专利名称：天山雪莲SikDh基因在培育抗寒植物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从菊科凤毛菊属植物分离得到sikDh基因，并对植物品种进行改良，增加植物的抗寒性能，尤其是一种从天山雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir)叶片全长cDNA文库得到的sikDh基因，构建原核表达载体，制备抗血清，同时构建诱导型和组成型植物表达载体，转化植物，对抗寒性效果进行评价。
背景技术：
植物植物抗寒的一个重要机制是渗透调节作用，即植物在冷胁迫下，通过体内生理生化代谢途径的改变在低水势下忍耐脱水，以保持或吸收水分，保护叶绿体功能和维持体内离子平衡。这种生理生化代谢途径的主要特征是产生渗透物质和特定蛋白，以控制离子、水流和去除有毒物质(The molecular basis of dehydration tolerance in plants.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.47，377-403)。现已知植物的抗寒性是由复杂的多基因控制的数量性状，通过导入单一的功能基因可以在一定程度上提高植物的抗寒性。
脱水素(Dehydrins(group HLEAs))，脱水素mRNA和蛋白是最常报导的冷调节分子类型，它们的结构特点和可能的功能已经被揭示(Emergence of a biochemical role of a family of plantdehydration proteins.Physiol Plant 97795-80)。所有的脱水素羧基末端含有富含Lys基序的K-区段(consensus sequenceEKKGIMDKIKEKLPG)，许多脱水素也包含一系列由6个以上丝氨酸组成的S-区段(S-segment)，大部分也包含一个或多个Y-区段(Y-segment)(consensus sequence{V/T}DEYGNP)。在氨基酸终止区和K-区段之间也有一些保守序列，包括甘氨酸和苏氨酸序列，它们的特点都是高度亲水，可以在极性氨基酸之间替代。不同的脱水素其K-区段、Y-区段的数目，以及其它序列的特征都是不一样的。
这个独特的K-区段形成α-螺旋，它可以稳定大分子和亚细胞结构(Emergence of abiochemical role of a family of plant dehy dration proteins.Physiol Plant 97795-80)、(Structural motifsin LEA proteins of higher plants.InClose TJ and Bray EA(eds)Response of Plants to CellularDehydration During Environmental Stress.RockvilleAmerican Society of Plant Physiologists，pp91-103)。S-区段可以作为磷酸化位点，与核定位信号肽相结合参与运输(The maize abscisicacid-responsive protein Rab 17 is located in the nucleus and interacts with nuclear localization signals.Plant Cell 6351-360)、(Expression，tissue distribution and subcellular localization of dehydrinTAS 14 in salt-stressed tomato plants.Plant Mol Biol 261921-1934)。免疫定位表明脱水素不仅存在于细胞核，而且在胞质中也存在(Nuclear and cytoplasmic localisation of maize embryo andaleurone dehydrin. Protoplasm 17787-94)。Y-区段序列与分子伴侣部分核酸结合序列同源(Identification Of nucleotide-binding regions in the chaperonin proteins GroEL and GroES.Nature366279-282)。
