天山雪莲sikSACPD基因在培育抗寒植物中的应用的制作方法

专利名称：天山雪莲sikSACPD基因在培育抗寒植物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从菊科凤毛菊属植物分离得到sikSACPD基因，并利用其对农作物品种进行改良，增强作物品种的抗寒性能，尤其是一种从天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir)叶片全长cDNA文库，用简并引物获得特异性片段，在文库中获得硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶SACPD基因(全长1555bp)，并将其用于农作物品种改良，增强作物品种的抗寒性能。
背景技术：
低温是限制植物地理分布及生物产量的重要因素，也是危害农业生产的主要自然灾害之一。生物膜是细胞与外界环境联系的界面，各种逆境对细胞的伤害始于质膜。1973年，Lyons根据细胞膜结构与抗冷性的关系，首先提出了植物冷害的“膜伤害”假说。他指出生物膜由于其结构物质的特点，会随温度的降低而产生物相变化，这些变化又引起胞内离子渗漏，胞内离子失去平衡，膜结合酶和游离酶活力失调。继而使细胞代谢失调，有毒的中间代谢物累积，使植物细胞受害[Chilling injury in plants[J].Ann Rev Plant Physiol 1973(24)445-466]。
近年来，随着植物生理、细胞和分子生物学理论和方法的日益完善，植物冷驯化和抗寒分子机理的研究取得了显著进展，植物抗寒基因工程也得到迅速发展，并研究出了多种转基因抗寒植物，为培育抗寒植物开辟了新途径。
膜是低温伤害的原初位点。许多研究表明，细胞膜的相变温度越低，抗寒性就越强，降低植物的膜相变温度可以增强植物的抗寒性。而膜的相变温度高低与膜脂所含脂肪酸的饱和程度最为密切。不饱和度高，相变温度就低，抗寒性强。因此导入脂肪酸去饱和代谢关键酶基因，通过降低脂肪酸的饱和度，可以提高植物的抗寒性。
Kodama(1994)将拟南芥叶绿体中ω3脂肪酸脱氢酶基因fad7导入烟草中，所获得转基因烟草抗寒性增加(Plant Physiol，107(4)1177-1185)。
Ishizaki-Nishizawa(1996)等将从蓝细菌(Anacystisnidukans)中克隆的Δ9去氢酶的基因Des9转入到烟草后，发现转基因烟草中受修饰的Δ9单饱和脂肪酸的含量与野生型相比增加了16倍，植物的半致死温度(LT50)也明显降低(Low temperature resistance of higher plants issignificantly enhanced by a nonspecific cyanobacterial desaturase.Nature Biotech 141003-1006)。
另外，酵母的硬脂酰基辅酶A去饱和酶基因和菠菜的硬脂酰基载体蛋白去饱和酶基因增强了转基因烟草的抗寒性。这些结果都表明导入脂肪酸去饱和代谢酶基因途径在抗寒上有潜力。
最近几年对低温调节代谢基因表达的研究更是在分子水平上证明了膜脂不饱和脂肪酸在植物进入抗寒状态中的重要性。耐冷的蓝藻从36℃转到22℃继续培养时，一种催化油酸到亚油酸反应(18:1Δ9→18:2Δ9，12)的酶基因desA表达增强，在高等植物中已发现了低温专一诱导表达的ω3脂肪酸去饱和酶基因fad8，此外在许多植物中发现可溶性蛋白质含量与抗寒性之间有密切关系，可能是植物在低温下只有促进活跃的蛋白质合成才能有可能提高抗寒性。脂类转移的蛋白质(lipid transfer protein，LTP)在不同细胞间起脂载体作用，已在许多植物中发现，它的活性受低温影响，而它的活性的改变将影响膜脂的组分，进一步影响抗冷力的表达。
此外将拟南芥的编码ω3脂肪酸去饱和酶的fad基因(Plant Physiol，105601-605)，菠菜的硬脂酰基载体蛋白去饱和酶SAD基因分别导入烟草中，都增强了转基因烟草的抗寒性(Identification Of nucleotide-binding regions in the chaperonin proteins GroEL and GroES.Nature366279-282)。
现已有多种脂肪酸去饱和代谢关键酶基因被相继发现，这为进一步开展抗寒基因工程奠定了基础。这些研究在分子水平上更精细地表明了脂类代谢在植物进入抗寒状态时的变化及这些变化产生的生理意义，同时也为抗寒基因工程提供了契机。
早在70年代，Lyons和Raison提出植物低温冷害来自膜脂物理性质的改变。他们认为，植物遭受低温伤害时，生物膜首先发生膜脂的物相变化，此后，大量实验结果都证实这种“膜相变的寒害”假说(Lyons和Raison，1970)，认为植物的膜脂的物相变化与植物抗寒性之间有着相关性，增加膜脂中的不饱和类脂或脂肪酸含量能降低膜脂的相变温度，一般是膜脂上的不饱和脂肪酸成分越大，该植物的相变温度越低，抗寒性也越强。许多实验也证实，抗冷植物一般具有较高的膜脂不饱和度，可能在较低温度下保持流动性，维持正常的生理功能，因而其膜脂相变温度低于不抗冷植物。
硬脂酰ACP脱饱和酶是硬脂酸(18:0)转化为油酸(18:1)过程的关键酶，它调节着细胞中的不饱和脂肪酸的水平。在植物中，硬脂酰ACP脱饱和酶催化着C-18的脱饱和反应，cDNA序列已从许多植物中得到克隆。旨在探讨不饱和脂肪酸含量与抗寒性之间的相关性。
作为新疆的特色植物，新疆雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)，又名天山雪莲、雪莲花、雪荷花等。属菊科凤毛菊属(Saussu rea D C)在新疆天山，它主要生长于海拔2400～4100m的高山草甸、高山冰碛石和流石滩石隙、悬崖峭壁石缝等处。那里气候多变，冷热无常，雨雪交替，最高月平均温3～5℃，最低月平均温-19～-21℃，年降水量约800毫米，无霜期仅有50天左右。
