专利名称：一种壳聚糖微球固定化脂肪酶制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域，涉及壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺。(二) 背景技术壳聚糖是一种N-脱乙酰基葡萄糖聚合物，来源丰富，价格便宜，是甲壳素最重 要的衍生物。壳聚糖具有无毒性、良好凝胶性、生物兼容性、蛋白质亲和性和金属 离子螯合特性，是良好的固定化酶载体。以壳聚糖为载体的固定化酶种类有很多， 如胃蛋白酶、葡萄糖氧化酶、L-天门冬酰胺酶、p-甘露聚糖酶等。以天然壳聚糖为载体固定化酶主要缺陷是因在偏酸条件下发生溶解，使固定化酶难以回收，其中 大部分为粉末状，载体流速差，表面积小，限制其应用。因此目前的国内外研究主 要集中在制备壳聚糖微球作为固定化酶载体，该载体具有吸附性能强，耐酸耐碱性 能好等特性，从而克服了上述缺陷，是酶固定化的良好载体。脂肪酶作为生物催化剂催化反应条件温和，产物颜色浅，副产物少且具有专一 性，利于生产高质量的单甘酯、脂肪酸、甘油和其他种类的油脂产物，在工业上应 用广泛。尤其是近年来在油脂生产中的应用，对生产绿色环保燃料，建设环境友好 型社会，解决我国日益严重的能源问题，有着重要的现实意义和经济效益。但脂肪 酶的价格较高，用游离脂肪酶进行反应时，脂肪酶只能使用一次而不能回收，因此 造成产物成本较高且导致后续分离步骤困难，影响了脂肪酶在工业上的具体应用。 通过对脂肪酶进行固定化，固定化酶在保持高效、专一及温和的酶催化反应特性的 同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、 工艺简便等一系列优点，大大提高了生产效益。以壳聚糖微球为载体固定化脂肪酶的研究近年来备受关注。Tien-ChiehHung等 人利用磁性壳聚糖微球固定化脂肪酶，酶活力达13.8U/g; Shao-HuaChiou通过两种 壳聚糖微球来制备固定化脂肪酶，酶活回收率分别为75%和85%;吴茜茜等人研究 了壳聚糖吸附和戊二醛交联对脂肪酶固定化条件，对德氏根霉脂肪酶进行固定，并 将该固定化酶用于酯的合成；陈盛等人以蟹壳为原料提取壳聚糖，用戊二醛作交联
剂，将碱性脂肪酶固定于壳聚糖上；彭立凤等人研究了壳聚糖涂层在纤维素滤纸上 成膜后再固定化猪胰脂肪酶的最佳条件。我国目前大多采用单一方法固定，如吸附法或交联法单一固定化脂肪酶，由于 载体形状的不规则性，固定化酶活力回收率普遍较低(36%-50%)及固定化酶对底物 的亲和力低等不足之处限制了固定化脂肪酶的应用。针对此，我们以壳聚糖微球为 固定化载体，先后利用壳聚糖分子上的羟基和氨基，采用戊二醛和碳二亚胺两次复 合固定脂肪酶，提高固定化酶活力。
发明内容本发明的目的在于提供一种壳聚糖微球固定化脂肪酶制备工艺。 为达到本发明目的，本发明采用的技术方案如下一种壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述的工艺按如下步骤进行(l)用戊二醛为交联剂制备固定化脂肪酶A:将假丝酵母脂肪酶溶于磷酸盐缓冲液 a中以壳聚糖微球为载体、采用戊二醛交联，制备得戊二醛交联固定化的脂肪酶 A;(2)用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐活化固定化的脂肪酶A制备固定 化脂肪酶B:在用pH值为6. 5 7. 5磷酸盐缓冲液b配制的0. 70 0. 80mg/mL假丝酵 母脂肪酶溶液中，加入固定化的脂肪酶A，所述的固定化的脂肪酶A的终浓度为 0.005 0.0055g/ml，搅拌均匀后，再加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐 酸盐溶液，搅拌3 8小时，使其充分固定，用去离子水冲洗，过滤，滤饼干燥得 壳聚糖微球固定化脂肪酶B。本发明所述步骤(l)为用pH值为6. 5 7. 5磷酸盐缓冲液a配制的0. 