专利名称：红薯生淀粉水解发酵的复合水解酶制备方法
技术领域：
一种红薯生淀粉水解发酵的复合水解酶制备方法，用于红薯生 淀粉水解发酵的复合水解酶制备。涉及一种能对红薯生淀粉原料进行常温水 解，并能实现生料水解发酵同步过程的复合水解酶的制备技术领域。
背景技术：
现有技术中，常规酒精生产是采用双酶水解法，即先用a—淀 粉酶将淀粉原料在高温下水解，将淀粉变成短链糊精、麦芽糖等，然后再用糖 化酶水解成可发酵用的葡萄糖，其缺点是流程复杂，需升温、降温等过程， 能耗高，其中的糖化酶目前在国内外主要由嗜温真菌生产，需要的温度较高， 一般在50 6(TC之间，偏离最适温度范围，其酶的活力会大大降低；另一方 面，用嗜温真菌发酵生产的糖化酶，普遍存在杂菌的污染，使糖化酶的应用， 尤其在生淀粉原料一步法酒精生产中的应用受到很大的限制；为了提高酶水解 生淀粉的效果，也有以糖化酶为主，再加以a—淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、 酸性蛋白酶、脱枝酶、植酸酶等的研究，但是由于各种酶的最适温度和最适 pH存在的差异性，导致其水解生淀粉的效果并不理想；由于普通的糖化酶没 有生淀粉的吸附位点，对生淀粉没有水解能力或其水解能力很差，尽管目前国 内外有一些对生淀粉具有水解能力的糖化酶，但由于其对生淀粉的吸附力的问 题、或由于其作用的最适温度较高的问题，使其对生淀粉的水解，尤其是常温 下对生淀粉的水解效率较低，从而导致目前生淀粉原料一步法酒精生产的周期 很长、效率很低。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，采用先筛选出发黑曲霉3L — 0菌 株，再获取3L—1产酶菌株，最后获得复合水解酶，发明了一种能在常温下对 生淀粉原料进行高效水解，并能实现生料水解发酵同步过程的红薯生淀粉水解 发酵的复合水解酶制备方法。
本发明是这样实现的首先借助基因工程技术对经筛选的出发黑曲霉3L —0菌株进行定点诱变和遗传育种，获得含有多拷贝的糖化酶基因的优良特种
3L — 1产霉菌株，然后将该菌株培养发酵，经过对发酵液进行分离、真空浓缩 和对酶进行吸附、沉淀、真空干燥等操作，得到对生料淀粉具有很强的水解能
力的高效糖化酶，且酶活力强不易失活，其作用的最适温度为25 45°C;最 适pH值为3 5.5，然后以该糖化酶为主，将其与其它酶复配成为生料水解发 酵同步过程的复合水解酶；由于其能在常温下高效快速水解生淀粉，该复合水 解酶可用于水解与发酵同步的生料一步法酒精生产工艺，另外，利用3L—1 产霉菌株生产糖化酶时可在较高温度下进行，在后面复合酶的制备中又是在较 清洁的环境中进行，因此得到的复合水解酶中杂菌污染少，这在生淀粉原料一 步法酒精生产中杂菌污染的控制方面有积极的作用； 本发明包括以下工艺
第一步筛选出发黑曲霉3L —0菌株从大生产中挑选出发酵单位高于 10000 u/ mL的保藏黑曲霉菌株10株，先用筛选培养基进行平板涂布筛选， 然后摇瓶筛选，得到出发黑曲霉3L — 0菌株；
第二步获取3L—1产酶菌株对获得的出发黑曲霉3L—0菌株进行定点 诱变和遗传育种，获得含有多拷贝糖化酶基因的31—1产霉菌株；
第三步用3L — 1产酶菌株发酵制糖化酶先将获得的3L — 1产霉菌株经 斜面菌种培养获得斜面菌种，然后接种于由红薯淀粉原料制成的种子培养基 中，在30 4(TC下，培养30 60小时，获得种子；在将种子接入由红薯淀粉 原料制成的发酵培养基中，在30 4(TC，通气培养100 120小时的培养，获 得发酵产物；最后将发酵产物离心分离、真空浓縮、拌料吸附、乙醇沉淀，在 50 6(TC下真空干燥，获得能够高效水解生料的糖化酶产品；
