专利名称：：一种表达型前t载体及其制备与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种可用于快速克隆和表达目的基因PCR产物的一种表达型前T载体及其制备与应用。(二)背景^支术基因工程是将目的基因重组于表达载体中，并将重组表达载体转化至适当的宿主中，表达得到所需要的蛋白质，从而发挥效益。PCR技术是获得目的基因片段的最常用的方法，是分子生物学和基因工程研究中的一项基本技术，它被广泛用于体外扩增已知或未知的特异DNA片段。市场上已经有用于PCR产物快速克隆的T载体，如pUCm-T载体，本发明申请人林陈水等申请了一种用于克隆目的PCR产物的前T载体及其制备方法。因为对PCR产物进行快速有效的克隆是开展杂交分析、高质量测序及从复杂PCR产物中分离目的片段等下游实验，实现PCR产物多种用途的必经之路。T-载体是一种用于直接克隆PCR产物的载体，一般为线性，其分子末端各有一个3'dT(脱氧胸苷)突出。利用ragDNA聚合酶的末端转移酶活性，在扩增DNA的3'末端非模板依赖地加上一个核苷酸，通常为脱氧腺苷酸(dA)。这个3'dA突出端被用于把PCR产物插入到插入位点有一个3'dT突出的T-载体上。这样就将PCR产物以粘性末端连接的方式直接克隆到载体上。这种方式不仅克服了常规克隆方法的缺点，而且操作简便、方法快捷、连接效率高，因而其应用范围非常广泛。但是目前市场上供应的T载体均为克隆型T载体，即T载体用于克隆目的基因的PCR产物，仅仅满足基因保存和测序的需要。即使有使目的基因表达的T载体，其表达产物与目标产物不一致，N端会多出几个氨基酸。若要使目的基因表达为目标蛋白质，还需要将目的DNA片段重新重组至表达载体中，这个过程较为复杂。需要将目的DNA片段从载体中酶切或用PCR技术扩增出来，酶切后纯化，与经限制性内切酶酶切的载体定向连接，转化表达宿主，方可使目的基因表达。虽然现代分子生物学技术的发展使这些操作没有技术上的难题，但是重新重组涉及酶切、纯化、PCR等工序，耗时、耗材、耗人力。如果能将PCR产物直接与载体连接，转化表达宿主，可以省略复杂的重组工序，快速得到目的基因的工程菌。众所周知，要使一段目的基因得到表达，目的基因的上游需要有一段启动子序列，RNA聚合酶识别和结合，促进转录的起始，目的基因下游最好有一段终止子序列，及时终止转录。在翻译起始密码子上游需要有一段富含噪呤的SD序列(如GAAGGA)，使核糖体结合于信使RNA上，使得翻译起始。SD序列与翻译起始密码子之间的距离为5-13bp，距离过短与过长都将影响翻译的效率，导致表达量下降。因此，要使目的基因的PCR的产物在克隆的同时实现表达，要求比克隆高的多，在载体上需要启动子、终止子、核糖体结合位点等部件，还要求PCR产物与载体按照一定方向连接。目的基因的开放性阅读刚好位于核糖体结合位点的下游，而且距离适当。经典的T-载体的构建方法有两种(1)将载体通过Sw"E或￡coRV等平端内切酶线性化切出平端，在缺乏dATP及存在过量dTTP情况下，用％《DNA聚合酶催化，在3'末端加上dT,回收后即得到T-载体。该方法对反应条件要求严格，平末端加dT的效率达不到100%，因为反应是一个动态过程，％《酶的工作效率随反应体系中越来越多的T末端产生而P争低，这就导致少量两端均未加T的平端线性化质粒的存在，在与PCR产物连接过程中难以避免载体自身环化，且经过两次回收的过程较繁瑣；每次生产T-载体产量有限(一般为lpg),不适于大规模生产，且dT碱基不太稳定，故批次质量不稳定，如果其贝i存时间较长或多次冻融反复使用，克隆效率会大大降低。如蓝白斑筛选时，即4吏有大量白色菌落出现，其中很多都是假阳性。这样制作T-载体只是为维护商业利益有意回避他人复制。(2)用脱氧核苷酸末端转移酶(TDT)在线性化载体的3，末端加上双脱氧胸腺嘧咬核苷酸(ddTTP)。这种方法存在明显缺点一是同样不能保证100%的载体分子末端都能加上dT,二是难以控制加上去的正好是l个dT。利用限制性内切酶制备T-载体是T-载体制备方法中最为先进的方式，国内外的一些学者都进行了尝试，并建立了相应的T-载体。