75mg/mL 的假丝酵母脂肪酶溶液中，加入壳聚糖微球，所述的壳聚糖微球的终浓度为0.005 0.0055g/ml，搅拌均匀后，再加入戊二醛溶液，使戊二醛的终浓度为2.0% 2.5%(g/ml)，续搅拌5 7时后，使其充分固定，用去离子水冲洗，过滤，滤饼干燥， 即得所述壳聚糖微球固定化脂肪酶A。本发明步骤(l)中所述的壳聚糖微球有80%以上的微球的粒径在50 200nm。 本发明步骤(l)中所述的壳聚糖微球按如下方法制备称取壳聚糖溶于体积分数 为2%的乙酸溶液，制得质量分数为2. 5%的壳聚糖酸性溶胶，在搅拌下，将所述的壳 聚糖酸性溶胶缓慢加入到液体石蜡和司盘-80的混合液中，所述的液体石蜡的加入量 为80mL/g壳聚糖，所述的的司盘-80的加入量为5mL/g壳聚糖，搅拌使溶胶液滴均匀 分散，然后加入体积分数为25%二醛溶液，所述的戊二醛溶液的加入量为10mL/g壳 聚糖，搅拌均匀，调pH至9 10，于7(TC水浴保温2 4小时，静置冷却后，弃去油 层，再依次用石油醚、丙酮、无水乙醇浸洗，过滤后，虑饼ot:真空干燥，得到壳聚 糖微球。本发明所述的磷酸盐缓冲液a或磷酸盐缓冲液b各自独立为Na2HP04-KH2P04、 Na2HP04-NaH2PO^ K2HP04-KH2P04。本发明步骤(l)中所述加入的戊二醛溶液的浓度为25M(g/ml)。 本发明步骤(2)中所述加入的乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度 为0.2%(g/ml)。本发明所述的制备工艺具体按如下步骤进行a) 用pH值为7的Na2HP0厂KH2P04缓冲液配制的0. 75mg/mL的假丝酵母脂肪酶 (C朋力Va7 "gasa)溶液中，加入壳聚糖微球，所述的壳聚糖微球的终浓度为 0.005 0.0055g/ml，搅拌均匀后，再加入25%(g/ml)的戊二醛溶液，使戊二 醛的终浓度为2.2W(g/ml),继续搅拌5 7时，使其充分固定，用去离子水 冲洗，过滤，滤饼干燥，即得所述壳聚糖微球固定化脂肪酶A;b) 用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐活化固定化的脂肪酶A制备固定 化脂肪酶B:在用pH值为7的Na2HP04-KH2P04缓冲液配制的0. 70 0. 80mg/mL 的假丝酵母脂肪酶(Om^/a^goya)溶液中，加入固定化的脂肪酶A，所述的 固定化的脂肪酶A的终浓度为0.005 0.0055g/ml，搅拌均匀后，再加入乙 基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液，振荡6h，使其充分固定，用去 离子水冲洗，过滤，滤饼干燥得壳聚糖微球固定化脂肪酶B。本发明有益效果主要体现在1)利用壳聚糖微球羟基和氨基先后两次固定化脂 肪酶，提高了酶蛋白的结合率和活力回收率(62.5%)，固定化酶活力达835U/g载 体，比活力达34.9U/mg蛋白。2)利用本发明方法制得的壳聚糖微球固定化酶制 备油酸乙酯，反应8h后，油酸乙酯转化率达到68.4%。壳聚糖微球固定化酶循环使 用次数达6次，降低了游离酶的反应成本。
具体实施方式
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于 此。实施例中脂肪酶为假丝酵母脂肪酶C朋力由n^oM. 1个酶活力单位定义为在 37°C， pH7.2时，在l分钟内水解橄榄油中l微摩尔脂肪酸的量。我们使用的是美 国sigma公司商品酶type VII粗酶。实施例l.壳聚糖微球的制备称取lg壳聚糖溶于体积分数为2。/。的乙酸溶液，制得质量分数为2.5%的壳聚糖酸 性溶胶。在搅拌下，将上述溶胶缓慢加入至iJ80mL液体石蜡和5mLSpan-80的混合液 中，搅拌20min，使溶胶液滴均匀分散，然后加入10mL体积分数为25y。戊二醛溶液， 搅拌10min后，用lmol/L的NaOH溶液将其pH调至9，于7(TC水浴保温3h，静置冷却 后，弃去上层油层，再依次用石油醚、丙酮、无水乙醇浸洗，50'C真空干燥，得到 壳聚糖微球。实施例2.戊二醛为交联剂制备固定化脂肪酶称取0.50g壳聚糖微球，加入pH-7的Na2HP04-KH2P04缓冲液配制的0.75mg/mL 的假丝酵母脂肪酶(Ow^^i wg(wfl)溶液100mL，使壳聚糖微球终浓度0.005g/ml，室 温下搅拌lh。