻轻振摇后吸出尚未贴壁的心^L细胞，以lxl()5ml4妻种在50cm2的培养瓶中，继续放入37。C、5%浓度的COJ浮箱中孵育48小时；4)收集待心肌细胞长至对数期后更换新鲜培养液20ml，继续孵育24小时后取培养液，经过超滤离心后收集分子量小于10KD的滤液即为心肌细胞培养液。3、根据权利要求2所述的抗肿瘤生物活性物质的制备方法，其特征在于完全培养基是含20%小牛血清和双抗的液体。全文摘要本发明公开了一种将心脏组织培养成具有抗肿瘤活性的心肌细胞培养液，它经过制细胞悬液，计数、接种，纯化，收集等步骤获得，是一种抑瘤(抗癌)作用确切、治疗安全、无治疗毒副作用的生物制剂。其剂型分为液体制剂和真空冻干粉剂两种剂型，可望广泛用于恶性肿瘤的临床治疗。从而该生物制剂可以弥补传统生物制剂的不足，在其抗肿瘤作用强度和毒副作用方面都优于传统生物制剂。文档编号C12N5/08GK101177674SQ20071005047公开日2008年5月14日申请日期2007年11月8日优先权日2007年11月8日发明者吴敬波申请人:泸州医学院附属医院