第四步复合水解酶的制备先取获得的60 80%的糖化酶产品，加入 15 25X低温酸性a-淀粉酶、1 5%果胶酶、1 5%纤维素酶、1 5%脱枝 酶进行组合；然后将配好的组合在常温下用搅拌器低速混合5 10分钟，也可 以是在常温下用乳钵轻柔混合20 30分钟，最后将其密封包装。 本发明的优点和有益效果是实现了常温下生料淀粉糖化水解与发酵的同 步过程，制备的复合水解酶具有水解能力强、速度快的特点，从而可使发酵时 间縮短，并可实现浓醪发酵，因此过程的能耗低、生产效率高；利用3L—1 菌株生产糖化酶可在较高温度下进行，而在后面复合酶的制备中又是在较清洁 的环境中进行，因此具有杂菌少，能减少发酵过程中的杂菌污染的优点；本发 明利用酶活力强不易失活的特点，在固液分离后还能对醪渣中的少量残余淀粉 继续进行水解，结合醪渣固态深层发酵产酒，可使淀粉利用率最终达到95% 以上。
具体实施方式
:下面结合附图
对本发明进一步说明本发明包括以下工艺:
第一步筛选出发黑曲霉3L — 0菌株从大生产中挑选出发酵单位高于 10000 u/ mL的保藏黑曲霉菌株10株，先用筛选培养基进行平板涂布筛选， 然后摇瓶筛选，得到出发黑曲霉3L—0菌株；
第二步获取3L—1产酶菌株对获得的出发黑曲霉3L — 0菌株进行定点 诱变和遗传育种，获得含有多拷贝糖化酶基因的3L—1产霉菌株；
第三步用3L—1产酶菌株发酵制糖化酶先将获得的3L — 1产霉菌株经 斜面菌种培养获得斜面菌种，然后接种于由红薯淀粉原料制成的种子培养基 中，在30 4(TC下，培养30 60小时，获得种子；在将种子接入由红薯淀粉 原料制成的发酵培养基中，在30 4CTC，通气培养100 120小时的培养，获 得发酵产物；最后将发酵产物离心分离、真空浓縮、拌料吸附、乙醇沉淀，在 50 6(TC下真空干燥，获得能够高效水解生料的糖化酶产品；
第四步复合水解酶的制备先取获得的60 80%的糖化酶产品，加入 15 25%低温酸性0_淀粉酶、1 5%果胶酶、1 5%纤维素酶、1 5%脱枝 酶进行组合；然后将配好的组合在常温下用搅拌器低速混合5 10分钟，也可 以是在常温下用乳钵轻柔混合20 30分钟，最后将其密封包装。
将复合水解酶加入到用水调好的红薯生料淀粉料浆中，然后加入酵母，常
温下水解发酵72 96小时，经蒸馏后得到酒精，实现生淀粉原料一步法酒精 生产，其淀粉利用率可达92%以上； 实际操作如下-1.糖化酶的制备
1) 斜面菌种培养
取已获得的3L — 1产酶菌株接种于淀粉斜面培养基中，物料包括红薯淀 粉20 30g/L、 腳031. 0 2. 0 g/L、 MgS04 7H20 1. 0 2. 0 g/L、 KH2P043 . 0 4.0g/L、琼脂粉10 25g/L、 pH4.0 5.0，在30 40。C下培养5 7天，获得 斜面菌种；
2) 种子培养
取红薯淀粉70 90 g/L、黄豆粉15 25g/L、麸皮8 15 g/L以及玉米浆 18 25 g/L作为种子培养基，除玉米浆外的其它组份加水混合均匀后加热搅 拌直至淀粉糊化，然后加入a—淀粉酶液化，由双层纱布过滤后加入玉米浆成 分，水定容，柠檬酸调pH值为4. 0 5. 0，每瓶100mL分装于300mL锥形瓶中， 用8层纱布封口，用牛皮纸包扎后于12rC下灭菌30min，冷却后接种，然后 于回旋摇床上在35。C下培养35 40小时；
3) 发酵培养
在红薯淀粉50 65g/L、黄豆粉15 25 g/L、麸皮25 30 g/L 、玉米桨 18 25 g/L发酵培养基中，除玉米浆外的其它组份加水混合均匀后加热搅拌 直至淀粉糊化，然后加入a—淀粉酶液化，过滤后加入玉米浆成分，水定容， 柠檬酸调pH值为4. 0 5. 0，装于2L的间歇搅拌发酵罐中，121"C下灭菌30min， 冷却后按8 15%的接种量加入种子培养物，于35"C下培养120小时；