植物基因组中包含许多的脱水素序列，然而到目前为止，仅个别几个物种中的被确定为冷调节脱水素，其它的脱水素都是在种子发育过程中受干旱和盐胁迫表达的。冷调节脱水素在大小，保守区段的种类上是不同的，不是一种类型。Y-区段变化较大，有的有，有的没有。在同一个物种中也有不同，就像小麦中的3个脱水素Wcs120编码的一个序列，有6个K-区段和11个Y-区段，没有S-区段，但富含甘氨酸和苏氨酸(Cloning，characterization，and expression of a carrierDNA encoding a 50-kilodalton protein specifically induced by cold acclimation in wheat.Plant Physiol991381-1387)。Cor39编码一个有6个K-区段和6个甘氨酸富集片段的序列也没有S-区段(Characterization of a cold-regulated wheat gene related to Arabidopsis cor47.Plant Physiol 100915-922)。然而，Wcor410编码的序列有S-区段，没有甘氨酸富集片段(Differential expression ofa gene encoding an acidic dehydrin in chilling sensitive and freezing tolerant gramineae species.FEBSLett 34420-24)。不同的脱水素S-区段和Y-区段的不同可能至少与亚细胞的定位有关。
作为新疆的特色植物，新疆雪莲(S.involucrata Kar.et Kir.)，又名天山雪莲、雪莲花、雪荷花等。属菊科凤毛菊属(Saussu rea D C)在新疆天山，它主要生长于海拔2400～4100m的高山草甸、高山冰碛石和流石滩石隙、悬崖峭壁石缝等处。那里气候多变，冷热无常，雨雪交替，最高月平均温3～5℃，最低月平均温-19～-21℃，年降水量约800毫米，无霜期仅有50天左右。
经过长期的自然选择，形成了稳定的特殊结构、功能和遗传基因，产生了适应极端环境条件下的生理和生化机制，这种与环境相适应的机制，与一般的耐冷、抗寒应答性的适应机制不同，主要表现在其低温条件下能够正常的生长发育，而一般的抗寒性植物在相应的低温条件下，生长发育受到抑制。近年来，随着植物生理、细胞和分子生物学理论和方法的日益完善，植物冷驯化和抗寒分子机理的研究取得了显著进展，植物抗寒基因工程也得到迅速发展，并研究出了多种转基因抗寒植物，为培育抗寒植物开辟了新途径。
雪莲生活在极端环境中，是一种极好的抗寒基因的资源，至今，国内外对雪莲抗寒基因的研究还未见文献报道。利用这种具有特色稀有植物，从中筛选、克隆出与抗寒直接相关的基因，揭示雪莲适应性的机制，研究其遗传基础，充分发掘其潜在的基因资源，并将其用于农作物品种改良，具有巨大的学术和经济价值。
发明内容
本发明的一个目的是为植物抗寒育种提供有价值的冷诱导脱水素基因sikDh，其发明的目还在于构建原核表达载体pTHIO-sikDh，表达出所需蛋白，制备抗体，并构建植物表达载体pCAMBIA2301-35S-sikDh，pCAMBIA2301-RD29a-sikDh，在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗寒性，通过该基因的过量表达，使植物的抗低温胁迫性能得到提高，最终获得抗(耐)低温能力明显增强的优良植物品种。
本发明的目的是通过以下过程和方法实现的本发明所述的从天山雪莲中克隆sikDh基因，其序列为<210>1。
本发明的从天山雪莲中克隆sikDh基因的过程如下构建天山雪莲富含全长的cDNA文库，随机挑取不少于96个单菌进行测序，运用生物信息学，通过BlastX和BlastN得到每个基因的预测信息；发现其中有一个冷响应相关的与water stress-induced protein，dehydrin-like gene，coldacclimation responsive protein有一定的同源性的基因，完成全序列测定，序列分析表明此基因全长693bp，5`非编码区74bp，3`非编码区274bp具有最大的开放阅读框(ORF)为345bp，编码一个115个氨基酸，分子量大小为12.6KD的高度亲水的蛋白，疏水性分析、其同源蛋白的序列分析，发现该类基因一般比较保守，对其氨基酸序列进行了蛋白质三维构象模拟；构建系统进化树，此基因与水稻中的具有较高的相似性，同时发现该蛋白具有核定位信号肽，在蛋白序列87号位，有11个氨基酸；sikDh基因原核表达载体的构建及表达sikDh与原核表达载体pTHIO-His(C)构建sikDh基因原核表达载体pTHIO-sikDh；sikDh基因植物表达载体构建构建两种植物表达载体一是组成型表达pCAMBIA 