经过长期的自然选择，形成了稳定的特殊结构、功能和遗传基因，产生了适应极端环境条件下的生理和生化机制，这种与环境相适应的机制，与一般的耐冷、抗寒应答性的适应机制不同，主要表现在其低温条件下能够正常的生长发育，而一般的抗寒性植物在相应的低温条件下，生长发育受到抑制。近年来，随着植物生理、细胞和分子生物学理论和方法的日益完善，植物冷驯化和抗寒分子机理的研究取得了显著进展，植物抗寒基因工程也得到迅速发展。
因此从雪莲中分离得到新的抗寒基因，并将其构建植物表达载体，在转基因系统中研究该基因在提高植物耐低温性能中的重要功能，揭示雪莲的抗寒机理，丰富植物抗寒分子生物学理论，并以此为基础研究提高植物的耐低温能力，培育新的转基因抗寒植物，具有重要的意义。

发明内容
本发明的一个主要目的是为植物抗寒育种提供有价值的硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶sikSACPD基因，本发明的目的还在于通过上述基因的过量表达，进而使植物的抗低温胁迫性能得到大幅度的提高，最终获得抗(耐)低温能力明显增强的优良植物品种。
本发明的目的是通过以下过程和方法实现的本发明所述的从天山雪莲中克隆硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶SACPD基因sikSACPD，其序列为<210>1。
本发明的SACPD基因sikSACPD是通过以下过程实现的构建天山雪莲富含全长的cDNA文库，利用PCR技术克隆硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶基因sikSACPD的全长cDNA序列，其序列为<210>1。
上述的sikSACPD基因通过以下系统功能分析sikSACPD基因原核表达载体pTHIO-sikSACPD的构建及表达；sikSACPD与原核表达载体pTHIO-His(C)构建sikSACPD基因原核表达载体。
本发明sikSACPD基因植物表达载体构建如下构建两种植物表达载体一是组成型表达pCAMBIA 2301-35S-sikSACPD，二是诱导型表达pCAMBIA 2301-RD29-sikSACPD(选择从拟南芥中克隆RD29a冷诱导启动子)上述两种植物表达载体的构建最好选择pCAMBIA1301为中间过渡载体。
上述的sikSACPD基因的应用
利用上述基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化获得抗寒转基因植物。
PCR检测和Southern blot和Western(dot)blot分析等检测证明该基因整合到转基因植株基因组中并证明该基因能在植物中正常表达，模拟低温胁迫处理实验和生理指标的测定均证明转基因株系比对照显著提高了植物抗寒性能，证明了转sikSACPD基因植株耐寒性能的提高。
本发明以天山雪莲试管苗为实验材料，构建天山雪莲富含全长的cDNA文库，利用PCR技术克隆了硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶基因sikSACPD的全长cDNA序列，将它们构建成原核表达载体，制备抗血清及植物表达载体转化模式植物烟草，检测转基因烟草的抗寒的生理指标，及运用GC-MS分析脂肪酸组成，变化情况，探讨脂肪酸的不饱和程度与抗寒性之间的相关性。
雪莲生活在极端环境中，是一种极好的抗寒基因的资源，至今，国内外对雪莲抗寒基因的研究还未见文献报道。利用这种具有特色稀有植物，从中筛选、克隆出与抗寒直接相关的基因，揭示雪莲适应性的机制，研究其遗传基础，充分发掘其潜在的基因资源，并将其用于农作物品种改良，具有巨大的学术和经济价值。
经实验表明转基因株系在模拟抗寒胁迫48小时后，与未转基因株系相比，叶片相对电导率下降8.9％。在正常条件下，转基因株系的叶片净光合速率提高19.6％，总叶绿素含量提高了7.4％；模拟抗寒胁迫处理5天后，叶片净光合速率提高51.9％，总叶绿素含量提高了13.5％；处理10天后，叶片净光合速率提高64.6％，总叶绿素含量提高了18.8％。相对电导率和叶片净光合速率是衡量植物抗寒生理状态的重要指标。相对电导率越低，抗寒性能越强。而植株在寒害条件下总叶绿素含量提高，保持光合速率越高，抗寒能力越强。低温使叶绿素含量降低，随低温天数的增加叶绿素含量逐渐减少，低温对chlb的破坏较chla严重，导致chla/chlb的比值增大。转基因叶片的叶绿素含量均不同程度的高于对照，表明转基因对叶绿素有一定的保护作用，因而减缓了叶绿素在低温下的分解速度。
在0-10℃处理7天后，转基因株系在形态上比未转基因株系明显健壮。


图1是sikSACPD基因原核表达载体的构建流程的示图。
图2是组成型植物表达载体pCAMBIA 2301-35S-sikSACPD的构建流程的示图。
图3是诱导型植物表达载体pCAMBIA 2301-RD29-sikSACPD构建流程的示图。
图4是重组植物表达载体pCAMBIA2301-35S-sikSACPD和pCAMBIA2301-RD29-sikSACPD转入农杆菌GV3101的鉴定图。
图5是sikSACPD基因转化烟草的PCR检测图。
图6是PCR-Southern杂交及点杂交分析图。
图7是sikSACPD基因转化烟草的Western Dot图。
图8是sikSACPD基因转化烟草的实时荧光定量PCR图。
图9是sikSACPD基因转化烟草的叶片质膜透性的测定柱形图。
表1是sikSACPD基因转化烟草的脂肪酸(FA)分析图10是sikSACPD基因转化烟草在低温处理下的叶片净光合速率柱形图。