接着加入25y。浓度的戊二醛溶液ll.lmL,使戊二醛终浓度为2.5%￡/1111， 继续搅拌6h，充分交联，用去离子水反复冲洗3遍，过滤，干燥即得固定化脂肪酶。 该固定化酶活力达473U/g载体，比活力达22.1U/mg蛋白，活力回收率达38.1%。实施例3.用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐活化再次制备固定化脂肪酶称取0.50g步骤2中的戊二醛固定的壳聚糖微球脂肪酶浸于100mL体积0.75 mg/tnL的脂肪酶液(pH-7)中，使戊二醛固定的壳聚糖微球脂肪酶浓度为0.005 g/ml， 搅拌lh。然后加入25mL乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液(0.2%)，使乙 基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐浓度为0.04。/。g/ml，继续振荡6h，使其充分固 定，用去离子水反复冲洗3遍，过滤，干燥即得壳聚糖微球固定化脂肪酶，固定化酶 活力达813U/g载体，比活力达35.3U/mg蛋白，活力回收率达60.2%。实施例4.固定化酶应用于油酸乙酯的合成 称取3g油酸加入至Ul0m该U度试管中，加入水3mL和乙醇3mL，之后向反应体系 中加入壳聚糖微球固定化酶0.4g，反应温度47'C，反应8h后，油酸乙酯转化率达到 68.4%。壳聚糖微球固定化酶循环使用次数达6次，油酸乙酯转化率从68.4%降至32%。实施例5.壳聚糖微球的制备称取^壳聚糖溶于体积分数为2%的乙酸溶液，制得质量分数为2.5%的壳聚糖酸 性溶胶。在搅拌下，将上述溶胶缓慢加入到80mL液体石蜡和5mLSpan-80的混合液 中，搅拌20min，使溶胶液滴均匀分散，然后加入10mL体积分数为25。/。戊二醛溶液， 搅拌10min后，用lmol/L的NaOH溶液将其pH调至10，于70"C水浴保温3h，静置冷却 后，弃去上层油层，再依次用石油醚、丙酮、无水乙醇浸^fe， 5(TC真空干燥，得到 壳聚糖微球。实施例6.戊二醛为交联剂制备固定化脂肪酶称取0.525g壳聚糖微球，加入pt^6.5的Na2HP04-NaH2P04缓冲液配制的 0.75mg/mL的假丝酵母脂肪酶(Om^fo及wgosa)溶液100mL，使壳聚糖微球终浓度 0.00525g/ml，室温下搅拌lh。接着加入25。/。浓度的戊二醛溶液8.7mL，使戊二醛终 浓度为2.0。/。g/ml，继续搅拌5h，充分交联，用去离子水反复冲洗3遍，过滤，干燥 即得固定化脂肪酶。该固定化酶活力达468U/g载体，比活力达20.2U/mg蛋白，活力 回收率达36.4%。实施例7.用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐活化再次制备固定化脂肪酶 称取0.525g步骤2中的戊二醛固定的壳聚糖微球脂肪酶浸于100mL体积0.70 mg/mL的脂肪酶液(pH-6.5)中，使戊二醛固定的壳聚糖微球脂肪酶浓度为0.005 25g/ml，搅拌lh。然后加入25mL乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液(0.2。/0)， 使乙基[3-口甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐浓度为0,04n/。g/ml，继续振荡5h，使其充 分固定，用去离子水反复冲洗3遍，过滤，干燥即得壳聚糖微球固定化脂肪酶，固定 化酶活力达814U/g载体，比活力达31.8U/mg蛋白，活力回收率达61.2%。实施例8.固定化酶应用于油酸乙酯的合成称取3g油酸加入到10m该lj度试管中，加入水3mL和乙醇3mL，之后向反应体系
