专利名称：一种中性β－魔芋甘露聚糖酶制剂的生产方法
技术领域：
本发明涉及微生物发酵技术和酶工程技术，特别是一种枯草芽孢杆菌CCTCCM207001及其高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶制剂的生产方法。
背景技术：
甘露聚糖酵是一类能够水解含有甘露糖苷键的甘露多糖的内切水解酶，它属于半纤维素酶类。甘露多糖主要存在于魔芋、瓜尔豆胶、田菁胶中，主要有葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖等，它们构成了植物半纤维素的第二大组分，这些物质的降解主要依靠的酶就是甘露聚糖酶。自上世纪90年代以来，甘露聚糖酶及其酶法制取低聚糖的研究引起人们极大的关注。中国科学院微生物研究所马延和等对碱性甘露聚糖酶的产生条件进行研究，该酶条件为70℃，PH9.6，酶活力为160μ/ml。田新玉等对嗜碱芽孢杆菌N16-5总DNA获得的碱性β-甘露聚糖酶基因(β-mannanase gene)及其制备方法进行了研究，构建了原核表达质粒，转化大肠杆菌表达β-甘露聚糖酶。以该酶水解魔芋精粉等产生一系列寡糖，寡糖的总转化率为80％以上。嗜碱芽孢杆菌N16-5以魔芋粉、大豆粉等为原料，发酵生产β-甘露聚糖酶，生产条件简单，发酵液的酶活力500μ/ml以上，后提取收率80％以上。该酶的最适反应pH为10.0，最适反应温度为70℃。
国内屈野、杨文博等人也从提高β-甘露聚糖酶活力出发，对影响地衣芽孢杆菌NK-27-51产酶的几个主要工艺参数做了正交设计，在最佳工艺组合条件下，酶活力为327.9μ/ml。
在上述的一些研究中，或是存在酶活力不高，产酶不稳定，或者工艺复杂，产品转化率低，成本高。如用碱性甘露聚糖酶生产，酶解工艺在PH9-10的条件下进行，给后处理带来困难，影响产品口感，并且不利环保。
发明内容
本发明的目的是提出一种用枯草芽孢杆菌，通过UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变，诱导培养能高效表达中性β-甘露聚糖酶的TQS6菌株，及其发酵生产高活力中性β-甘露聚糖酶的生产方法，从而能高效经济地转化生产甘露低聚糖。
使用的微生物本发明涉及的枯草芽孢杆菌TQS6，它具有高效表达中性β-甘露聚糖酶的特性，该菌株于2007年1月10日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NoM207001(以下简称TQS6)TQS6菌株的菌学特性a、形态特征单个细胞0.7～0.8×2～3微米、着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
b、生理生化特征菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色、在液体培养基中生长时，形成皱醭；需氧菌；可利用蛋白质、多种糖及淀粉。在魔芋精粉的诱导下产生中性β-甘露聚糖酶，在甘露低聚糖的生产上起到关键作用。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。
本发明是这样实现的。从CICC(中国工业微生物菌种保藏中心)取得的10164菌株为基础，通过UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变，紫外诱变的条件是紫外灯功率15～30w，照射距离20～50cm，照射时间1～5min。NTG诱变的条件是NTG浓度1～3mg/ml，在pH6.0的tris缓冲液中，处理90～120min。将菌种接种在含有0.1～0.5％的刚果红平板培养基中，30～35℃，诱导培养24～48小时，可见透明水解圈。培养基配方按质量百分比计为1.5～2.5％琼脂，离心魔芋降解液(糖度10BX)1～3％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，NaCl0.1～0.5％，刚果红0.1～0.5％。
选取水解圈直径H/菌落直径C大的菌株，进行摇瓶复筛，通过DNS法测定酶活。平均酶活力达到1450μ/ml。
选取优良菌株进行稳定传代3～8代。最后得到高产中性β-甘露聚糖酶斜面。并将该菌株命名为TQS6，于4℃冰箱中保存。并送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC NoM207001(简称TQS6)发酵产酶工艺包括如下步骤1)一级液体培养即从斜面到250ml三角瓶的放大培养，接种量为TQS6斜面菌一环，在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5条件下，在液体培养基中培养12～24小时。培养基配方按质量百分比计离心魔芋降解液(糖度10BX)10～30％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，Na2HPO4·12H2O1～3％，KH2PO40.1～0.5％，NaCl 0～0.5％，NH4Cl 0～0.5％，豆粕粉1～5％，玉米渣1～5％，其余为水加水至500ml。