图11是sikSACPD基因转化烟草在盐胁迫处理下的叶片叶绿素含量柱形图。
图4中1、2PCR product of sikSACPD from pCAMBIA2301-35S-sikSACPD4、7PCR product of sikSACPD from pCAMBIA2301-RD29-sikSACPD图5中1c-；2～8；PCR产物；MDL2000；图6中C+Positive control；C-Non-transgenic plant；1Transgenic plants；图7中C+Positive control(expression product in E.coli)；C-Negative control(expression product in E.coli；1-5.Transgenic plants；图8中A1room temperature treated(27℃)4hr；A217℃treated 4hrA3，A44℃treated 4hr；A5-6℃treated 4hr图9中1～6transgenic selected Strains；WTwild type tobacco
图10中1处理前，2处理后第2天，3处理后第5天，4处理后第10天测定的叶片净光合速率。
图11中1处理前，2处理后第2天，3处理后第5天，4处理后第10天测定的叶片叶绿素含量。
具体实施例方式实验所涉及的药品限制性内切酶购自大连Takara公司和上海Sangon公司，Taq酶购自北京Tangen公司，T4 DNA连接酶购自北京Tangen公司和大连Takara公司；文库构建试剂盒CreatorTM SMARTTM cDNA Library Construction Kit(Catlog#K1053-1)是CLOTECH公司产品；RNA提取试剂盒RNeasyPlant Mini Kit(Cat.NO.74904)购于QIAGEN公司；DIG DNALabeling and Detection Kit购自Roche公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京Tangen公司；IPTG、X-gal试剂及抗生素、植物激素购自上海Sangon公司。具体实验操作依据[美]J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔的《分子克隆实验指南》。
实施例11.从天山雪莲中克隆到硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶(sikSACPD)基因运用SMART(Switching Mechanism At 5`end of the RNA Transcript)技术，构建天山雪莲叶片全长的cDNA文库，原始文库滴度达3.23×105cfu/ml，文库插入片段多在1000bp左右。设计兼并引物，运用RT-PCR方法，再结合cDNA文库，从天山雪莲中克隆到sikSACPD基因，基因编码区长为1188bp，编码396个氨基酸。
1.1特异性片段的获得植物总RNA提取方法RNA提取试剂盒(RNeasyPlant Mini Kit)法(1)取不超过0.1g的植物材料，于研钵中快速用液氮研至粉末状，倒入2ml的离心管中；(2)加入450μl RLT buffer(1mlRLT buffer加10μl β-ME，使用前加)旋转混匀(1-3min，56℃)(3)把溶解产物吸入QLA shredder spin column，然后放入2ml收集管中，13000rpm，2min，上清转入一新离心管中；(4)加0.5体积无水乙醇，用吸管迅速混匀，继续下一步；(5)把上一步中的加到Rneasy mini column(pink)，然后放到2ml离心管中，10000rpm，15sec；(6)加700μl RW1 buffer，10000rpm，15sec；
(7)把Rneasy mini column放入新的2ml收集管中，加500μL RPE buffer，10000rpm，15sec，弃液；(8)再加500μl RPE buffer，10000rpm，2min，弃液；(9)把Rneasy mini column放入一个新的1.5ml收集管中，吸50μLRneasy-free-water，10000rpm，1min，然后可用或保存。
1.2SDS法分离植物总DNA(1)称取0.1g植物叶片，于研钵中快速用液氮研至粉末状；(2)将粉末转入1.5ml离心管中，立即加入500μLDNA提取缓冲液；(3)混匀后加入20％SDS(W/V)50μL。轻轻混匀后于65℃水浴10min。
(4)加入250μL5mol/LKAc于冰上反应30min，离心(11000rpm，10min)；(5)取上相转入一新的离心管，加入等体积(氯仿∶异戊醇＝24∶1)抽提一次，11000rpm，10min离心；(6)取上相转入一新的离心管，加入0.6倍体积异丙醇，充分混匀，置于冰上10min。离心(12000rpm，5min)，去上相；(7)用70％乙醇洗沉淀物，吹干，最后溶于100μLTE溶液(pH 8.0)中。
1.3 sikSACPD基因5′区域，3′区域的获得根据SACPD基因氨基酸的保守区域设计的简并引物分别以天山雪莲RNA和基因组DNA为模板进行PCR，获得特异性片段。对特异性片段测序后，设计特异性引物，运用PCR的方法直接从天山雪莲叶片全长cDNA文库中来获得sikSACPD基因5′区域，3′区域。用文库M13正向引物与特异性引物获得了一条900bp左右的特异性条带，用文库M13反向引物和特异性引物获得一条650bp的特异性条带。经序列测定，生物信息学分析，是SACPD基因中的编码序列。
