专利名称：D-氨基酸的生物催化制备方法
技术领域：
本发明属于化合物的制备方法，涉及D-氨基酸的生物催化制备方法，主 要涉及D-色氨酸，D-苯丙氨酸，和D-酪氨酸的生物催化制备方法。
背景技术：
非蛋白氨基酸，如D型氨基酸和含不同取代基的氨基酸衍生物，是现代新 药研发的重要工具和基础原料。结构多样的非蛋白氨基酸在世界市场上一直价 格昂贵，供不应求。非蛋白氨基酸等的制备能力也是一个国家新药研发能力的 象征性指标，与发达国家相比，我国在该领域落后的差距较大。由于产品附加 值高，进入市场容易，非蛋白氨基酸制造技术的发展竞争激烈。现行方法有化 学合成法和生物转化法。前者用不对称催化剂，价格昂贵且回收难，过程中尚 有保护去保护等步骤；后者有海因法，水解酶拆分法等，但每种方法都需要多 步反应，工艺复杂，路线长，排放物种类多等弊端。
发明内容
本发明的目的是提供一种D-氨基酸的生物催化制备方法，通过以下技术
方案实现
(1) 用酵母匀浆做催化剂
在5 0 0 m L摇瓶中，培养酵母菌Rhodotorula graminis (ATCC 20804)(牧 草红酵母)，生长2 4小时后，离心，倾出清液，冷冻，超声破壁，制成匀浆， 置回摇瓶中，每瓶中加入相同量消旋体D， L-氨基酸5 Omg;调pH7.3， 通空气，透气封口，放回在控温摇床中，圆周式摇动，反应时间4-4 0小时， 超滤、稀释，注入HPLC进行追踪分析，用大赛路冠醚色谱柱分析，时间延 长到l 2 0分钟，确定获得目的产物。本发明所用的酵母菌，通用編号为ATCC 20804，购自美国。
(2) 活细胞做催化剂
本发明可在酵母菌Rhodotorula graminis (ATCC 20804)，生长2 4小时后， 经离心，倾出清液后直接用活细胞作为催化剂，用活细胞时，不需冷冻，超声 破壁步骤，直接置回摇瓶中，进入下一步骤(同上)。
本发明用大赛路冠醚色谱柱分析，CrownpakCR(+),D-Try,tr=65min，产物 经鉴定确认为吲哚乙酸。
吲哚乙酸英文名Indole Acetic Acid，又名Au x i n，是植物中最主要 的生长素。该物质的发现和研究已经有一个多世纪，而其作用机理新近才发现
(Nature 446, 640-644， 2007). 本发明方法表明经过L 一 T r y的IAA代谢途 径，这个代谢途径广泛存在于植物中，和一些植物依赖性微生物中，但从未见 过在该菌中存在的报道。
本发明的有益之处是(1)含多种酶的酵母菌Rhodotorulagraminis(ATCC 20804)匀桨(或活细胞)，在通空气的条件下，能够选择性地氧化消旋体氨基 酸中L一型，留下未反应的D—型。这一方法可用于D—型氨基酸的制备，也 可以用于D—氨基酸中L一掺杂物的清除。(2)本发明方法不经衍生步骤，可 直接将消旋体中L-型氨基酸选择性地转化，留下未反应的高纯度的D-氨基酸。
(3)本发明方法无需传统方法中常用的先保护、再去保护的步骤，路线简短， 效率高，可控制产物的对映体纯度。(4)本发明方法也可用于其他类D型非蛋 白氨基酸的制备。(5)本发明方法，制备过程不用金属催化剂、有机溶剂及助 剂，反应在中性条件进行，除生物质外，无化学排放，属绿色环保生产过程。
(6)本发明方法设计合理，步骤简单。