在内切酶家族中，有一类称可变酶，它们的识别序列中的一个或几个核苷酸是可变的。经查NewEnglandBiolabs公司的目录，符合上述特征的酶列于表1:表1可用于生产T-载体的限制性内切酶(NEB)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>国内也有较多的文章报道T载体的构建及其应用。酶法制备T载体首先要得到一个环状的前T质粒载体，经Xcwl酶切两个位点后，载体的大片段DNA线性化，而且两个3'末端均带dT，从而得到可用于PCR产物快速克隆的T载体，如市场上供应pUCm-T载体。用酶法制备T载体有可能存在以下几个方面的问题一，如果酶切质粒DNA质量不高，外源基因不能插入载体中，而载体转化感受态细胞后能够在抗性平板上生长。pUC18载体设计了蓝白斑筛选方案以筛选目的DNA片段是否插入载体，如果插入载体，编码半乳糖苷酶多肽的基因LacZ被插入失活，细胞内没有半乳糖苷酶活性，在含有生色底物X-gal的篩选平板中白色菌落为插入失活阳性克隆，而兰色菌落为不含外源基因的阴性克隆。这种方法需要使用价格昂贵的X-gal，制备蓝白斑筛选平板也比较麻烦。二，如果两个ZcmI酶切位点空间位置较近，将影响载体的酶切效率，即使载体DNA的纯度很高，酶的质量也4艮好，也会出现仅一个酶切位点被酶切的情况，这种线性的载体不能和PCR产物连接，而是载体自连，从而导致阴性克隆的产生。
发明内容本发明既是为了提供一种可用于快速克隆和表达目的基因PCR产物的一种表达型前T载体，及其制备与应用。为达到发明目的本发明采用的技术方案是一种表达型前T栽体，由以下方法制备得到(l)通过PCR扩增得到含有色氨酸酶启动子和核糖体结合位点的DNA片段1;(2)以含有氨苄青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒为模板进行PCR扩增，在引物的5'末端引入Zc附I酶切位点，扩增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表达调控序列、两端含有Xcml酶切位点的DNA片段2;(3)利用重叠延伸拼接技术，将步骤(1)得到的DNA片段l和步骤(2)得到的DNA片段2进行拼接；(4)将步骤(3)所得拼接产物克隆至pUCmT载体中，筛选正向连接的克隆，即得所述表达型前T载体。本发明通过PCR技术扩增得到含有色氨酸酶启动子和核糖体结合位点的DNA片段，以pET28等含有氨节青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒为模板，扩增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表达调控序列的DNA片段，引物设计时在引物的5'末段引入；fcwl酶切位点，使该DNA片段两端含有ZcwI酶切位点，得到ZcwI酶切盒。利用重叠延伸拼接(SplicingbyOverlapExtension,SOE)技术，将上述两个DNA片段用％《plusDNApolymerase拼接，将PCR产物克隆至pUCm-T载体中，筛选正向连接的克隆，即可得到表达型前T载体。所述表达型前T载体图i普如图1所示。本发明还涉及所述的表达型前T载体的制备方法，所述方法按如下步骤进行(1)通过PCR扩增得到含有色氨酸酶启动子和核糖体结合位点的DNA片段l;(2)以含有氨节青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒为才莫板进行PCR扩增，在引物的5，末端引入ZcwI酶切位点，扩增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表达调控序列、两端含有XcmI酶切位点的DNA片段2;(3)利用重叠延伸拼接技术，将步骤(1)得到的DNA片段1和步骤(2)得到的DNA片段2进行拼接；(4)将步骤(3)所得拼接产物克隆至pUCm-T载体中，筛选正向连接的克隆，即得所述表达型前T载体。