专利名称：：一种前t载体及其制备与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种可用于快速克隆PCR产物的前T载体及其制备与应用。(二)背景4支术PCR技术是分子生物学和基因工程研究中的一项基本技术，它被广泛用于体外扩增已知或未知的特异DNA片段。对PCR产物进行快速有效的克隆是开展杂交分析、高质量测序及从复杂PCR产物中分离目的片段等下游实验，实现PCR产物多种用途的必经之路。T-载体是近年发展起来的一种用于直接克隆PCR产物的新型载体。T-载体一般为线性，其分子末端各有一个3'dT(脱氧胸苷)突出。利用7^DNA聚合酶的末端转移酶活性，在扩增DNA的3'末端非才莫纟反依赖地加上一个核苦酸，通常为脱氧腺苷酸(dA)。这个3'dA突出端被用于把PCR产物插入到插入位点有一个3'dT突出的T-载体上。这样就将PCR产物以粘性末端连接的方式直接克隆到载体上。这种方式不仅克服了常规克隆方法的缺点，而且操作筒便、方法快捷、连接效率高，因而其应用范围非常广泛。经典的T-载体的构建方法有两种(1)将载体通过5VwaE或五coRV等平端内切酶线性化切出平端，在缺乏dATP及存在过量dTTP情况下，用7^DNA聚合酶催化，在3，末端加上dT，回收后即得到T-载体。该方法对反应条件要求严格，平末端加dT的效率达不到100°/。，因为反应是一个动态过程，r"《酶的工作效率随反应体系中越来越多的T末端产生而P争低，这就导致少量两端均未加T的平端线性化质粒的存在，在与PCR产物连接过程中难以避免载体自身环化，且经过两次回收的过程较繁瑣；每次生产T-载体产量有限(一般为l吗)，不适于大规模生产，且dT碱基不太稳定，故批次质量不稳定，如果其贮存时间较长或多次冻融反复使用，克隆效率会大大降低。如蓝白斑筛选时，即使有大量白色菌落出现，其中很多都是假阳性。这样制作T-载体只是为维护商业利益有意回避他人复制。(2)用脱氧核苦酸末端转移酶(TDT)在线性化载体的3，末端加上双脱氧胸腺嘧咬核香酸(ddTTP)。这种方法存在明显缺点一是同样不能保证100%的载体分子末端都能加上dT，二是难以控制加上去的正好是l个dT。利用限制性内切酶制备T-载体是T-载体制备方法中最为先进的方式，国内外的一些学者都进行了尝试，并建立了相应的T-载体。在内切酶家族中，有一类称可变酶，它们的识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的。经查NewEnglandBiolabs公司的目录，符合上述特征的酶列于表1:表1可用于生产T-载体的限制性内切酶(NEB)<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>国内也有较多的文章"R道T载体的构建及其应用。酶法制备T载体首先要得到一个环状的前T质粒载体，经Xcml酶切两个位点后，载体的大片段DNA线性化，而且两个3，末端均带dT，从而得到可用于PCR产物快速克隆的T载体，如市场上供应pUCm-T载体。用酶法制备T载体有可能存在以下几个方面的问题，一，如果酶切质粒DNA质量不高，外源基因不能插入载体中，而载体转化感受态细胞后能够在抗性平板上生长。pUCm-T载体设计了蓝白斑筛选方案以筛选目的DNA片段是否插入载体，如果插入载体，编码半乳糖苷酶ot肽的基因LacZ被插入失活，细胞内没有半乳糖苷酶活性，在含有生色底物X-gal的筛选平板中白色菌落为插入失活阳性克隆，而兰色菌落为不含外源基因的阴性克隆。这种方法需要使用价格昂贵的X—gal，制备蓝白斑筛选平板也比较麻烦。二，如果两个IcmI酶切位点空间位置较近，将影响载体的酶切效率，即使载体DNA的纯度很高，酶的质量也^艮好，也会出现酶切载体一"刀"的情况，这种线性的载体不能和PCR产物连接，而是载体自连，从而导致阴性克隆的产生。
发明内容本发明既是为了提供一种可用于快速克隆PCR产物、筛选阳性克隆过程中不需要使用X-gal的前T载体，及其制备与应用。为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种前T载体，由以下方法制备得到(1)以含有氨卡青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒为模板进行PCR扩增，在引物的5'末端引入Xc附I酶切位点，扩增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表达调控序列、两端含有ZcmI酶切位点的DNA片段；(2)利用重叠延伸拼接技术，将步骤(1)得到的DNA片段和T载体进行连接；(3)将步骤(2)所得连接产物转化大肠杆菌DH5cc或JM109，筛选阳性克隆，即得所述前T载体。本发明还涉及制备所述的前T载体的方法，所述方法如下(l)以含有氨节青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒为模板进行PCR扩增，在引物的5，末端引入Xc附I酶切位点，扩增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表达调控序列、两端含有Xcwl酶切位点的DNA片段；(2)用T4DNA连接酶将步骤(1)得到的DNA片段和pUCm-T载体进行连接；(3)将步骤(2)所得连接产物转化大肠杆菌DH5oc或JM109,筛选阳性克隆，即得所述前T载体。所述含有氨千青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒可为下列之一①pET28，②pET29。具体的，步骤(1)引物DNA片段的两端各设计一个酶切位点CCANNNNN*NNNNTGG，上游的Xcml酶切序列的NH殳计为T，下游的义cwl酶切序列的1SP设计为A。优选的，步骤(1)以质粒pET28或pET39为模板DNA进行PCR扩增，引物序列为Ph5，XXXGGATCCAAGGGTATAATGGGCCTAACTACGGCTACACTA3，，P2:5，CTCAAGCTTCCAAGGGTATAATGGACCCCTATTTGTTTATTTTT3，，PCR反应条件94。C预变性3分钟，94。C变性30s，45。C退火30s，72。C延伸90s,三个循环；然后94。C变性30s，72。C延伸90s，27个循环。本发明还涉及所述的前T载体在制备用于快速克隆PCR产物的T载体中的应用。