图1为色氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。 图2为苯丙氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。 图3为酪氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。 图4为色氨酸和苯丙氨酸混合物转化不同时间下反应混合物的色谱图。 图5为色氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。 图6为苯丙氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。 图7色氨酸和苯丙氨酸生物转化不同时间下反应混合物的色谱图。
具体实施例方式
本发明结合附图和实施例作进一步的说明。 实施例1 D-色氨酸和吲哚乙酸的制备
在5 0 0 mL摇瓶中(在2 8瓶中同时进行)，培养酵母菌Rhodotorula graminis (ATCC 20804)(牧草红酵母)，生长2 4小时后，离心，倾出清液，冷 冻，超声破壁，制成匀浆，置回摇瓶中，每瓶中加入相同量消旋体D,L-色氨酸 5 0mg;调解pH7.3，通空气，透气封口，放回在控温摇床中，圆周式摇
动，在反应0小时，6小时和12小时阶段性取出一毫升样品进行分析，追踪 反应进程，超滤、稀释，注入HPLC进行追踪分析，用大赛路冠醚色谱柱， Crownpak CR(+), D-Try, t产22min， L-Try， tr^30min.分析时间延长到1 2 0分 钟。结果参见图l，显示色氨酸生物转化过程中各物质量的变化过程，其中图A:转化反应开始时t-0: L/D=l/1; B:转化反应6小时后t=6: L/D=l/3;C:转化反应12小时t-12: L=0 (L-消耗光只剩D)，产物吲哚乙酸随时间增 加而增加。L-Try (tr=28-31min)逐渐消耗光，只剩下D-型(tr^22-24min)和 产物卩引哚乙酸(tr=60-65min)。同上，在2 8瓶中同时进行，阶段性取出一毫升样品进行分析，追踪反应 进程，用大赛路冠醚色谱柱，Crownpak CR(+), D-Try， tr=20-23min, L-Try, tr=28-31min.分析时间延长到9 0分钟。L-Try消耗光时，停止反应，用离子交 换树脂分的产物，用核磁共振、质谱分析、鉴定确认为产物为吲哚乙酸。实施例2 D-苯丙氨酸的制备在5 0 0 mL摇瓶中，培养酵母菌Rhodotorulagraminis(ATCC 20804)(牧 草红酵母)，生长2 4小时后，离心，倾出清液，冷冻，超声破壁，制成匀浆， 均分后置回摇瓶中，每瓶中加入相同量消旋体D， L-苯丙氨酸5 Omg;调p H7. 3，通空气，放回在控温摇床中，圆周式摇动，阶段性取出一毫升样品 进行分析，追踪反应进程，在反应4 h， 6 h和4 0 h，超滤、稀释，注入H PLC进行追踪分析，用大赛路冠醚色谱柱，Crownpak CR(+)， D-Phe, tr=7.5min, L-Phe,tr=llmin.分析时间延长到6 0分钟。未发现其它可检测的产物。用离子 交换树脂分离，得到纯的D-苯丙氨酸(D-Phe)。参见图2，是苯丙氨酸生物转化过程中各物质量的变化过程(为清晰起见， 每图均为一个单独的色谱图)，说明产物随时间增加而增加。图中.，A为反应 开始时L/D-l/l; B为反应2小时L/D = 2/5; C为反应4小时，L接近0 (L-消耗光只剩D)。 L-Phe (tr^l4.5min)。逐渐消耗光，只剩下D-型(tr=7-9min)。本研究发现酵母菌，可以将消旋体中的L-Phe转化为未知产物，保留了对 映体纯的D-Phe。成为一个在同时制备这消旋体L， D-Phe中或者含L-Phe的 混合物中，选择性清除L-Phe保留纯D-Phe的生物转化方法。实施例3 D-酪氨酸的制备在5 0 OmL摇瓶中，培养酵母菌(牧草红酵母)Rhodotorula graminis