优选的，所述步骤(1)以大肠杆菌K-12细胞为模板DNA进行PCR扩增，引物序列为MK1:5'-TATGGATCCTGCTCCCCGAACGATTGTGA誦3，；MK2:5，-TAGTTAGGCCCATTATACCCTTGGTCCTTCATTTATTTTAATTACAGTGA-3，，PCR反应条件94。C预变性3min，进入PCR循环94°C变性0.5min,57。C退火0.5min，72。C延伸2min，4个循环；再94。C变性0.5min,65。C退火0.5min，72。C延伸2min，26个循环；最后72。C延伸10min。所述步骤(2)引物DNA片段的两端各设计一个Xcml酶切位点CCANNNNN*NNNNTGG，上游的Zcml酶切序列的NH殳计为T，下游的Xcwl酶切序列的N4殳计为A。所述步骤(2)以质粒pET28或pET39为模板DNA进行PCR扩增，引物序列为Ph5，-GAAGGACCAAGGGTATAATGG|GCCTAACTA|CGGCTACACTA-3，；P2:5，-CTCAAGCTTCCAAGGGTATAATGGACCCCTATTTGTTTATTTTT-3，；PCR反应条件94。C预变性3min，进入PCR循环，94。C变性0.5min，45。C退火0.5min，72。C延伸2min，进行4个循环，72。C延伸10min;再94。C变性0.5min，65。C退火0.5min,72。C延伸1min,26个循环；最后72。C延伸10min。所述步骤(3)中引物序列为MK1:5'-TATGGATCCTGCTCCCCGAACGATTGTGA國3，；P2:曙CTCAAGCTTCCAAGGGTATAATGGACCCCTATTTGTTTATTTTT-3，；基因拼接反应条件94。C预变性3min,进入循环，94°C变性0.5min,58。C退火0.5min，72'C延伸2min，进4亍30个循环；72。C终期延伸10min。优选的，所述步骤(2)中的抗生素的抗性基因为下列之一卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因或氯霉素抗性基因。本发明还涉及所述的表达型前T载体在制备表达型T载体中的应用。利用常规质粒抽提技术得到表达型前T载体的DNA，用限制性内切酶Xcml酶切后，1°/。琼脂糖电泳分离两个片段，切胶回收大片段DNA，为表达型T载体，可用于目的基因的PCR产物克隆以及表达。将目的基因的开放性阅读框架通过PCR技术扩增，取少量PCR产物与表达型T载体DNA直接连接，连接产物转化表达宿主。通过简单的筛选即可实现目的基因的直接表达。具体的，所述表达型T载体制备方法如下抽提前T载体的DNA,用限制性内切酶ZcmI酶切后，0.8。/。1。/o琼脂糖电泳分离载体DNA片段和含有卡那抗性基因的DNA片段，回收大片段DNA，即为表达型T载体。本发明的有益效果主要体现在一步法使目的基因克隆并得到表达，省略复杂的重组过程；在构建过程中无需对PCR产物进行纯化、酶切，前T载体用单酶切即可得到线性化的T载体，酶切效率高，无需使用其他限制性内切酶参与；目的基因无需使用价格昂贵的IPTG诱导，可以低成本地进行大规模工程菌发酵；可在目的基因得到表达后再进行测序鉴定，将表达结果符合期望的转化子送DNA测序公司测序可以提高测序成功率，节约经费。(四)图1为本发明所述前T载体图谱。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此(实施例中所有试剂、质粒、酶、引物等，均购自上海生工生物工程技术服务有限公司)实施例1:含色氨酸酶启动子的DNA序列扩增引物MK1:5，-TATGGATCCTGCTCCCCGAACGATTGTGA-3'MK2:5，-TAGTTAGGCCCATTATACCCTTGGTCCTTCATTTATTTTAATTACAGTGA-3，(修改后的MK2)模板DNA:大肠杆菌K-12细胞PCR反应体系及其参数10xBuffer(withMg2+)5pL10mmol/LeachdNTPs2jjL1Ommol/LMK12pL10腿ol/L區22|iL大肠杆菌K-12细胞牙签蘸取，DNA聚合酶0.5jaL无菌双蒸水补足至50[iL94。