1.4 sikSACPD基因编码区的获得根据以上5′，3′区域的序列测定结果，综合考虑植物表达载体的构建，设计特异性引物来获得sikSACPD基因的编码区，得到一条1200bp特异性条带，与预期1204bp相符。送上海生工测定序列显示所获序列正为SACPD基因编码区序列。
1.5 sikSACPD基因全长的获得根据PGM-T-SAD 5′，PGM-T-SAD 3′序列测定结果，结合简并引物获得片段，可知该基因的全长cDNA共1555bp。它包含的开放式阅读框(ORF)211-1401bp，编码396个氨基酸，蛋白分子量为45KD。具有核定位信号肽(RKRRRT)。
实施例2参照图1。sikSACPD基因原核表达载体的构建及表达sikSACPD与原核表达载体pTHIO-His(C)的构建过程。
实施例3参照图2、图3。
构建sikSACPD基因植物表达载体构建两种植物表达载体一是组成型表达pCAMBIA 2301-35S-sikSACPD二是诱导型表达pCAMBIA 2301-RD29-sikSACPD在本实施方案中，sikSACPD基因被置于低温诱导型启动子RD29a的调控之下，再连至pCAMBIA2301，构成一个植物表达载体，用于植物的转化。根据本发明的这一实施方案，构建所选用的诱导型启动子除了RD29a之外，还可以选用文献资料中所列的其他诱导型启动子。植物筛选具体选用何种抗生素，要看选用植物表达载体所对应的标记基因。
3.1组成型植物表达载体的构建(如图2所示)3.2诱导型植物表达载体的构建(如图3所示)我们选用了从拟南芥中克隆到的，启动能力很强的冷诱导启动子RD29a启动子。
实施例4农杆菌的转化4.1农杆菌感受态的制备(1)挑取新鲜的E.coli DH5α或DH10B单菌落接种于10mL LB液体培养基中，37℃培养过夜；(2)按1/100的稀释比例接种于20mL液体LB中，继续培养至OD600约0.4左右；(3)菌液冰浴30min，分装于1.5mL无菌离心管中，6000rpm，4℃，10min离心，收集沉淀菌体；(4)细胞重悬于750μl冰预冷的无菌0.05Mol/LCaCl2中，6000rpm，4℃，10min离心，弃上清，收集菌体；(5)细胞重悬于600μl冰预冷的无菌CaCl2中，冰浴20min，6000rpm，4℃，10min离心，弃上清，收集沉淀菌体；(6)每管中加75μl冰预冷的无菌CaCl2重悬沉淀细胞；
(7)制备好的感受态细胞，可现用，或-20℃保存，或-70℃保存。
4.2转化1)取2μl已鉴定好的质粒DNA，加入100μl农杆菌感受态细胞悬浮液，混匀，冰浴20min；2)于液氮中放置3-5min；2)37℃静止水浴热激2min；3)加入600μl LB液体培养基，混匀后，28℃水浴振荡4-5hr；4)取200μl转化液涂布在含相应抗生素的平板上，28℃恒温培养2d。挑取白色菌落作进一步筛选、鉴定。
4.3电转化感受态细胞的制备(1)挑取新鲜的E.coli DH5α或DH10B单菌落接种于10mL LB液体培养基中，37℃培养过夜；(2)按1/100的稀释比例接种于500ml液体LB中，继续培养至OD600约0.4左右；(3)菌液冰浴60min，分装于500ml无菌离心杯中，4000rpm，4℃，15min离心，收集沉淀菌体；(4)细胞重悬于500ml冰预冷的无菌10％甘油中，4000rpm，4℃，15min离心，弃上清，收集菌体；(5)细胞再重悬于250ml冰预冷的无菌10％甘油中，4000rpm，4℃，15min离心，弃上清，收集菌体；(6)细胞再重悬于200ml冰预冷的无菌10％甘油中，4000rpm，4℃，15min离心，弃上清，收集菌体；(7)离心杯中加3ml冰预冷的无菌10％甘油重悬沉淀细胞。
实施例5为对烟草遗传转化及再生的实例。
在本实施方案中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。冻融法为本领域技术人员非常熟悉的技术操作，不是本发明的关键。通过PCR检测阳性的农杆菌菌株，用于转化烟草。本发明中对于靶植物的转化方法不是关键，可以使用本领域技术人员所熟悉的各种不同的转化技术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但不仅限于农杆菌侵染法，微粒轰击法，显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等。
本方案中用于将转化细胞再生成植株的方法，可以使用适合于靶植物的方法。最好使被转化的序列稳定的整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代的过程中不被丢失。另外，用于转化靶植物的核苷酸序列可以以线性，环形或其它重组载体的形式如人工染色体的形式存在。
5.1冻融法转化农杆菌GV3101(1)将2μl质粒加入到100μl农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置20min；(2)于液氮中速冻5min，37℃温浴3min；(3)加入900μl不含抗生素的LB液体培养基，28℃轻摇5hr，8000rpm，2min，离心，富集菌体；(4)保留150μl菌液，混匀，均匀涂布于含500mg/LCb、50mg/L庆大霉素及Kan抗性的LB平板上，28℃倒置培养两天。
(5)挑取新鲜单菌落，进行PCR鉴定，筛选阳性克隆。
5.2农杆菌侵染吸取经鉴定呈阳性的农杆菌GV3101单菌落菌液，按1∶100接种到含100mg/LKan，500mg/L庆大霉素，100mg/L Kan的20mL液体LB培养基中，于28℃恒温摇床振荡培养约28hr，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释30倍左右。