中加入壳聚糖微球固定化酶(^40g,反应温度47。C,反应8h后，油酸乙酯转化率达到 67.1%。壳聚糖微球固定化酶循环使用次数达6次，油酸乙酯转化率从67.1%降至 32.6%。实施例9.壳聚糖微球的制备称取lg壳聚糖溶于体积分数为2。/。的乙酸溶液，制得质量分数为2.5。/。的壳聚糖酸 性溶胶。在搅拌下，将上述溶胶缓慢加入到80mL液体石蜡和5mLSpan-80的混合液 中，搅拌20min，使溶胶液滴均匀分散，然后加入10mL体积分数为25。/。戊二醛溶液， 搅拌10min后，用lmol/L的NaOH溶液将其pH调至9.5，于7(TC水浴保温3h，静置冷 却后，弃去上层油层，再依次用石油醚、丙酮、无水乙醇浸洗，5(TC真空干燥，得 到壳聚糖微球。实施例IO.戊二醛为交联剂制备固定化脂肪酶称取0.55g壳聚糖微球，加入pI^7.5的K2HP04-KH2P04缓冲液配制的0.75mg/mL的假 丝酵母脂肪酶(Cam/Wa 7 "gOM)溶液100mL，使壳聚糖微球终浓度0.0055g/ml室温下 搅拌lh。接着加入25o/。浓度的戊二醛溶液9.5mL，使戊二醛终浓度为2.17% g/ml，继 续搅拌7h，充分交联，用去离子水反复冲洗3遍，过滤，干燥即得固定化脂肪酶。该 固定化酶活力达482U/g载体，比活力达21.3U/mg蛋白，活力回收率达37.9%。实施例11.用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐活化再次制备固定化脂肪酶称取0.55g步骤2中的戊二醛固定的壳聚糖微球脂肪酶浸于100mL体积0.80 mg/mL的脂肪酶液(pP^7.5)中，使戊二醛固定的壳聚糖微球脂肪酶浓度为0.005 5g/ml，搅拌lh。然后加入25mL乙基[3-(:Z甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液(0.20/0), 使乙基[3-口甲胺萄丙基]碳二亚胺盐酸盐浓度为0.0f/。(g/ml)，继续振荡7h，使其充 分固定，用去离子水反复冲洗3遍，过滤，干燥即得壳聚糖微球固定化脂肪酶，固定 化酶活力达835U/g载体，比活力达34.9U/mg蛋白，活力回收率达62.5%。实施例12.固定化酶应用于油酸乙酯的合成称取3g油酸加入到10m该ij度试管中，加入水3mL和乙醇3mL，之后向反应体系 中加入壳聚糖微球固定化酶0.40g，反应温度47。C，反应8h后，油酸乙酯转化率达到66.8%。壳聚糖微球固定化酶循环使用次数达6次，油酸乙酯转化率从66.8%降至 34.2%。
权利要求
1.一种壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述的工艺按如下步骤进行(1)用戊二醛为交联剂制备固定化脂肪酶A将假丝酵母脂肪酶溶于磷酸盐缓冲液a中，以壳聚糖微球为固定化载体，采用戊二醛交联，制备得戊二醛交联固定化的脂肪酶A；(2)用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐活化固定化的脂肪酶A制备固定化脂肪酶B在用pH值为6.5～7.5磷酸盐缓冲液b配制的0.70～0.80mg/mL假丝酵母脂肪酶溶液中，加入固定化的脂肪酶A，所述的固定化的脂肪酶A的终浓度为0.005～0.0055g/ml，搅拌均匀后，再加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液，搅拌3～8小时，使其充分固定，用去离子水冲洗，过滤，滤饼干燥得壳聚糖微球固定化脂肪酶B。
2. 如权利要求1所述的壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述 步骤(l)为用pH值为6. 5 7. 5磷酸盐缓冲液a配制的0. 75mg/mL的假丝 酵母脂肪酶溶液中，加入壳聚糖微球，所述的壳聚糖微球的终浓度为0. 005 0.0055g/ml，搅拌均匀后，再加入戊二醛溶液，使戊二醛的终浓度为2. 0% 2.5%(g/ml)，继续搅拌5 7时后，使其充分固定，用去离子水冲洗，过滤， 滤饼干燥，即得所述壳聚糖微球固定化脂肪酶A。