4) 糖化酶的分离和提取
发酵液于3800rpm下离心分离20min，合并滤液在5(TC下真空浓缩至滤液 体积的1/8 1/10，于酶浓缩液中加入2 4%的红薯粉，搅拌均匀，然后于10
15°C、搅拌均匀下加入2 2. 5倍预先冷藏好的95%乙醇，析出酶的沉淀离心 后于55t:下真空干燥3小时，获得糖化酶产品，其酶活可达100000U/mg以上;
2. 复合酶的制备
按比例称取糖化酶65 70%，低温酸性a-淀粉酶20 25X，果胶酶4 7 %，纤维素酶1.6 2%，脱枝酶3 4%组合，然后在常温下用乳钵轻柔混合 30分钟，最后将其密封包装后备用；
3. 红薯生淀粉发酵酒精
称取100g红薯生淀粉，加入300mL水调浆，用稀硫酸调pH值至4. 0 4. 5 后，以糖化酶活力计，直接按110 150U/g淀粉加入上述复合酶，搅拌均匀后 立即加入O. 1 0.3g干酵母，于室温下发酵4日，其发酵醪液酒精度达12% (v/v)以上，淀粉利用率超过92%。
权利要求
1、一种红薯生淀粉水解发酵的复合水解酶制备方法，其特征在于第一步筛选出发黑曲霉3L-0菌株从大生产中挑选出发酵单位高于10000u/mL的保藏黑曲霉菌株10株，先用筛选培养基进行平板涂布筛选，然后摇瓶筛选，得到出发黑曲霉3L-0菌株；第二步获取3L-1产酶菌株对获得的出发黑曲霉3L-0菌株进行定点诱变和遗传育种，获得含有多拷贝糖化酶基因的3L-1产霉菌株；第三步用3L-1产酶菌株发酵制糖化酶先将获得的3L-1产霉菌株经斜面菌种培养获得斜面菌种，然后接种于由红薯淀粉原料制成的种子培养基中，获得种子；再将种子接入由红薯淀粉原料制成的发酵培养基中，获得发酵产物；最后将发酵产物离心分离、真空浓缩、拌料吸附、乙醇沉淀，在50～60℃下真空干燥，获得能够高效水解生料的糖化酶产品；第四步复合水解酶的制备先取获得的60～80％的糖化酶产品，加入15～25％低温酸性α-淀粉酶、1～5％果胶酶、1～5％纤维素酶、1～5％脱枝酶进行组合；然后将配好的组合在常温下用搅拌器低速混合5～10分钟，最后将其密封包装。
2. 根据权利要求1所述的红薯生淀粉水解发酵的复合水解酶制备方法， 其特征在于在所述种子培养基中获得种子的培养温度是30 4(TC下，培养 时间是30 60小时。
3. 根据权利要求1所述的红薯生淀粉水解发酵的复合水解酶制备方法， 其特征在于在所述发酵培养基中培养获得发酵产物的温度是30 4(TC，通 气培养100 120小时。
4. 根据权利要求1所述的红薯生淀粉水解发酵的复合水解酶制备方法， 其特征在于所述复合水解酶制备法中，将配好的组合在常温下用搅拌器低速 混合5 10分钟的方法，也可以是在常温下用乳钵轻柔混合20 30分钟。
全文摘要
一种红薯生淀粉水解发酵的复合水解酶制备方法，用于红薯生淀粉水解发酵的复合水解酶制备，涉及复合水解酶的制备技术领域，包括出发菌株3L-0的筛选、3L-1产酶菌株的获取、复合水解酶的制备和将3L-1产酶菌株进行发酵制取糖化酶的工艺；本发明采用先筛选菌株黑曲霉3L-0，再获取3L-1产酶菌，最后获得复合水解酶的方法，发明了一种能在常温下对生淀粉原料进行高效水解的红薯生淀粉水解发酵的复合水解酶制备方法，解决了现有技术在常温下对生淀粉的水解效率较低，从而导致生淀粉原料一步法酒精生产周期长、效率很低的问题，本发明具有杂菌少，在固液分离后还能对醪渣中的少量残余淀粉继续进行水解的特点，结合醪渣固态深层发酵产酒，可使淀粉利用率最终达到95％以上。
文档编号C12N9/14GK101173256SQ20071005023
公开日2008年5月7日 申请日期2007年10月15日 优先权日2007年10月15日
发明者兰先秋, 刘锦超, 航 宋, 李建明, 王君福, 志 陈 申请人:四川循环科技有限公司