2)小罐发酵产酶10L发酵罐进行，接种量2～10％，在30～35℃，PH6.5～7.5，200～500r/min，溶氧DO控制在30～70，连续培养24～48小时，即可得到高活力中性β-甘露聚糖酶粗酶液。培养基配方按质量百分比计为离心魔芋降解液(糖度10BX)10～30％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，Na2HPO4·12H2O1～3％，KH2PO40.1～0.5％，NaCl 0～0.5％，NH4Cl 0～0.5％，豆粕粉1～5％，玉米渣1～5％，全氟化碳1％，吐温80 0.5～1％，其余为水加水至10L。
在发酵旺盛时通入纯氧，和空气一起组成富氧空气，提高发酵过程中细菌生长及产酶所需的溶氧，采用计算机对发酵过程中的DO，PH，温度，转速进行监控，并在发酵过程中采用定时分批补料，满足细胞生长与产酶需要的营养物质。补料时用的培养基为离心魔芋降解液(糖度10BX)1～3％，胰蛋白胨0.1～1％，酵母浸粉0.1～1％，NaCl 0.1～0.5％。
3)发酵完成后，用沉降式离心机以2800rpm的速度将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去。用硅藻土过滤机滤除绝大部分菌体。用0.1μm的微滤膜对酶液进行纯化处理，进一步除去残存的微量的菌体，4)用6000分子量的超滤膜对稀酶进行处理，浓缩除去部分水和无机盐类物质。
5)DNS法检测发酵液酶活力。在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5条件下，酶活可达1500～1600μ/ml6)中性β-甘露聚糖酶酶液低温下(0～4℃)贮存。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果1)本发明采用UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变，魔芋精粉诱导出TQS6菌株产中性β-魔芋甘露聚糖酶，采用刚果红平板培养基生成透明水解圈，对产酶菌株进行筛选，方法简便，效率高。
2)本发明在发酵过程中采用不完全魔芋降解液代替部分魔芋精粉诱导产酶，可以降低培养基的粘度，同时在培养基中加入全氟化碳、吐温80，提高溶氧，定时分批补料满足细胞在发酵过程中的营养需求，实现了细胞的高密度培养。发酵后的粗酶液在50～55℃，PH6.5～7.0条件下，酶活高达1600μ/ml，远远高于目前一般的研究水平。
3)酶液用离心，微滤和超滤的方法进行纯化后，酶收率达到80％，效果好，得率高。
具体实施例方式
下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。
实施例1产高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶菌种选育1)以CICC协助筛选的10164菌株为基础，通过UV诱变，将菌种点种在含有0.3％的刚果红平板培养基中，培养基配方组成为2.0％琼脂，1％魔芋精粉，胰蛋白胨0.5％，酵母浸粉0.5％，NaC10.5％，刚果红0.3％；30～35℃，培养35小时，可见透明水解圈。
2)选取水解圈直径H/C菌落直径值较大的菌株进行摇瓶复筛，摇瓶培养基组成为魔芋降解液(糖度10BX)500ml，胰蛋白胨30g，酵母浸粉50g，Na2HPO412H2O 100g，KH2PO410g，NaCl 20g，NH4Cl 10g，豆粕粉200g，玉米渣100g，PH6.0，35℃培养30h，得到粗酶液，通过DNS法测定酶活。选取优良菌株进行稳定传代3～8代。产高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶斜面菌种。并将该菌株命名为TQS6，于4℃冰箱中保存。该菌株保藏号为CCTCC M207001。
实施例2利用菌株TQS6 CCTCC M207001发酵生产高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶1)一级液体培养从斜面到三角瓶的放大培养，培养基组成为魔芋降解液150ml，酵母浸粉10g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，其余为水加水至1000ml，PH6.5～7.5，接种量为斜面菌一环，30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5条件下，在液体培养基中培养12～24小时。
2)小罐发酵产酶10L发酵罐进行，培养基组成魔芋降解液(糖度10BX)500ml，胰蛋白胨100g，酵母浸粉100g，Na2HPO4·12H2O 100g，KH2PO420g，NaCl25g，NH4Cl 5g，豆粕粉250g，玉米渣100g，其余为水加水至5升。接种一级液体种子200ml，在30～35℃，200～500r/min，溶氧DO控制在30～70，连续培养24～48小时。