3. 如权利要求1或2所述的壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于 所述步骤(l)中所述的壳聚糖微球有80%以上的微球的粒径在50 200nm。
4. 如权利要求1或2所述的壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于 所述步骤(l)中所述的壳聚糖微球按如下方法制备称取壳聚糖溶于体积分 数为2%的乙酸溶液，制得质量分数为2. 5%的壳聚糖酸性溶胶，在搅拌下， 将所述的壳聚糖酸性溶胶缓慢加入到液体石蜡和司盘-80的混合液中，所述 的液体石蜡的加入量为80mL/g壳聚糖，所述的的司盘-80的加入量为5mL/g 壳聚糖，搅拌使溶胶液滴均匀分散，然后加入体积分数为25%戊二醛溶液， 所述的戊二醛溶液的加入量为10mL/g壳聚糖，搅拌均匀，调pH至9 10， 于70'C水浴保温2 4小时，静置冷却后，弃去油层，再依次用石油醚、丙 酮、无水乙醇浸洗，过滤后，虑饼0。C真空干燥，得到壳聚糖微球。
5. 如权利要求1或2所述壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所 述的磷酸盐缓冲液a或磷酸盐缓冲液b各自独立为Na2HP04-KH2P04、 Na2HP04-NaH2P04或K2HP04-KH2P04。
6. 如权利要求2所述壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述步 骤(1)中加入的戊二醛溶液的浓度为25% (g/ml)。
7. 如权利要求2所述壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述步 骤(2)中加入的乙基[3- (二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液的浓度为0. 2%(g/ml)。
8. 如权利要求2所述壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺，其特征在于所述的 制备工艺按如下步骤进行a) 用pH值为7的Na2HP0rKH2P04缓冲液配制的0. 75mg/raL的假丝酵母脂肪 酶溶液中，加入壳聚糖微球，所述的壳聚糖微球的终浓度为0.005 0.0055g/ml，搅拌均匀后，再加入25% (g/ml)的戊二醛溶液，使戊二醛 的终浓度为2.2%( g/ml)，继续搅拌5 7时，使其充分固定，用去离子 水冲洗，过滤，滤饼干燥，即得所述壳聚糖微球固定化脂肪酶A;b) 用乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐活化固定化的脂肪酶A制备固定化脂肪酶B:在用pH值为7的Na2HP04-1(貼04缓冲液配制的0. 70 0.80mg/mL的假丝酵母脂肪酶溶液中，加入固定化的脂肪酶A，所述的固 定化的脂肪酶A的终浓度为0.005~0.0055g/ral,搅拌均匀后，再加入乙 基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液，振荡6h，使其充分固定， 用去离子水冲洗，过滤，滤饼干燥得壳聚糖微球固定化脂肪酶B。
全文摘要
一种壳聚糖微球固定化脂肪酶的制备工艺(1)将假丝酵母脂肪酶溶于磷酸盐缓冲液a中，以壳聚糖微球为固定化载体，采用戊二醛交联，制备得戊二醛交联固定化的脂肪酶A；(2)在用pH值为6.5～7.5磷酸盐缓冲液b配制的0.70～0.80mg/mL假丝酵母脂肪酶溶液中，加入固定化的脂肪酶A(终浓度为0.005～0.0055g/ml)，搅拌均匀后，再加入乙基[3-(二甲胺基)丙基]碳二亚胺盐酸盐溶液，搅拌，使其充分固定，处理后得壳聚糖微球固定化脂肪酶B。利用本发明方法制备壳聚糖微球固定化酶，提高了酶蛋白的结合率和活力回收率高，固定化酶活力、比活力强，可循环使用次数达6次。
文档编号C12N9/18GK101113433SQ200710069820
公开日2008年1月30日 申请日期2007年6月29日 优先权日2007年6月29日
发明者孙培龙, 孟祥河, 平 邵 申请人:浙江工业大学