专利名称：：一种地衣芽孢杆菌纤溶酶及其生产方法
技术领域：
：本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种地衣芽孢杆菌纤溶酶及其生产方法。
背景技术：
：血栓栓塞性疾病是一类严重危害人类健康的心血管疾病，发病率呈上升趋势。目前治疗血栓栓塞性疾病的最为有效并且可靠的手段是采用纤维蛋白溶解酶或其激活剂进行的溶栓疗法。溶栓药物或通过激活纤维蛋白溶解酶原转化成纤维蛋白溶解酶，后者催化血栓的主要基质纤维蛋白水解，使血栓溶解，血管再通达到溶栓的目的；或者直接溶解血栓中的纤维蛋白，使血栓溶解。溶栓酶可来源于人体[如尿激酶(UK)、组织纤溶酶原激活剂(t-PA)等]、动物(如腹蛇抗栓酶、月激酶等)、微生物等。第一代溶栓剂链激酶(SK)和尿激酶(UK)缺乏纤维蛋白选择性，不仅能激活血栓表面的纤溶酶原，也能激活血浆中游离的纤溶酶原，使得纤维蛋白原降解，会产生全身性出血的副作用。而且SK具有免疫原性会产生过敏反应。第二代溶栓剂组织型纤溶酶原激活剂(tPA)和尿激酶原(proUK)等较第一代溶栓剂对纤维蛋白亲和性有所提高，但半衰期短、用药剂量大、价格昂贵，且口服仍会引起内出血的副作用。自从1987年日本学者须见洋行从日本传统发酵食品纳豆中提取出一种具有纤溶性质的酶一一纳豆激酶(NK)以后，通过微生物发酵方式生产纤溶酶引起了研究者们极大的兴趣。微生物的生长速度快，生长条件易于控制，因而可以通itA工控制发酵条件来获得大量的目的产物。现在世界各国的发酵工业都比较发达，发酵产物的提取工艺也比较完善。因此，对由微生物所分泌的纤溶酶类的研究将会为临床所大量使用这类溶栓药物提供广阔的前景。微生物是溶栓药物的重要来源，现已成功筛选到许多产生纤溶活性物质的菌抹，如芽孢杆菌(万ac/〃w手)CKll-4、曲霉菌U^m7/ww;^mW/)和旋孢霉菌(CocW/o6o/ws/w""ms)等均能产生纤溶酶。因此开展高产纤溶酶的新菌种筛选与发酵生产和酶的分离提取是解决溶纤酶理论研究和应用的前提。目前主要利用微生物生产纤溶酶，但是现有的纤溶酶产生菌存在着产酶水平普遍偏低、酶学性质缺陷和安全性等问题。因此探索其它新型、安全的纤溶酶产生菌或改造已有的微生物纤溶酶显得很有必要，具有极大的研究和开发价值。
发明内容本发明提供一种地衣芽孢杆菌纤溶酶及其生产方法。本申请人在申请号为200510060829.1、申请时间为2005年9月20日的发明专利申请"一种芽孢杆菌菌抹及其用途，，中公开了一种保藏号为CGMCC1397的地衣芽孢杆菌CSac/〃M//c/2ew/om^)的菌株ZJUEL31410。研究发现该菌抹既可以在葡萄糖、酵母膏合成培养基上生长，也可以在以麸皮和酵母膏、大豆浸出汁的粗培养基上生长产酶，此时主要代谢产物为纤溶酶，即地衣芽孢杆菌纤溶酶。一种地衣芽孢杆菌纤溶酶，通过如下方法制得将菌种地衣芽孢杆菌(5ac/〃us//c/^m/onw》ZJUEL31410CGMCC1397进行发酵培养得到发酵液，从发酵液中分离纯化得到地衣芽孢杆菌纤溶酶。所述的发酵培养前菌种采用LB培养基斜面保存，并在37。C预培养24小时。预培养后将菌种转移到发酵培养基中进行培养。所述的发酵培养采用液体发酵培养基，以重量百分比计，含有如下组份葡萄糖或麸皮1%~4%酵母膏1%~3%豆汁8%~12%CaCL20%~0.1%KH2P040.5%~1%K2HP040.1%~0.7%MgS040%~0.6%余量为水；所述的豆汁制备方法1重量份黄豆在9重量份水中浸泡24h，文火煮沸30min，过滤取汁。所述的发酵培养接种量为1%，发酵温度37。C,摇床转速为120-140r/min，培养38~72小时。从发酵液中分离纯化得到地衣芽孢杆菌纤溶酶过程分为酶的粗提纯和酶的精提纯。酶的粗提纯将发酵液经过高速冷冻离心后去除菌体得到上清液，上清液经凝胶柱SephadexG-50脱色后进行分段盐析，将第二次盐析获得的沉淀物采用pH8的巴比妥緩沖液(巴比妥緩沖液的体积为上清液体积的的1/10-1/20)的溶解得到粗酶液。