2301-35S-sikDh二是诱导型表达pCAMBIA 2301-RD29-sikDh利用上述基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化获得抗寒转基因植物以天山雪莲试管苗为实验材料，构建天山雪莲富含全长的cDNA文库，运用生物信息学，通过BlastX和BlastN得到每个基因的预测信息，发现其中有一个冷响应相关的与water stress-inducedprotein，dehydrin-like gene，cold acclimation responsive protein有一定的同源性的基因，完成全序列测定，获得sikDh基因全长cDNA序列，将它们构建成原核表达载体，制备抗血清及植物表达载体转化模式植物，检测转基因的抗寒的生理指标的变化情况，探讨与抗寒性之间的功能。
转基因株系在模拟抗寒胁迫48小时后，与未转基因株系相比，叶片相对电导率下降28.6％。在正常条件下，转基因株系的叶片净光合速率提高34.6％，总叶绿素含量提高了18.8％；模拟抗寒胁迫处理5天后，叶片净光合速率提高65.6％，总叶绿素含量提高了12.1％；处理10天后，叶片净光合速率提高71.6％，总叶绿素含量提高了7.4％。相对电导率和叶片净光合速率是衡量植物抗寒生理状态的重要指标。相对电导率越低，抗寒性能越强。而植株在寒害条件下总叶绿素含量提高，保持光合速率越高，抗寒能力越强。低温使叶绿素含量降低，随低温天数的增加叶绿素含量逐渐减少，低温对chlb的破坏较chla严重，导致chla/chlb的比值增大。转基因叶片的叶绿素含量均不同程度的高于对照，表明转基因对叶绿素有一定的保护作用，因而减缓了叶绿素在低温下的分解速度。在0-10℃处理7天后，转基因株系在形态上比未转基因株系明显健壮。
本发明不仅首次得到天山雪莲抗寒相关冷诱导脱水素基因sikDh，而且将其构建成的植物表达载体，在转基因系统中研究了该基因在提高植物耐低温性能中的重要功能。这对于揭示雪莲的抗寒机理，丰富植物抗寒分子生物学理论，提高植物的耐低温能力，具有重要的意义。
图1是sikDh基因原核表达载体的构建流程的示图。
图2是组成型植物表达载体pCAMBIA 2301-35S-sikDh的构建流程的示图。
图3是诱导型植物表达载体pCAMBIA 2301-RD29-sikDh构建流程的示图。
图4是重组植物表达载体pCAMBIA2301-35S-sikDh和pCAMBIA2301-RD29-sikDh转入农杆菌GV3101的鉴定。
图5是sikDh基因转化烟草的PCR检测。
图6是sikDh基因转化烟草的Southern Dot blot。
图7是sikDh基因转化烟草的Western Dot。
图8是sikDh基因转化烟草的实时荧光定量PCR。
图9是sikDh基因转化烟草的叶片质膜透性的测定。
图10是sikDh基因转化烟草在低温处理下的叶片净光合速率柱形图。
图11是sikDh基因转化烟草在盐胁追处理下的叶片叶绿素含量柱形图。
图4.中1PCR product of sikDh from pCAMBIA2301-35S-sikDh2PCR product of sikDh from pCAMBIA2301-RD29-sikDh3阳性对照图5中2c-，1c+，3-7PCR产物，MDL2000。
图8中A6room temperature treated(27℃)4hr；A7、A8、A94℃treated 4hr；A10-6℃treated 4hr。
图9中1、2、3transgenic selected Strains，WTwild type tobacco。
图10中1处理前，2处理后第2天，3处理后第5天，4处理后第10天测定的叶片净光合速率。
图11中1处理前，2处理后第2天，3处理后第5天，4处理后第10天测定的叶片叶绿素含量。
具体实施例方式实验所涉及的药品限制性内切酶购自大连Takara公司和上海sangon公司，Taq酶购自北京Tangen公司，T4 DNA连接酶购自北京Tangen公司和大连Takara公司；文库构建试剂盒CreatorTMSMARTTM cDNA Library Construction Kit(Catlog#K1053-1)是CLOTECH公司产品；RNA提取试剂盒RNeasyPlant Mini Kit(Cat.NO.74904)购于QIAGEN公司；DIG DNA Labeling and DetectionKit购自Roche公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自北京Tangen公司；IPTG、X-gal试剂及抗生素、植物激素购自上海Sangon公司。具体实验操作依据[美]J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔的《分子克隆实验指南》。