5.3叶盘法转化烟草及再生(1)取烟草无菌叶片，用剪刀切成小块放入用无菌MS液体培养基稀释过的农杆菌GV3101，浸泡15min，取出用无菌滤纸吸去多余菌液，于MS固体培养基(不含抗生素)中25℃暗培养两天；(2)把叶片转入含100mg/LKan和50mg/LCb分化培养基中，25℃光下培养诱导愈伤组织，生芽；(3)将长至1cm左右的芽转入生根培养基上诱导生根。
实施例6参照图4-8。转基因烟草的分子检测6.1PCR初检反应体系及循环体系ddH2O12.5μl10×PCR Buffer2μlMgCl21.2μldNTP(各2.5mM) 0.8μl
P1+P2(各10μM) 1.2μl基因组DNA2μlTagDNA聚合酶 0.3μlTotal20μl反应程序 反应结束后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，并回收阳性对照产物，置-20℃冰箱备用。
6.2烟草总DNA的分离、酶切(如图4、5所示)用SDS法分离烟草总DNA作为模板，P1、P2为引物，进行PCR反应，初步筛选转基因植株。同时设阳性对照先前鉴定好的质粒DNA，PCR反应产物。阴性对照未转基因植株PCR产物。回收阳性对照PCR产物备用，经鉴定为阳性的烟草总DNA纯化后用HindIII酶切，37℃保温20hr后进行1％琼脂糖凝胶电泳5-6hr(1.5V/cm)；RDP1为<210>25`AAGCTTCGACTCAAAACAAACTTACGAA 3`HindIIIRDP2为<210>35`CCATGGAATCAAACCCTTTATTCCTGA 3`NcoI酶切反应体系10×M Buffer 3μlHindIII 1.5μl基因组DNA25.5μlTotal30μl6.3 Southern blot检测(如图6所示)
探针制备(1)吸取16μl回收产物于一洁净离心管，沸水加热10min后立即插入冰水中；(2)加入4μl DIG High Primer至上述离心管中，瞬时离心后，37℃温浴1-20hr；(3)取出离心管，65℃加热10min终止反应或加2μl0.2M pH8.0的EDTA终止反应，置冰箱备用。
转膜及固定(1)将凝胶加样孔及不含样品的多余部分切掉，蒸馏水淋洗后，置于0.2mol/LHCl中摇动漂洗5min；(2)用蒸馏水淋洗后，浸于0.4mol/L NaOH变性液中室温变性30min，其间轻摇数次；(3)用蒸馏水淋洗后，浸于中和液中于室温中和30min，其间轻摇数次；(4)将一固体支持物置于盛有20×SSC缓冲液的浅盘中，上面铺一层Whatman 3mm滤纸，边缘浸于20×SSC缓冲液中，赶除滤纸与支持物间的气泡；(5)凝胶块切除一角作记号后背面朝上放于滤纸上，赶除气泡，用保鲜膜做一个窗口，使其恰好封住凝胶的四周；(6)剪一张略大于凝胶块的滤纸及尼龙膜，蒸馏水浸润后置于6×SSC中至少5min，剪去一角与凝胶块对应轻放于凝胶上，赶除气泡；(7)剪Parafilm封在凝胶四周，上面铺一张20×SSC浸润的Whatman 3mm滤纸，将吸水纸剪成略大于滤纸的纸块，置于滤纸上，使高约15cm，其上放一玻璃板，压一个500g左右重物，转膜8-24h，其间更换吸水纸一到两次；(8)转膜结束后将尼龙膜夹在两层Whatman 3mm滤纸间。
(9)转好的膜放入紫外交联仪(UV-tratalinker)中，在能量为1500焦耳的情况下，对膜进行正反面交联。交联后放于干燥器中备用。
杂交与检测(1)吸64ml无菌ddH2O分两次加至DIG Easy Hyb(bottle7)中，立即在37℃搅拌5min；(2)37℃-42℃预热适量(10ml/100cm2)的DIG Easy Hyb；(3)将膜置于上述DIG Easy Hyb中，轻轻振荡30min；(4)将DIG-labeled DNA探针沸水变性5min，立即冰水冷却；(5)预热适量(3.5ml/100cm2)的DIG Easy Hyb，加入适量上述变性过的探针，充分混匀(注意尽量不要有气泡)；
(6)倾去③中的预杂交液，换上⑤中的杂交液，41℃轻微振荡4hr或过夜；(7)将膜取出，用2×SSC，0.1％SDS于15-25℃洗膜两次，每次5min，轻轻振荡；(8)将膜取出，用0.5×SSC，0.1％SDS，于65-68℃洗膜两次，每次5min，轻轻振荡；(9)将膜置于100Washing buffer中，15-25℃轻轻振荡1-5min；(10)将膜置于100ml Blocking solution中，15-25℃轻轻振荡30min；(11)将膜置于20ml Antibody solution中，15-25℃轻轻振荡30min；(12)将膜置于100ml Washing buffer中，轻轻振荡洗涤两次，每次15min；(13)将膜置于20ml Detection buffer中，平衡2-5min；(14)将膜置于10ml现配的显色液中显色，显色反应最好静置于暗处完成；(15)当预期的条带出现，用50mlddH2O或TE洗膜终止反应。
(16)将膜封存于装有TE的塑料袋中，可长期保存。
6.4实时荧光定量PCR(如图8所示)所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图，分析处理和未处理该基因的表达情况。
6.5Western(dot)blot分析(如图7所示)抗血清的制备(1)大量收集原核表达产物，进行SDS-PAGE电泳，把胶放入预冷的0.25mol/L KCl，1mmol/LDTT溶液中，4℃过夜，切下目的条带，装入透析袋中，在有0.05mol/L PB(PH 7.4)缓冲液的水平电泳槽中，120V电泳2个小时，取出胶条，吸出25μl重新进行SDS-PAGE电泳，检查回收的目的条带，同时算出蛋白的含量。把透析袋放入足够量的0.8％的生理盐水中，4℃透析24小时。其间可换几次生理盐水。透析完后，将袋中蛋白溶液转入离心管中，放于-20℃，备用。