C预变性3min，进入PCR循环94"C变性0.5min,57'C退火0.5min，72。C延伸2min，4个循环；再94。C变性0.5min，65。C退火0.5min,72。C延伸2min,26个循环；最后72。C延伸10min。取部分PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，其余产物标记后置-20。C保存。实施例2:Icml酶切盒的构建:引物Pl(正向)5，-GAAGGACCAAGGGTATAATGG|GCCTAACTA|CGGCTACACTA國3，P2(反向)5，-CTCAAGCTTCCAAGGGTATAATGGACCCCTATTTGTTTATTTTT-3，模板DNA:pET28(或pET39等含有卡那霉素抗性基因的质粒或衍生质粒也可)。PCR反应体系及其参数10xBuffer(wWiMg2+)10mmol/LeachdNTPs10mmol/LMK310mmol/LMK4质粒(500倍稀释)P/mDNA聚合酶无菌双蒸水52fiL2jiL0.5pL补足至5094匸预变性3min，进入PCR循环，94。C变性0.5min，45。C退火0.5min,72。C延伸2min,进行4个循环，72。C延伸10min;再94。C变性0.5min，65。C退火0.5min，72。C延伸1min,26个循环；最后72。C延伸10min。取部分PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，其余产物标记后置-20匸保存。实施例3:基因拼接引物MK1:5，-TATGGATCCTGCTCCCCGAACGATTGTGA-3'P2(反向)5，-CTCAAGCTTCCAAGGGTATAATGGACCCCTATTTGTTTATTTTT-3'模板DNA:实施例1和实施例2所得到的PCR产物(经3SDNAGelPurificationKit纯^:回>)欠)拼接反应体系及其参数实施例1及实施例2产物各110mmol/LeachdNTPs4jiL1Ommol/LMK1410mmol/LMK44piLlOxBuffer(w池Mg2+)10TyphisDNA聚合酶1无菌双蒸水补足至94匸预变性3min,进入循环，94。C变性0.5min，58。C退火0.5min，72。C延伸2min,进行30个循环；72。C终期延伸10min。得到的拼接产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，剩余产物标记后置-20t:水拒保存。实施例4:表达型前T载体的构建将实施例3所得到的拼接产物即Xcml酶切盒与pUC18载体用T4DNAligase在4。C水箱中连接16h。连接产物用CaCl2法转化克隆宿主co//DH5a。在含100(ig/mL卡那霉素的固体LB平板中挑选阳性转化子，送上海生工生物工程技术服务有限公司测序证实，测序引物为T7promoterprimer#69348-3。用SDS碱裂法抽提经测序证实的阳性转化子，所得质粒即为表达型前T载体。置-20x:冰拒保存。实施例5:线性化表达型T载体的制备将表达型前T载体用Icml限制性内切酶在37°C下酶切2h，再进行1%琼脂糖凝胶电泳分析。结果可见两条明显的亮带，切取大片段，用3SDNAGelPurificationKit纯化回收，即得到线性化表达型T载体。置-20°C水柜保存。实施例6:目的基因的克隆以及表达型重组转化子的筛选目的基因的克隆选取两种酶基因，即天冬氨酸酶基因(aspartase,aspA)和碱性磷酸酶基因(alkalinephosphatase,phoA)进行克隆实验。从GeneBank中查询得到两种酶基因序列，用DNASIS软件设计两对引物aspl:5'-ATGTCAAACAACATTCGTATCGA-3';asp2:5'-ACGATTACTGTTCGCTTTCATCA-3';pho1:5'-ATGAAACAAAGCACTATTGCACT國3';pho2:5'-GGTTTTATTTCAGCCCCAGA-3';check:5'画CCTTTCGGGCTTTGTTAGCA-3'。