3)发酵完成后，用沉降式离心机以2800rpm的速度将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去。用硅藻土过滤机滤除绝大部分菌体。用0.1μm的微滤膜对酶液进行纯化处理，进一步除去残存的微量的菌体。
4)用6000分子量的超滤膜对稀酶进行处理，浓缩除去部分水和无机盐类物质。
5)DNS法检测发酵液酶活力。在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5条件下，酶活可达1500～1600μ/ml。
6)中性β-魔芋甘露聚糖酶酶液低温下(0～4℃)贮存。
实施例3细胞高密度培养发酵生产高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶1)一级液体培养从斜面到三角瓶的放大培养，培养基组成为魔芋降解液150ml，酵母浸粉10g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，其余为水加水至500ml，PH6.5～7.5，接种量为斜面菌一环，30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5条件下，在液体培养基中培养12～24小时。
2)小罐发酵产酶10L发酵罐进行，培养基组成魔芋降解液(糖度10BX)1000ml，胰蛋白胨100g，酵母浸粉100g，Na2HPO4·12H2O 100g，KH2PO425g，NaCl 25g，NH4Cl 5g，豆粕粉250g，玉米渣100g，全氟化碳50g，吐温80 50g，其余为水加水至5升。接种一级液体种子400ml，在30～35℃，PH6.5～7.5，200～500r/min，溶氧DO控制在30～70，连续培养24～48小时。
在发酵旺盛时通入纯氧，和空气一起组成富氧空气，提高发酵过程中细菌生长及产酶所需的溶氧，应用电脑监控系统对温度、PH、溶氧、转速等参数进行监控，根据各参数的曲线变化特征，实时分析发酵情况，在发酵过程中采用定时分批补料，满足细胞生长与产酶需要的营养物质。补料时用的培养基为魔芋降解液(糖度10BX)1～3％，胰蛋白胨0.1～1％，酵母浸粉0.1～1％，NaCl0.1～0.5％。发酵20小时后，每隔6小时测酶活力，达到产酶高峰时终止发酵，得到高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶酶液。
3)发酵完成后，用沉降式离心机以2800rpm的速度将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去。用硅藻土过滤机滤除绝大部分菌体。用0.1μm的微滤膜对酶液进行纯化处理，进一步除去残存的微量的菌体。
4)用6000分子量的超滤膜对稀酶进行处理，浓缩除去部分水和无机盐类物质。
5)DNS法检测发酵液酶活力。在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5条件下，酶活可达1500～1600μ/ml。
6)中性β-魔芋甘露聚糖酶酶液低温下(0～4℃)贮存。
酶活力测定方法1、DNS法测酶活以0.5％特级魔芋精粉为底物，50℃水浴保温反应10min，加入DNS试剂，沸水浴中显色10min，用纯水稀释定容到25ml。用721分光光度计，在520nm处进行比色。通过测定OD值求出对应的还原糖含量，再用酶活公式计算求出酶活力。酶活力定义为在50℃、pH6.0条件下，每分钟生成1μmol相当于D-甘露糖(D-mannose)的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位。
酶活计算公式为公式X＝A×1ml/V×F×1/T×1000/180式中X-酶活力μmol/mlA-D-甘露糖生成量mgV-吸取酶液体积0.05ml F-酶液稀释倍数一般100～200倍T-反应时间5分钟细胞高密度培养发酵产酶酶活力结果见表1
2、降解测粘法酶的生产过程中，检验酶液质量的另一方法是1ml酶液，于50℃，pH7.0左右，将10～20g魔芋精粉(底物浓度10～20％)降解成甘露低聚糖。降解所需时间为2～4小时，降解液粘度为60～120mPa.s。该方法和生产实践联系密切。
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtill)TQS6，其保藏号为CCTCCNoM207001。