(2)在样品加入等体积复氏不完全佐剂(1.5g羊毛脂和8ml石蜡油)和卡介苗，置乳化器中乳化；(3)对兔子进行皮下多点免疫，共免疫三次，每隔9天一次，每次1ml，(4)从第三次免疫5天后，进行心脏采血，所采血液离心后所得上清即为多克隆一抗；植物蛋白的提取
(1)取0.2g抗性植株及一非转化植株新鲜叶片，加入500μl植物蛋白提取缓冲液，用玻棒充分研磨；(2)4℃，12000rpm×20min；(3)吸取400μl上清，加2V的丙酮，冰浴1hr，4℃，2500rpm×3min；(4)弃尽上清，除去残存的丙酮，用50μlddH2O溶解蛋白，置-20℃备用；电泳在上述蛋白样品中加入50μl2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸10min，以非转化烟草为阴性对照进行SDS-PAGE电泳，电泳分离胶浓度为15％，浓缩胶浓度为5％，电压60V，电泳3-4hr。
免疫分析(1)电泳完毕，剥下胶，切除浓缩胶，并切除一角做标记，置转移液中平衡30min；(2)同时准备6张滤纸，1张硝酸纤维素膜(NC膜)，均与胶同样大小，同样在膜上切除一角与胶对应，将膜在转移液中平衡15min，滤纸用前浸湿即可；(3)i3层滤纸、NC膜、3层滤纸(每放一层必须赶尽气泡)，电压30V转移90min；(4)将膜取出，置热密封袋中，加入50ml封闭液，37℃封闭3hr；(5)倾去封闭液，加入50ml用封闭液稀释的第一抗体(1∶500)，37℃温浴3hr；(6)将膜取出置一干净培养皿中，用TBS洗3次，每次15min；(7)将膜转入热密封袋中，加入用封闭液稀释的酶标第二抗体(1∶1000)，37℃温浴3hr；(8)同步骤(6)；(9)将膜置于显色液中显色。
在本实施方案中，我们选用烟草作为转基因植物材料，也可选用其它植物作为转基因材料。
实施例7参照图9。转基因植株的模拟寒害处理及叶片质膜透性测定两种类型的转基因植株被鉴定后，通过无性繁殖获得无菌苗，在MS培养基上生根后。植株成活后选取生长一致的苗(5～7叶期)，进行模拟寒害处理。分别用打孔器从叶片中打取小圆片测定叶片质膜透性。(如图9所示)实施例8参照图10-11。转基因植株的模拟寒害处理叶片叶绿素含量和光合速率的测定两种类型的转基因植株被鉴定后，通过无性繁殖获得无菌苗，在MS培养基上生根后。植株成活后选取生长一致的苗(5-7叶期)，进行模拟寒害处理以-9℃-10℃，每间隔2-3℃为一个处理。处理前、处理2天、5天后，7-10天，对每个株系植株第3-5位展开叶，用Lc-6400测定净光合速率，每处理重复3次。
第3-5位叶避开叶脉打取小圆片5片，放入研钵中，加CaCO3少许，加80％的丙酮，匀浆，定容至10mL。3000rpm离心10min。取上清，测定470、646.8、663.2、750nm处的吸光值，计算叶绿素含量。(如图10、图11所示)实施例9转基因植株的脂肪酸(FA)分析在本实施方案中，克隆出天山雪莲硬脂酰Δ9(ACP)脱饱和酶基因，并成功构建了原核表达载体pTHIO-sikSACPD，表达出目的蛋白，构建了植物表达载体pCAMBIA2301-35S-sikSACPD，pCAMBIA2301-RD29a-sikSACPD，并在转基因烟草中得到表达，提高了转基因烟草的油酸含量。对经过分子鉴定的转sikSACPD基因烟草进行GC-MS气相色谱分析，结果见表，可以看到转基因烟草的油酸含量较非转基因烟草有所提高，在经过低温处理后不饱和脂肪酸含量高于对照。
下表是sikSACPD基因转化烟草的脂肪酸(FA)分析Tablel Fatty acid compositiona of total lipids from leaves of tobacoo

序列表<110>石河子大学<120>天山雪莲sikSACPD基因在培育抗寒植物中的应用<160>3<210>1<211>1555<212>DNA<213>天山雪莲(Saussurea.involucrata Kar.et Kir.)<220>
<221>5’UTP<222>(1)...(210)<220>
<221>CDS<222>(211)...(1401)<220>
<221>3，UTP<222>(1402)...(1555)<400>1Translation of DNAMAN1(211-1401)Universal codeTotal amino acid number396，MW＝44956Max ORF starts at AA pos 71(may be DNA pos 211)for 396 AA(1188 bases)，MW＝449561cgtgccgact ccgcgccgcg tgtcagggcg cgaggttcga ttgcatacct tcgtatagca61 tatatgttat acgactctca taggacggta ccggacatat gcccgggaat tcggccatta121 cggccggggc tcacttgtgt ggaggaaaac agaactcaaa aaactttgcg actgcgaaca190200 210 220230 240181 aggagaaaaagaagaagaacaagatcaaga atg gct ctt cgg atc agt ccg gtg acc ttg61 Met Ala Leu Arg Ile Ser Pro Val Thr Leu250 260 270 280 290 300241 caa tcg gag agg tat cgt