实施例1天山雪莲cDNA文库的构建运用Switching Mechanism At 5`end of the RNA Transcript(SMART)技术，构建了天山雪莲叶片全长的cDNA文库，原始文库滴度达3.23×105cfu/ml，文库插入片段多在1000bp左右。随机挑取10个克隆进行测序，通过生物信息学初步分析100％为全长cDNA，大部分可以在GenBank中找到同源序列。
1.1植物总RNA提取方法RNA提取试剂盒(RNeasyPlant Mini Kit)法(1)取不超过0.1g的植物材料，于研钵中快速用液氮研至粉末状，倒入2ml的离心管中；(2)加入450μl RLT buffer(1ml RLT buffer加10μlβ-ME，使用前加)旋转混匀(1-3min，56℃)(3)把溶解产物吸入QLA shredder spin column，然后放入2ml收集管中，13000rpm，2min，上清转入一新离心管中；
(4)加0.5体积无水乙醇，用吸管迅速混匀，继续下一步；(5)把上一步中的加到Rneasy mini column(pink)，然后放到2ml离心管中，10000rpm，15sec；(6)加700μl RW1 buffer，10000rpm，15sec；(7)把Rneasy mini column放入新的2ml收集管中，加500μL RPE buffer，10000rpm，15sec，弃液；(8)再加500μl RPE buffer，10000rpm，2min，弃液；(9)把Rneasy mini column放入一个新的1.5ml收集管中，吸50μL Rneasy-free-water，10000rpm，1min，然后可用或保存。
1.2 SDS法分离植物总DNA(1)称取0.1g植物叶片，于研钵中快速用液氮研至粉末状；(2)将粉末转入1.5ml离心管中，立即加入500μL DNA提取缓冲液；(3)混匀后加入20％SDS(W/V)50μL。轻轻混匀后于65℃水浴10min。
(4)加入250μL 5mol/LKAc于冰上反应30min，离心(11000rpm，10min)；(5)取上相转入一新的离心管，加入等体积(氯仿∶异戊醇＝24∶1)抽提一次，11000rpm，10min离心；(6)取上相转入一新的离心管，加入0.6倍体积异丙醇，充分混匀，置于冰上10min。离心(12000rpm，5min)，去上相；(7)用70％乙醇洗沉淀物，吹干，最后溶于100μ LTE溶液(pH8.0)中。
1.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶检测表达的蛋白制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶，方法如下按蛋白质电泳仪说明书装配制胶玻璃板。按分离蛋白质分子量的大小选配适当浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离胶，15％分离胶的配制如前(常用溶液配制1.5)轻轻混匀后，将凝胶注入两层玻璃板间，并留2cm左右的高度。加水封住凝胶，放在水平桌面上30-45min，让凝胶聚合。到出覆盖的水层，用滤纸吸干玻璃板中残余的水。配制5％的浓缩胶方法(常用溶液配制1.5)，轻轻混匀，倒于分离胶上，插入梳子，加入少量的水覆盖。同样静置30-45min.拔掉梳子，用ddH2O清洗点样孔。此时SDS-聚丙烯酰胺凝胶已制好。将其装入电泳槽中，上槽加满Tris-甘氨酸缓冲液，下槽加入Tris-甘氨酸缓冲液至没过下电极2-3cm处。
样品的处理1.分别收集50ml经IPTG诱导的pTHIO(C)-sikDh表达菌液和pTHIO(C)载体菌液、未经诱导的pTHIO(C)-sikDh菌液和pTHIO(C)载体菌液。8000rpm离心5分钟，弃上清，沉淀内加入8ml的1M的Tris缓冲液(PH8.0)，混匀，在37℃放置半个小时，再放入-20℃冰箱迅速冷冻，取出于37℃融化，再反复冻融。
2.化开后8000rpm离心5分钟，倒出上清，加5ml Tris-EDTA，5ml Triton-100，60μl溶菌酶，30℃，30min保温，超声波处理。
3.取出上清备用，沉淀加2ml，10mMol/lTris-Cl(PH8.0).分别取上清和沉淀15μl(沉淀要稀释)，加入5μl 1×SDS-PAGE上样缓冲液混匀，沸水中煮10min。