2.按权利要求1所述的枯草芽孢杆菌CCTCC M207001发酵生产高活力中性β-甘露聚糖酶的方法，其特征在于包括以下步骤1)一级液体培养即从斜面到三角瓶的放大培养，接种量为TQS6 CCTCCM207001斜面菌一环，在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5条件下，在液体培养基中培养12～24小时，培养基配方按质量百分比计离心魔芋降解液(糖度10BX)10～30％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，Na2HPO4·12H2O1～3％，KH2PO40.1～0.5％，NaCl 0～0.5％，NH4Cl 0～0.5％，豆粕粉1～5％，玉米渣1～5％，其余为水加水至1000ml；2)小罐发酵产酶10L发酵罐进行，接种量2～10％，在30～35℃，PH6.5～7.5，200～500r/min，溶氧DO控制在30～70，连续培养24～48小时，即可得到高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶粗酶液，培养基配方按质量百分比计为离心魔芋降解液(糖度10BX)10～30％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，Na2HPO4·12H2O1～3％，KH2PO40.1～0.5％，NaCl 0～0.5％，NH4Cl 0～0.5％，豆粕粉1～5％，玉米渣1～5％，全氟化碳1％，吐温80 0.5～1％，其余为水加水至5L；3)发酵完成后，用沉降式离心机以2800rpm的速度将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去，用硅藻土过滤机滤除绝大部分菌体，用0.1μm的微滤膜对酶液进行纯化处理，进一步除去残存的微量的菌体；4)用6000分子量的超滤膜对稀酶进行处理，浓缩除去部分水和无机盐类物质；5)DNS法检测发酵液酶活力，在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5条件下，酶活可达1500～1600μ/ml，6)中性β-魔芋甘露聚糖酶酶液在低温下(0～4℃)贮存。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌TQS6 CCTCC M207001发酵生产高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶的方法，其特征在于实现细胞高密度培养包括以下步骤1)一级液体培养从斜面到三角瓶的放大培养，培养基组成为魔芋降解液150ml，酵母浸粉10g，胰蛋白胨10g，NaCl 5g，其余为水加水至1000ml，PH6.5～7.5，接种量为斜面菌一环，30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5条件下，在液体培养基中培养12～24小时；2)小罐发酵产酶10L发酵罐进行，培养基组成魔芋降解液(糖度10BX)1000ml，胰蛋白胨100g，酵母浸粉100g，Na2HPO4·12H2O 100g，KH2PO425g，NaCl 25g，NH4Cl 5g，豆粕粉250g，玉米渣100g，全氟化碳50g，吐温80 50g，其余为水加水至5升，接种一级液体种子200～500ml，在30～35℃，PH6.5～7.5，200～500r/min，溶氧DO控制在30～70，连续培养24～48小时；在发酵旺盛时通入纯氧，和空气一起组成富氧空气，提高发酵过程中细菌生长及产酶所需的溶氧，应用电脑监控系统对温度、PH、溶氧、转速等参数进行监控，根据各参数的曲线变化特征，实时分析发酵情况，在发酵过程中采用定时分批补料，满足细胞生长与产酶需要的营养物质，补料时用的培养基为魔芋降解液(糖度10BX)1～3％，胰蛋白胨0.1～1％，酵母浸粉0.1～1％，NaCl0.1～0.5％，发酵20小时后，每隔6小时测酶活力，达到产酶高峰时终止发酵，得到高活力中性β-魔芋甘露聚糖酶酶液；3)发酵完成后，用沉降式离心机以2800rpm的速度将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去，用硅藻土过滤机滤除绝大部分菌体，用0.1μm的微滤膜对酶液进行纯化处理，进一步除去残存的微量的菌体；4)用6000分子量的超滤膜对稀酶进行处理，浓缩除去部分水和无机盐类物质；5)DNS法检测发酵液酶活力，在30～35℃，200～300r/min，PH6.5～7.5条件下，酶活可达1500～1600μ/ml；6)中性β-魔芋甘露聚糖酶酶液在低温下(0～4℃)贮存。
全文摘要
本发明提出了一种采用UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变，诱导培养能高效表达中性β－甘露聚糖酶的枯草芽孢杆菌TQS6 CCTCCM207001及其发酵生产高活力中性β－甘露聚糖酶的生产方法，对该菌株进行斜面培养，一级、二级培养后进行发酵培养，在选定的培养基中，加入不完全降解液，该降解液来源于生产中的离心糖液。并且在发酵过程中通入富氧空气增加溶氧，在优化产酶条件下可发酵得到高活力中性β－魔芋甘露聚糖酶。通过本技术生产出的酶具有产酶量高，酶活力高，产酶稳定，生产周期短，生产成本低等特点。从而能高效经济地转化生产甘露低聚糖。
文档编号C12N13/00GK101016531SQ20071005143
公开日2007年8月15日 申请日期2007年1月30日 优先权日2007年1月30日
发明者彭冬秋, 黄代勇, 刘全新, 万霞, 李小虎, 黄芳 申请人:武汉东方天琪生物工程有限公司