(ATCC 20804)，生长2 4小时后，离心，倾出清液，冷冻，超声破壁，制成匀 浆，置回摇瓶中，加入消旋体D， L-酪氨酸5 0mg;调pH7.3，通空气， 放回在控温摇床中，圆周式摇动，阶段性取出一毫升样品进行分析，追踪反应 进程，在反应4 h ， 6 h和4 0 h ，超滤、稀释，注入H P L C进行追踪分析， 用大赛路冠醚色谱柱，Crownpak CR(+), D-Tyr， t产6min， L-Tyr, tr=9min.分析时 间延长到6 0分钟。用离子交换树脂分离，得到纯的D-酪氨酸(D-Tyr)。
参见图3，是酪氨酸生物转化过程中各物质量的变化过程。说明产物随时 间增加而增加。图中A为反应10分钟，(t-10分钟)L/D = 2/5; B为反应 4小时(1=4小时)，L接近O (L-消耗光只剩D)。 L-Tyr (tr^9min)逐渐消耗 光，只剩下D-型(tr=6min)。
本研究发现酵母菌，可以将消旋体中的L-Tyr转化为未知产物，保留了对 映体纯的D-Tyr。 成为一个在同时制备这消旋体L， D-Tyr中或者含L-Phe的 混合物中，选择性清除L-Tyr保留纯D-Tyr的生物转化方法。
实施例4D -色氨酸和D -苯丙氨酸混合物的制备。
5 0 OmL摇瓶中，培养酵母菌Rhodotorulagraminis(ATCC 20804)，生长 2 4小时后，离心，倾出清液，冷冻，超声破壁，制成匀浆，均分后置回摇瓶 中，每瓶中加入相同量消旋体D， L-色氨酸和D，L-苯丙氨酸(各5 Omg); 调pH7.3，通空气，放回在控温摇床中，圆周式摇动，阶段性取出一毫升样 品进行分析，追踪反应进程，在反应4 h， 6 h和4 0 h，超滤、稀释，注入 H P L C进行追踪分析，用大赛路冠醚色谱柱，Crownpak CR(+), D-Phe, tr=9min， L-Phe， tr^l3min， D-Try， t产20min， L-Try， ti=30min分析时间延长到1 2 0分钟。
本研究发现酵母菌，可以将消旋体L， D-Phe和消旋体L， D-Try两个消旋 体混合物中L型转化掉，只保留了对映体两个纯的D-Phe和D-Try的混合物。 成为一个L-选择性清除法。
结果参见图4， A:转化反应开始时t=0:苯丙氨酸L/D =1/1;色氨酸 L/D=l/1; B: t-40时，L型苯丙及L-色氨酸大部分消耗光，只剩D-苯丙氨酸 及D-色氨酸。
实施例5 D-色氨酸和吲哚乙酸的制备
本实施例是用活细胞为催化剂，在5 0 OmL摇瓶中(在2 8瓶中同时进 行)，培养酵母菌Rhodotorulagraminis(ATCC 20804)(牧草红酵母)，生长2 4 小时后，离心，倾出清液，置回摇瓶中，其余过程同实施例l。图5-图7结果参见图5，显示色氨酸生物转化过程中各物质量的变化过程，其中A: 转化反应开始时"=0时)混合物的色谱图，反应开始时L/D=l/1; B:转化 反应21小时L=0 (L-消耗光只剩D)，说明产物随时间增加而增加。L-Try (tr=28-31min)逐渐消耗光，只剩下D-型(tr=22-24min)和产物卩引哚乙酸(此 图中未显示t产60-65min )。实施例6 D-苯丙氨酸的制备(本实施例是用活细胞为催化剂) 同实施例2，细胞洗涤后直接放回摇瓶，加底物消旋体D， L-苯丙氨酸， 其余过程同实施例2。结果参见图6，苯丙氨酸生物转化过程中各物质量的变化过程(为清晰起 见，每图均为一个单独的色谱图)，说明产物随时间增加而增加。