所述的分段盐析分为两次，分别采用质量百分比浓度为40%和70%的硫酸胺溶液进行盐析。所述的高速冷冻离心的转速为12000r/min,离心温度为4°C。酶的精提纯将酶的粗提纯得到的粗酶液经过超滤(膜孔径0.05pmMasterflex,Cole-ParmerInstrumentCompany,USA)除去部分杂蛋白，随后滤液过DEAE-纤维素离子柱(高30cm,1.5cm),上样量控制在2ml,用0.02mol/LpH7.5和0.02mol/LpH8.0磷酸盐緩冲液线性梯度洗脱，洗脱流速5ml/5min,直至洗脱到检测出的蛋白质含量(OD280nm处检测值接近或等于零)很低或接近没有。采用分步收集器收集洗脱液，并测定收集管的蛋白质含量和酶活性，收集合并酶活较高的洗脱峰管(测定收集液的酶活和蛋白质含量，并确定酶活最大的峰点)。收集酶活在600-700IU/ml,其蛋白质含量在0.05mg/ml~0.5mg/ml的洗脱液。将洗脱液浓缩后冷冻干燥获得酶活性较高的地衣芽孢杆菌纤溶酶固体粉样品。洗脱液一般可浓缩10~20倍。将酶的粗提纯得到的粗酶液经过超滤后在过DEAE-纤维素离子柱之前，如果超滤的滤液浓度较稀，可以适当进行浓缩。一般浓缩1015倍，此时纤溶酶活比未浓缩前提高50~IOO倍。地衣芽孢杆菌纤溶酶酶活测定方法(纤维蛋白平板法)，操作如下(1)、制备纤维蛋白平4反取0.25g琼脂糖加入50ml生理盐水中，加热溶解后，置45。C水浴中保温30min后，加入200单位/ml的凝血酶1ml，混匀。取0.2g血纤维蛋白原，溶于50ml巴比妥緩沖溶液中，置45。C水浴中保温5min。分别取5ml凝血酶溶液与5m血纤维蛋白原溶液混合均匀后快速倒入(D9cm平皿中，水平放置30min后放入冰箱中密封备用。(2)、绘制尿激酶标准曲线将尿激酶标准(20,40,60,80,100,120，140，160IU/mL)各10pL点样于新配置的纤维蛋白平板上，放置10min,移入37'C培养箱，保温18h后取出。测定溶圏的垂直直径，计算各溶圈面积。并以溶圈面积为纵坐标，以标准酶活力为横坐标作图。(3)、粗酶酶活测定取10pL粗酶液点于纤维蛋白平板，于37。C保温10~18h，测定溶解圏的大小，计算其最小直径与最大直径之积。求出待测粗酶样品酶活，公式如下每毫升样品的酶活力(IU/mL)x每毫升标准尿激酶的酶力D-表示标准尿激酶溶纤圈的直径d-表示样品酶溶栓的直径采用上述纤维蛋白平板法考察标准尿激酶于不同反应时间下水解圈的变化，研究结果发现当反应时间在12小时前酶活反应速度最快，水解圏变化最为快速。而12小时后保温反应对酶活的变化没有太大影响，而且容易造成平板干燥。因此优选采用反应时间12小时来测定其水解圏的大小以确定酶活。本发明的地衣芽孢杆菌纤溶酶的分子量30kDa,等电点7.5，有直接溶解血栓和激活人纤溶酶原的双重作用。最适宜的作用温度和pH分别为37°C、8.5;酶在30。C-65。C间热稳定性良好，而在65。C以上酶活受到极大的影响；该酶在中性偏碱性的环境下稳定性很高，低浓度4丐离子、镁离子对于酶的稳、定4艮重要。本发明首次发现地衣芽孢杆菌(5a"7/ws//c/;em/om^)ZJUEL31410CGMCC1397能用于生产纤溶酶。生产的地衣芽孢杆菌纤溶酶产品以廉价的农副产品豆粕、膨化大豆和麸皮为主要原料，安全无毒，采用液体发酵方法生产，工艺流程短，成本低，工业化生产效率高，酶活高，具有开发价值。图1为地衣芽孢杆菌纤溶酶标准曲线；具体实施方式各实施例均采用地衣芽孢杆菌(5ac/〃ws//c/2em/0rm/力ZJUEL31410CGMCC1397作为原始菌种。实施例1培养基和培养方法菌种在LB培养基中斜面保存，首先将菌种在37。C培养24小时，再接种到液体发酵培养基上。