分别以K-12细胞为模板用％gplus聚合酶扩增得到两种酶基因片段，1%琼脂糖凝胶电泳检测，条带明亮锐利。将两种PCR产物直接与实施例5所得到的线性化T载体用用T4DNAligase在4。C水箱中连接16h,连接产物用CaCl2法转化五.co"DH5a。表达型重组转化子的筛选首先，将连接产物的转化液在含100|ig/mL氨苄霉素的LB固体平板均匀铺开，35。C恒温箱培养1620h。选取能正常生长的菌落。这一步可以将不含有重组质粒的宿主菌筛掉，称为正向筛选。接着，将在氨节霉素抗性LB固体平板上正常生长的菌落影印到含100ng/mL卡那霉素LB固体平板上。30。C恒温箱培养1620h。在氨爷霉素抗性平板上挑选相应的不能在卡那霉素抗性平板上生长的克隆。这一步可以将未酶切和只有一个位点酶切的重组质粒筛掉，称为反向筛选。最后，将筛选到的克隆，用单菌落PCR法，以各酶基因的上游引物和鉴定引物check用PCR进行鉴定，这一步可以消除平板上残余的未转入宿主细胞的重组质粒的影响并能确定目的基因的插入方向，称为正向筛选。其体系和参数分别为10xBuffer(withMg2+)5pL10mmol/LeachdNTPs2jaL10mmolasp1/pho12j_iL10mmol/LLcheck2相应阳性单克隆无菌牙签蘸取T"gDNA聚合酶0.5无菌双蒸水补足至50pL94"C预变性3min，进入PCR循环94。C变性0.5min，45。C(aspl、phol都为55°C)退火0.5min,72。C延伸2min，30个循环，最后72。C延伸10min。取部分PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测并摄片。经check引物鉴定为阳性的克隆送英俊生物技术有限公司测序证实，测序引物为T7promoterprimer#69348-3。实施例7:目的基因的表达两种酶基因工程菌分别接种于3mL含50pg/mL氨节霉素的LB培养中，37。C培养过夜，次日按1°/。分别转接于含50pg/mL氨节霉素的LB(含2%葡萄糖)培养基和色氨酸培养基中，30。C培养3h，LB培养基加入0.5mmol/L的IPTG,诱导3h,离心收集菌体，用SDS-PAGE(r=15%，03%)进行分析。aspA长1441bp、phoA长1420bp,其表达产物的表观分子量都在52kD左右。酶基因工程菌在添加了色氨酸的M9培养基中能稳定地表达酶蛋白，SDS-PAGE分析其表观分子量都在52kD左右，与理论计算值相符。权利要求1.一种表达型前T载体，由以下方法制备得到(1)通过PCR扩增得到含有色氨酸酶启动子和核糖体结合位点的DNA片段1；(2)以含有氨苄青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒为模板进行PCR扩增，在引物的5’末端引入XcmI酶切位点，扩增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表达调控序列、两端含有XcmI酶切位点的DNA片段2；(3)利用重叠延伸拼接技术，将步骤(1)得到的DNA片段1和步骤(2)得到的DNA片段2进行拼接；(4)将步骤(3)所得拼接产物克隆至pUCmT载体中，筛选正向连接的克隆，即得所述表达型前T载体。2.如权利要求1所述的表达型前T载体，其特征在于所述表达型前T载体图谱如图1所示。3.制备如权利要求1或2所述的表达型前T载体的方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行(1)通过PCR扩增得到含有色氨酸酶启动子和核糖体结合位点的DNA片段1;(2)以含有氨节青霉素除外的大肠杆菌敏感的抗生素的抗性基因的质粒为模板进行PCR扩增，在引物的5'末端引入XcmI酶切位点，扩增得到含有所述抗生素的抗性基因及其上下游表达调控序列、两端含有Xcml酶切位点的DNA片段2;(3)利用重叠延伸拼接技术，将步骤(1)得到的DNA片段1和步骤(2)得到的DNA片段2进行拼接；(4)将步骤(3)所得拼接产物通过5歸ffl和/^"dlII克隆至pUC18载体中，筛选阳性克隆，即得所述表达型前T载体。