电泳将处理好的样品分别取上清和沉淀点入点样孔中。先用60V恒压电泳至样品层积带离开浓缩胶，然后用80V恒压电泳至上样缓冲液染料溴酚蓝刚离开分离胶。
染色电泳完毕，取出凝胶，切除层积胶，分离胶用考马斯亮蓝R-250染色液染色2-3hr脱色染过色的凝胶在脱色液中脱色3-4h，即可见分离的蛋白条带1.4目的蛋白的回收、纯化及抗血清的制备根据推测氨基酸的大小来推测目的蛋白的大小，经SDS-PAGE电泳后，回收目蛋白带，装入事先处理好的透析袋中(过量的NaHCO310mmol/l煮沸几分钟，随后在10mmol/l Na2EDTA中煮沸几分钟，最后蒸馏水冲洗干净，贮于20-50％乙醇中，4℃)。加入2ml，0.05mol/lPB缓冲液(PH7.4)夹子夹好，放入水平电泳槽中，120V电泳2小时。电泳完后，取出胶条，将透析袋放入生理盐水中，4℃透析过夜。透析完后，将袋中溶液吸出，装入1.5ml离心管中，置于-20℃，备用。
实施例2从天山雪莲中克隆到sikDh基因随机挑取96个单菌落送于北京华大基因公司进行测序，只测定5′区域，运用生物信息学，通过BlastX和BlastN得到每个基因的预测信息。其中一个与water stress-induced protein，dehydrin-like gene，cold acclimation responsive protein有一定的同源性，完成全序列测定。
序列分析表明此基因全长659bp，5`非编码区74bp，3`非编码区240bp具有最大的开放阅读框(ORF)为345bp，编码一个115个氨基酸，分子量大小为12.6KD的高度亲水的蛋白，疏水性分析、同源蛋白的序列分析，发现该类基因一般比较保守，对其氨基酸序列进行了蛋白质三维构象模拟；构建系统进化树，此基因与水稻中的具有较高的相似性。同时发现该蛋白具有核定位信号肽，在蛋白序列87号位，有11个氨基酸。
实施例3sikDh基因原核表达载体的构建及表达sikDh与原核表达载体pTHIO-His(C)的构建过程如图1所示。
实施例4构建sikDh基因植物表达载体构建两种植物表达载体一是组成型表达pCAMBIA 2301-35S-sikDh二是诱导型表达pCAMBIA 2301-RD29-sikDh
4.1组成型植物表达载体的构建(技术路线)如图2所示4.2诱导型植物表达载体的构建(技术路线)如图3所示我们选用了从拟南芥中克隆到的，启动能力很强的冷诱导启动子RD29a启动子。
在本实施方案中，我们选用烟草作为转基因植物材料，也可选用其它植物作为转基因材料。
在本实施方案中，sikDh基因被置于低温诱导型启动子RD29a的调控之下，再连至pCAMBIA2301，构成一个植物表达载体，用于植物的转化。根据本发明的这一实施方案，构建所选用的诱导型启动子除了RD29a之外，还可以选用其他诱导型启动子。
实施例5农杆菌的转化5.1农杆菌感受态的制备(1)挑取新鲜的E.coli DH5α或DH10B单菌落接种于10mL LB液体培养基中，37℃培养过夜；(2)按1/100的稀释比例接种于20mL液体LB中，继续培养至OD600约0.4左右；(3)菌液冰浴30min，分装于1.5mL无菌离心管中，6000rpm，4℃，10min离心，收集沉淀菌体；(4)细胞重悬于750μl冰预冷的无菌0.05Mol/LCaCl2中，6000rpm，4℃，10min离心，弃上清，收集菌体；(5)细胞重悬于600μl冰预冷的无菌CaCl2中，冰浴20min，6000rpm，4℃，10min离心，弃上清，收集沉淀菌体；(6)每管中加75μl冰预冷的无菌CaCl2重悬沉淀细胞；(7)制备好的感受态细胞，可现用，或-20℃保存，或-70℃保存。
5.2转化1)取2μl已鉴定好的质粒DNA，加入100μl农杆菌感受态细胞悬浮液，混匀，冰浴20min；2)于液氮中放置3-5min；2)37℃静止水浴热激2min；3)加入600μl LB液体培养基，混匀后，28℃水浴振荡4-5hr；4)取200μl转化液涂布在含相应抗生素的平板上，28℃恒温培养2d。挑取白色菌落作进一步筛选、鉴定。
5.3电转化感受态细胞的制备(1)挑取新鲜的E.coli DH5α或DH10B单菌落接种于10mL LB液体培养基中，37℃培养过夜；(2)按1/100的稀释比例接种于500ml液体LB中，继续培养至OD600约0.4左右；(3)菌液冰浴60min，分装于500ml无菌离心杯中，4000rpm，4℃，15min离心，收集沉淀菌体；(4)细胞重悬于500ml冰预冷的无菌10％甘油中，4000rpm，4℃，15min离心，弃上清，收集菌体；(5)细胞再重悬于250ml冰预冷的无菌10％甘油中，4000rpm，4℃，15min离心，弃上清，收集菌体；(6)细胞再重悬于200ml冰预冷的无菌10％甘油中，4000rpm，4℃，15min离心，弃上清，收集菌体；(7)离心杯中加3ml冰预冷的无菌10％甘油重悬沉淀细胞。