液体发酵培养基含有葡萄糖2%，酵母膏2%，豆汁10%(制备方法10%黄豆浸泡24h，文火煮沸30min,取汁)，KH2P041%，K2HP040.5%，MgS040.45%,pH自然。接种量1%，发酵温度37。C，摇床转速为140r/min,培养38小时，获得的最大酶活为320IU/ml。酶的粗提纯将发酵液在转速为12000r/min，温度为4°C，进行高速冷冻离心去除菌体得到上清液，上清液经凝胶柱SephadexG-50脱色后分别采用质量百分比浓度为40%和70%的^<酸胺溶液进行分段盐析，将第二次盐析获得的沉淀物加入上清液体积1/10的pH8的巴比妥緩冲液溶解得到粗酶液。酶的精提纯将酶的粗提纯得到的粗酶液经过超滤(膜孔径0.05pm)除去部分杂蛋白，随后滤液过DEAE-纤维素离子柱(高30cm,1.5cm)，上样量控制在2ml，用0.02mol/LpH7.5和0.02mol/LpH8.0磷酸盐緩冲液线性梯度洗脱，洗脱流速5ml/5min,直至洗脱到检测出的蛋白质含量(OD280nm处检测值接近或等于零)很低或接近没有。收集酶活在600-700IU/ml,其蛋白质含量在0.05mg/ml-0.5mg/ml洗脱液浓缩IO倍后冷冻干燥，得到酶活性较高的地衣芽孢杆菌纤溶酶，该酶的比活力为32000IU/mg蛋白。实施例2菌种在LB培养基中斜面保存，首先将菌种在37'C培养24小时，再接种到液体发酵培养基上。液体发酵培养基含有麸皮2%，酵母膏2%,豆汁10%(制备方法10%黄豆浸泡24h，文火煮沸30min，过滤取汁)，KH2P041%，K2HP040.5%，MgSO40.45%,pH自然。接种量1。/。，发酵温度37。C,摇床转速为120r/min，培养72小时，获得的最大酶活为510IU/ml。按照实施例1中的酶的粗提纯和酶的精提纯方法，得到酶活性较高的地衣芽孢杆菌纤溶酶，经过SDS-PAGE分析，其分子大小为30KD;该酶的比活力为52000IU/mg蛋白。实施例3菌种在LB培养基中斜面保存，首先将菌种在37'C培养24小时，再接种到液体发酵培养基上。液体发酵培养基含有麸皮4%，酵母膏2%，豆汁10%(制备方法10%黄豆浸泡24h，文火煮沸30min，过滤取汁)，CaCL20.1%,KH2P041%，K2HPO40.5%,MgSO40.45%,pH自然。接种量1%,发酵温度37。C，摇床转速为140r/min,培养72小时，获得的最大酶活为590IU/ml。按照实施例1中的酶的粗提纯和酶的精提纯方法，得到酶活性较高的地衣芽孢杆菌纤溶酶，经过SDS-PAGE分析，其分子大小为30KD;最后冷冻干燥获得酶活较高的洗脱液样品。该酶的比活力为60000IU/mg蛋白。实施例4菌种在LB培养基中斜面保存，首先将菌种在37。C培养24小时，再接种到液体发酵培养基上。液体发酵培养基含有麸皮4%，酵母膏2%,豆汁10%(制备方法10%黄豆浸泡24h，文火煮沸30min，过滤取汁)，CaCL20.1%，KH2P041%，K2HPO40.5%，MgSO40.45%,pH7.5。接种量1%,发酵温度37。C,摇床转速为140r/min，培养72小时，获得的最大酶活为650IU/ml。按照实施例1中的酶的粗提纯和酶的精提纯方法，得到酶活性较高的地衣芽孢杆菌纤溶酶，经过SDS-PAGE分析，其分子大小为30KD;该酶的比活力为80000IU/mg蛋白。实施例5不同金属离子和蛋白酶抑制剂对纤溶酶稳定性的影响菌种在LB培养基中斜面保存，首先将菌种在37。C培养24小时，再接种到液体发酵培养基上。液体发酵培养基含有麸皮4%，酵母膏2%，豆汁10%(制备方法10%黄豆浸泡24h,文火煮沸30min，过滤取汁)，CaCL20.1°/。，KH2P041%，K2HPO40.5%，MgSO40.45%，pH7.5。接种量1%,发酵温度37。C，摇床转速为120r/min，培养72小时，获得的最大酶活为650IU/ml。