4.如权利要求3所述的表达型前T载体的制备方法，其特征在于所述步骤(1)以大肠杆菌K-12细胞为模板DNA进行PCR扩增，引物序列为MK1:5，-TATGGATCCTGCTCCCCGAACGATTGTGA-3，；MK2:5，國TAGTTAGGCCCATTATACCCTTGGTCCTTCATTTATTTTAATTACAGTGA-3'，PCR反应条件94。C预变性3min,进入PCR循环94。C变性0.5min，57。C退火0.5min,72。C延伸2min，3个4盾环；再94。C变性0.5min,65。C退火0.5min，72。C延伸2min,26个循环；最后72。C延伸10min。5.如权利要求3所述的表达型前T载体的制备方法，其特征在于所述步骤(2)引物DNA片段的两端各设计一个Zcml酶切位点CCANNNNN*NNNNTGG,上游的酶切序列的N^殳计为T，下游的Zcml酶切序列的N4殳计为A。6.如权利要求5所述的表达型前T载体的制备方法，其特征在于所述步骤(2)以质粒pET28或pET39为模板DNA进行PCR扩增，引物序列为Pl:5'-GAAGGACCAAGGGTATAATGGGCCTAACTACGGCTACACTA-3,;P2:5，-CTCAAGCTTCCAAGGGTATAATGGACCCCTATTTGTTTATTTTT-3，；PCR反应条件94。C预变性3min，进入PCR循环，94。C变性0.5min，45。C退火0.5min，72。C延伸2min,进行4个循环，72。C延伸10min;再94。C变性0.5min，65。C退火0.5min，72。C延伸1min，26个循环；最后72。C延伸10min。7.如权利要求3所述的表达型前T载体的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中引物序列为MK1:5'-TATGGATCCTGCTCCCCGAACGATTGTGA-3,;P2:5'醫CTCAAGCTTCCAAGGGTATAATGGACCCCTATTTGTTTATTTTT-3，；基因拼接反应条件94。C预变性3min，进入循环，94。C变性0.5min,58。C退火0.5min,72"C延伸2min，进行30个循环；72。C终期延伸10min。8.如权利要求3所述的表达型前T载体的制备方法，其特征在于所述步骤(2)中的抗生素的抗性基因为下列之一卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因或氯霉素抗性基因。9.如权利要求1或2所述的表达型前T载体在制备表达型T载体中的应用。10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述表达型T载体制备方法如下抽提前T载体的DNA，用限制性内切酶Zcml酶切后，0.8%1°/。琼脂糖电泳分离载体DM片段和含有卡那抗性基因的DNA片段，回收大片段DNA，即为表达型T载体。全文摘要本发明提供了一种可用于快速克隆和表达目的基因PCR产物的一种表达型前T载体，及其制备与应用。本发明的有益效果主要体现在一步法使目的基因克隆并得到表达，省略复杂的重组过程；在构建过程中无需对PCR产物进行纯化、酶切，前T载体用XcmI单酶切即可得到线性化的T载体，酶切效率高，无需使用其他限制性内切酶参与；目的基因无需使用价格昂贵的IPTG诱导，可以低成本地进行大规模工程菌发酵；可在目的基因得到表达后再进行测序鉴定，将表达结果符合期望的转化子送DNA测序公司测序可以提高测序成功率，节约经费。文档编号C12N15/63GK101333537SQ20071006981公开日2008年12月31日申请日期2007年6月29日优先权日2007年6月29日发明者于真真,任慧颖,杨丹燕,林陈水,明许申请人:浙江工业大学