图中A反 应2小时L/D = 2/5; B反应5小时，L接近0 (L-消耗光只剩D)。 L-Phe (tr=14.5min)逐渐消耗光，只剩下D-型(tr=7-9min)实施例7 D-色氨酸和D-苯丙氨酸混合物的制备(本实施例是用活细胞 为催化剂)同实施例4，细胞经洗涤后，置回摇瓶，加底物消旋体D， L-色氨酸和 D,L-苯丙氨酸，其余过程同实施例4。结果参见图7， A为转化反应刚开始时(t=10分钟)；B为转化反应6小时 (1=640时)，反应21小时时，L型苯丙及L-色氨酸大部分消耗光，只剩D-苯 丙氨酸及D-色氨酸。活细胞试验中，反应速度较匀浆为快。本方法中，整个转化过程和产物的分离过程中不用有机试剂，是一个绿色 环保的过程。本发明选用的酵母菌Rhodotorulagraminis(ATCC 20804)，是经筛 选后选择的最佳菌株。本研究发现一个具有L-Try IAA代谢途径的酵母菌，它可以将消旋体中的 L-Try转化为IAA，保留D-Try。 D-Try和IAA性能差异很大，易于分离，因 而成为一个同时制备这两个化合物的生物转化方法。本方法已成功用于D-色氨 酸，D-苯丙氨酸以及D-酪氨酸的制备，但方法不限于本实施例所列氨基酸。 本发明方法已用于消旋体色氨酸及苯丙氨酸混合物中L-型对应体&清除，但方
法不限于这两种氨基酸的混合，应该适于更多不同种类的氨基酸及其可能构成 的各种可能混合物中L-型对映体的清除。
权利要求
1.一种D-氨基酸的生物催化制备方法，其特征是通过以下技术方案实现在500mL摇瓶中，培养牧草红酵母菌，生长24小时后，离心，倾出清液，冷冻，超声破壁，制成匀浆，置回摇瓶中，每瓶中加入相同量消旋体D，L-氨基酸50mg；调pH7.3，通空气，透气封口，放回在控温摇床中，圆周式摇动，反应时间4-40小时，超滤、稀释，注入HPLC进行追踪分析，用大赛路冠醚色谱柱分析，时间延长到120分钟，确定获得目的产物，本发明所用的酵母菌，通用编号为ATCC 20804，购自美国。
2. 根据权利要求1所述的D-氨基酸的生物催化制备方法，其特征是通过 以下技术方案实现培养牧草红酵母菌，生长2 4小时后，经离心，倾出清液， 直接将活细胞置回摇瓶中，进入下一步骤。
3. 根据权利要求1所述的D-氨基酸的生物催化制备方法，其特征是方 法中底物选用D,L-色氨酸，获得目的产物为D-色氨酸和产物H引哚乙酸。
4. 根据权利要求l所述的D-氨基酸的生物催化制备方法，其特征是方 法中底物选用D,L-苯丙氨酸，获得目的产物为D-苯丙氨酸。
5. 根据权利要求1所述的D-氨基酸的生物催化制备方法，其特征是方 法中底物选用D，L-酪氨酸，获得目的产物为D-酪氨酸。
全文摘要
本发明提供一种D-氨基酸的生物催化制备方法，将酵母菌(ATCC 20804)培养后离心，倾出清液，冷冻，超声破壁，制成匀浆，在通空气的条件下，选择性地氧化消旋体氨基酸中L-型，留下目的产物D-型氨基酸。本发明也可接用活细胞作为催化剂，用活细胞时，不需冷冻，超声破壁。本发明方法可用于D-型氨基酸的制备，也可以用于D-氨基酸中L-掺杂物的清除，还可用于其他类D型非蛋白氨基酸的制备。本发明方法无需采用传统方法中常用的先保护、再去保护的步骤，制备过程不用金属催化剂、有机溶剂及助剂，除生物质外，无化学排放，属绿色环保生产过程。本发明方法设计合理，制备路线简短，步骤简单，效率高。
文档编号C12R1/645GK101117640SQ200710070108
公开日2008年2月6日 申请日期2007年7月20日 优先权日2007年7月20日
发明者张子张, 张晔斌 申请人:浙江大学;杭州慧根药业有限公司