按照实施例1中的酶的粗提纯和酶的精提纯方法，得到酶活性较高的地衣芽孢杆菌纤溶酶，经过SDS-PAGE分析，其分子大小为30KD;该酶的比活力为80000IU/mg蛋白。不同金属离子和蛋白酶抑制剂对酶活稳定性影响分别采用lmM表1中不同金属离子添加到反应体系(酶活测定反应体系)中37。C下保温1小时，测定残余酶活，其结果见表示l。表1不同金属离子和蛋白酶抑制剂对纤溶酶稳定性的影响<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>从表中可以看出，低浓度的钙离子和镁离子对该酶具有激活作用，而其他金属离子和蛋白酶抑制剂明显抑制纤溶酶活性。权利要求1、一种地衣芽孢杆菌纤溶酶的生产方法，其特征在于将菌种地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ZJUEL31410CGMCC1397进行发酵培养得到发酵液，从发酵液中分离纯化得到地衣芽孢杆菌纤溶酶；所述的发酵培养采用液体发酵培养基，以重量百分比计，含有如下组份葡萄糖或麸皮1％～4％酵母膏1％～3％豆汁8％～12％CaCL20％～0.1％KH2PO40.5％～1％K2HPO40.1％～0.7％MgSO40％～0.6％余量为水；所述的豆汁制备方法1重量份黄豆在9重量份水中浸泡24h，煮沸30min，取汁。2、如权利要求1所述的生产方法制备的地衣芽孢杆菌纤溶酶。3、如权利要求1所述的生产方法，其特征在于所述的发酵培养前菌种采用LB培养基斜面保存，并在37。C预培养24小时，预培养后将菌种转移到发酵培养基中进行培养。4、如权利要求1所述的生产方法，其特征在于所述的所述的发酵培养接种量为1%,发酵温度37°C,摇床转速为120~140r/min,培养38~72小时。5、如权利要求1所述的生产方法，其特征在于从发酵液中分离纯化得到地衣芽孢杆菌纤溶酶过程分为酶的粗提纯和酶的精提纯。酶的粗提纯将发酵液经过高速冷冻离心后去除菌体得到上清液，上清液经凝胶柱SephadexG-50脱色后进行分段盐析，将第二次盐析获得的沉淀物经过pH8的巴比妥緩沖液溶解得到粗酶液；酶的精提纯将酶的粗提纯得到的粗酶液经过超滤除去部分杂蛋白，随后滤液过DEAE-纤维素离子柱，用0.02mol/LpH7.5和0.02mol/LpH8.0磷酸盐緩冲液线性梯度洗脱，收集酶活在600700IU/ml，蛋白质含量在0.05mg/ml~0.5mg/ml的洗脱液，洗脱液浓缩后冷冻干燥获得地衣芽孢杆菌纤溶酶固体粉。6、如权利要求5所述的生产方法，其特征在于所述的高速冷冻离心的转速为12000r/min,离心温度为4°C。7、如权利要求5所述的生产方法，其特征在于所述的分段盐析分为两次，分别釆用质量百分比浓度为40%和70°/。的硫酸胺溶液进行盐析。8、如权利要求5所述的生产方法，其特征在于所述的梯度洗脱的洗脱流速为5ml/5min。全文摘要本发明公开了一种地衣芽孢杆菌纤溶酶，通过如下方法制得将菌种地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ZJUEL31410CGMCC1397进行发酵培养得到发酵液，从发酵液中分离纯化得到地衣芽孢杆菌纤溶酶。本发明首次发现地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)ZJUEL31410CGMCC1397能用于生产纤溶酶。生产的地衣芽孢杆菌纤溶酶产品以廉价的农副产品豆粕、膨化大豆和麸皮为主要原料，安全无毒，采用液体发酵方法生产，工艺流程短，成本低，工业化生产效率高，酶活高，具有开发价值。文档编号C12R1/10GK101113422SQ200710069670公开日2008年1月30日申请日期2007年6月28日优先权日2007年6月28日发明者何国庆,朱建良,章海锋,晖阮,陈启和申请人:浙江大学