tca ttt tcg ttt cct aaa acg gct aat ctc aga tct ccc aaa81 Gln Ser Glu Arg Tyr Arg Ser Phe Ser Phe Pro Lys Thr Ala Asn Leu Arg Ser Pro Lys310320 330340 350 360301 ttc gct atg gct tcc acc ttg gga tct tcg aca ccg aag gtt gag aat acc aag aag cct101 Phe Ala Met Ala Ser Thr Leu Gly Ser Ser Thr Pro Lys Val Glu Asn Thr Lys Lys Pro370 380 390400 410 420361 ttt agc cct cca cga gag gtt cat gtt cag gtg aca cac tcc atg cca cca caa aag ata
121 Phe Ser Pro Pro Arg Glu Val His Val Gln Val Thr His Ser Met Pro Pro Gln Lys Ile430 440 450 460 470 480421 gag att ttc aaa tcc ata gag ggt tgg gct gag cag aac ata ttg gtt cac cta aag cca141 Glu Ile Phe Lys Ser Ile Glu Gly Trp Ala Glu Gln Asn Ile Leu Val His Leu Lys Pro490 500 510 520 530 540481 gtg gag aaa tgt tgg cga gca cag gat ttc ttg cct gaa cct gca tct gaa gga ttt gat161 Val Glu Lys Cys Trp Arg Ala Gln Asp Phe Leu Pro Glu Pro Ala Ser Glu Gly Phe Asp550 560 570 580 590 600541 gaa caa gtc aag gaa cta aga gcg agg gca aaa gag att cct gat gat tac ttt gtt gtt181 Glu Gln Val Lys Glu Leu Arg Ala Arg Ala Lys Glu Ile Pro Asp Asp Tyr Phe Val Val610 620 630 640 650 660601 ttg gtt gga gat atg att aca gag gaa gcc cta cct acc tac caa aca atg ctt aat acc201 Leu Val Gly Asp Met Ile Thr Glu Glu Ala Leu Pro Thr Tyr Gln Thr Met Leu Asn Thr670 680 690 700 710 720661 cta gat ggt gta cga gat gaa act ggg gct agc ctt aca cct tgg gct gtc tgg act agg221 Leu Asp Gly Val Arg Asp Glu Thr Gly Ala Ser Leu Thr Pro Trp Ala Val Trp Thr Arg730 740 750 760 770 780721 gct tgg acg gct gaa gaa aac aga cat ggt gat ctc ctc cac act tat ctt tac ctt tct241 Ala Trp Thr Ala Glu Glu Asn Arg His Gly Asp Leu Leu His Thr Tyr Leu Tyr Leu Ser790 800 810 820 830 840781 ggc cgg gta gac atg agg cag att cag aag act att cag tat ctg att ggg tca gga atg261 Gly Arg Val Asp Met Arg Gln Ile Gln Lys Thr Ile Gln Tyr Leu Ile Gly Ser Gly Met850 860 870 880 890 900841 gat cct cgt acc gaa aac agt ccc tac ctt ggg ttc atc tac acg tca ttt caa gag cgt281 Asp Pro Arg Thr Glu Asn Ser Pro Tyr Leu Gly Phe Ile Tyr Thr Ser Phe Gln Glu Arg910 920 930 940 950 960901 gcc aca ttt att tcg cat gga aac acc gca agg cat gca aag gac cac ggg gat gtg aaa301 Ala Thr Phe Ile Ser His Gly Asn Thr Ala Arg His Ala Lys Asp His Gly Asp Val Lys970 980 990 1000 10101020961 ctg gcg caa att tgt ggt aca atc gca tct gat gaa aag cgt cat gaa acc gct tac aca321 Leu Ala Gln Ile Cys Gly Thr Ile Ala Ser Asp Glu Lys Arg His Glu Thr Ala Tyr Thr103010401050 1060 107010801021 aag ata gtc gaa aag cta ttt gag atc gat cct gat ggc act gtt ctt gct ttt gct gac