具体的，所述T载体制备方法如下抽提前T载体的DNA，用限制性内切酶ZcmI酶切后，0.8%1%琼脂糖电泳分离载体DNA片段和含有抗性基因的DNA片段，回收大片段DNA，即为所述用于快速克隆PCR产物的T载体。本发明的有益效果主要体现在用本发明前T载体制备得到的载体可用于快速克隆PCR产物，筛选阳性克隆过程中不需要^f吏用X-gal。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此(实施例中所用试剂、质粒、酶、引物等，均购自上海生工生物工程技术服务有限公司)实施例1:酶切盒的构建以pET28(或pET39也可)为模板，利用下列两条引物啦文PCR反应Pl(正向)5，XXXGGATCCAAGGGTATAATGGGCCTAACTACGGCTACACTA3'P2(反向)5，CTCAAGCTTCCAAGGGTATAATGGACCCCTATTTGTTTATTTTT3,反应参凄t如下94。C预变性3分钟，94。C变性30s，45。C退火30s，72。C延伸90s，三个循环；然后94。C变性30s，72。C延伸90s，27个循环酶..7J2《PlusDNApolymerase实施例2:前T载体的制备实施例1的PCR产物与市场上供应的pUCm-T载体连接，连接体系如下PCR产物luLpUCm國TluL10xT4DNAligasebuffer3uLT4DNAligaseluLddH2024uL至总体积30uL14-16。C连接10小时以上，转化￡."//01150((或JM109也可)。实施例3:T载体的制备碱-SDS法抽提实施例2的阳性转化子质粒，经质粒DNA回收试剂盒纯化，用IcwI酶切，酶切体系如下质粒2uL10xNEBbuffer2uL(5u/uL)0.5uLddH20至总体积20uL37。C酶切反应2h以上，经0.8%琼脂糖凝胶电泳分离载体DNA片段和含有卡那抗性基因的DNA片段，切胶回收大片段的DNA，即得到用于快速克隆目的PCR产物的T载体。实施例4:PCR产物的克隆及阳性克隆的筛选用％《PlusDNApolymerase做PCR扩增目的DNA片段，将实施例3的T载体与目的基因连接，转化于含氨千青霉素的平板，次日将转化子影印于卡那平板。能在氨苄抗性平板生长，不能在卡那抗性平板生长的转化子为含有外源基因片段的阳性克隆。权利要求1.一种前T载体，由以下方法制备得到(1)以含有氨苄青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒为模板进行PCR扩增，在引物的5’末端引入XcmI酶切位点，扩增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表达调控序列、两端含有XcmI酶切位点的DNA片段；(2)用T4DNA连接酶将步骤(1)得到的DNA片段和T载体进行连接；(3)将步骤(2)所得连接产物转化大肠杆菌DH5α或JM109，筛选阳性克隆，即得所述前T载体。2.制备如权利要求1所述的前T载体的方法，其特征在于所述方法如下(1)以含有氨节青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒为模板进行PCR扩增，在引物的5，末端引入Xcml酶切位点，扩增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表达调控序列、两端含有Zcml酶切位点的DNA片段；(2)利用重叠延伸拼接技术，将步骤(1)得到的DNA片段和T载体进行连接；(3)将步骤(2)所得连接产物转化大肠杆菌DH5oc或JM109，筛选阳性克隆，即得所述前T载体。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述含有氨苄青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒为下列之一①pET28，②pET29。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(1)引物DNA片段的两端各设计一个义cml酶切位点CCANNNNN*NNNNTGG,上游的酶切序列的N4殳计为T,下游的Xcwl酶切序列的>1*设计为A。5.如权利要求4所述的方法，其特征在于步骤(1)以质粒pET28或pET39为模板DNA进行PCR扩增，引物序列为PI:5,XXXGGATCCAAGGGTATAATGGGCCTAACTACGGCTACACTA3'，P2:5，CTCAAGCTTCCAAGGGTATAATGGACCCCTATTTGTTTATTTTT3'，PCR反应条件94。C预变性3分钟，94。C变性30s，45。C退火30s,72。C延伸90s，三个循环；然后94。C变性30s,72。C延伸90s，27个循环。6.如权利要求1所述的前T载体在制备用于快速克隆PCR产物的T载体中的应用。7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述T载体制备方法如下抽提前T载体的DNA，用限制性内切酶％cmI酶切后，0.8%1%琼脂糖电泳分离载体DNA片段和含有抗性基因的DNA片段，回收大片段DNA，即为所述用于快速克隆PCR产物的T载体。全文摘要本发明提供了一种前T载体，由以下方法制备得到(1)以含有氨苄青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒为模板进行PCR扩增，在引物的5’末端引入XcmI酶切位点，扩增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表达调控序列、两端含有XcmI酶切位点的DNA片段；(2)用T<sub>4</sub>DNA连接酶将步骤(1)得到的DNA片段和pUCmT载体进行连接；(3)将步骤(2)所得连接产物转化大肠杆菌DH5α或JM109，筛选阳性克隆，即得所述前T载体。本发明的有益效果主要体现在用本发明前T载体制备得到的载体可用于快速克隆PCR产物，筛选阳性克隆过程中不需要使用X-gal、阴性率低。文档编号C12N15/63GK101333538SQ20071006981公开日2008年12月31日申请日期2007年6月29日优先权日2007年6月29日发明者于真真,任慧颖,杨丹燕,林陈水,明许申请人:浙江工业大学