341 Lys Ile Val Glu Lys Leu Phe Glu Ile Asp Pro Asp Gly Thr Val Leu Ala Phe Ala Asp1090 11001110 1120 113011401081 atg atg agg aaa aag atc tcc atg cct gca cac ttg atg tac gat ggg cat gat gac aac361 Met Met Arg Lys Lys Ile Ser Met Pro Ala His Leu Met Tyr Asp Gly His Asp Asp Asn1150 11601170 1180 119012001141 ctc ttt gac cac ttc tca gct gtt gca caa aga ctt ggc gtt tac acc gcc aaa gac tat381 Leu Phe Asp His Phe Ser Ala Val Ala Gln Arg Leu Gly Val Tyr Thr Ala Lys Asp Tyr1210 12201230 1240 125012601201 gca gac ata ctg gaa ttt ctg gtg ggg cgg tgg aaa gtg gcg gat tta act ggt tta tct401 Ala Asp Ile Leu Glu Phe Leu Val Gly Arg Trp Lys Val Ala Asp Leu Thr Gly Leu Ser1270 12801290 1300 131013201261 gga gaa ggg cgt aaa gcc caa gat tat gtt tgt ggg ttg ccg cca aga atc aga aag ctg421 Gly Glu Gly Arg Lys Ala Gln Asp Tyr Val Cys Gly Leu Pro Pro Arg Ile Arg Lys Leu1330 13401350 1360 137013801321 gag gag aga gct caa ggg cga gca aag gaa ggg ccc att gtt ccg ttc agc tgg att ttc441 Glu Glu Arg Ala Gln Gly Arg Ala Lys Glu Gly Pro Ile Val Pro Phe Ser Trp Ile Phe1390 14001410 1420 143014401381 gat aga cag gtg aag ctc tga aaa aag taa gtt tgg ttt ctg ttg gtt tat ggg gta gag461 Asp Arg Gln Val Lys Leu***1441 gttaaaacct gttttagatg tttatttcgt gtagtgtgcg tttttttctt ttcttgaatc1501 cggtattgtg tcgttgagtt tgcgtgtttg taaacttgtg tggctgtggg catat<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2cgactcaaaacaaacttacgaa<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3aatcaaaccctttattcctga。
权利要求
1.一种从天山雪莲中克隆硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶SACPD基因sikSACPD，其序列为<210>1。
2.一种从天山雪莲中克隆硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶SACPD基因sikSACPD的方法，其特征在于通过以下过程实现的构建天山雪莲富含全长的cDNA文库，利用PCR技术克隆硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶基因sikSACPD的全长cDNA序列，其序列为<210>1，上述的sikSACPD基因通过以下系统功能分析sikSACPD基因与原核表达载体pTHIO-His(C)构建sikSACPD基因原核表达载体pTHIO-sikSACPD；构建sikSACPD基因的两种植物表达载体一是组成型表达pCAMBIA 2301-35S-sikSACPD，二是诱导型表达pCAMBIA 2301-RD29-sikSACPD。
3.如权利要求2所述的从天山雪莲中克隆硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶SACPD基因sikSACPD的方法，其特征在于所述两种植物表达载体的构建选择pCAMBIA1301为中间过渡载体。
4.一种从天山雪莲中克隆硬脂酰ACPΔ9脱饱和酶SACPD基因sikSACPD其序列为<210>1的用途，其特征在于利用所述基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化获得抗寒转基因植物。
全文摘要
本发明涉及一种天山雪莲sikSACPD基因在培育抗寒植物中的应用，主要是构建天山雪莲富含全长的cDNA文库，利用PCR技术克隆硬脂酰ACPΔ
文档编号C12N15/29GK101054590SQ20071008995
公开日2007年10月17日 申请日期2007年3月23日 优先权日2007年2月28日
发明者祝建波, 刘海亮, 张煜星, 崔百明, 王爱英 申请人:石河子大学