实施例6烟草遗传转化及再生在本实施方案中，植物表达载体导入农杆菌的方法为冻融法。冻融法为本领域技术人员非常熟悉的技术操作，不是本发明的关键。通过PCR检测阳性的农杆菌菌株，用于转化烟草。本发明中对于靶植物的转化方法不是关键，可以使用本领域技术人员所熟悉的各种不同的转化技术将重组DNA序列导入待转化的靶植物细胞。这些方法包括但不仅限于农杆菌侵染法，微粒轰击法，显微注射法，共沉淀法，电穿孔法，以及子房注射植物受精胚囊法等。
本方案中用于将转化细胞再生成植株的方法，可以使用适合于靶植物的方法。最好使被转化的序列稳定的整合到靶植物细胞的基因组中，从而使其在传代的过程中不被丢失。另外，用于转化靶植物的核苷酸序列可以以线性，环形或其它重组载体的形式如人工染色体的形式存在。
6.1冻融法转化农杆菌GV3101(1)将2μl质粒加入到100μl农杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，冰上放置20min；(2)于液氮中速冻5min，37℃温浴3min；(3)加入900μl不含抗生素的LB液体培养基，28℃轻摇5hr，8000rpm，2min，离心，富集菌体；(4)保留150μl菌液，混匀，均匀涂布于含500mg/LCb、50mg/L庆大霉素及Kan抗性的LB平板上，28℃倒置培养两天。
(5)挑取新鲜单菌落，进行PCR鉴定，筛选阳性克隆。
6.2农杆菌侵染吸取经鉴定呈阳性的农杆菌GV3101单菌落菌液，按1∶100接种到含100mg/LKan，500mg/L庆大霉素，100mg/L Kan的20mL液体LB培养基中，于28℃恒温摇床振荡培养约28hr，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释30倍左右。
6.3叶盘法转化烟草及再生(1)取烟草无菌叶片，用剪刀切成小块放入用无菌MS液体培养基稀释过的农杆菌GV3101，浸泡15min，取出用无菌滤纸吸去多余菌液，于MS固体培养基(不含抗生素)中25℃暗培养两天；
(2)把叶片转入含100mg/LKan和50mg/LCb分化培养基中，25℃光下培养诱导愈伤组织，生芽；(3)将长至1cm左右的芽转入生根培养基上诱导生根。
实施例7 转基因烟草的分子检测7.1 PCR初检反应体系及循环体系如图5所示ddH2O 12.5μl10×PCR Buffer 2μlMgCl21.2μldNTP(各2.5mM) 0.8μlP1+P2(各10μM) 1.2μl基因组DNA 2μlTagDNA聚合酶 0.3μlTotal 20μl
反应程序94℃预变性4min 72℃延伸7min反应结束后，用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，并回收阳性对照产物，置-20℃冰箱备用。
7.2烟草总DNA的分离、酶切用SDS法分离烟草总DNA作为模板，P1、P2为引物，进行PCR反应，初步筛选转基因植株。同时设阳性对照先前鉴定好的质粒DNA，PCR反应产物。阴性对照未转基因植株PCR产物。回收阳性对照PCR产物备用，经鉴定为阳性的烟草总DNA纯化后用HindIII酶切，37℃保温20hr后进行1％琼脂糖凝胶电泳5-6hr(1.5V/cm)；RDP1为<210>25`AAGCTTCGACTCAAAACAAACTTACGAA 3`Hind IIIRDP2为<210>3
5`CCATGGAATCAAACCCTTTATTCCTGA 3`Nco I酶切反应体系10×M Buffer 3μlHind III 1.5μl基因组DNA25.5μl
Total30μl7.3 Southern Dot分析如图6所示Southern Dot检测按Roche公司的DIG High Prime Labeling and Detec-tion Starter Kit试剂盒进行。
7.4 Southern blot检测探针制备(1)吸取16μl2.12.1回收产物于一洁净离心管，沸水加热10min后立即插入冰水中；(2)加入4μl DIG High Primer至上述离心管中，瞬时离心后，37℃温浴1-20hr；(3)取出离心管，65℃加热10min终止反应或加2μl 0.2M pH8.0的EDTA终止反应，置冰箱备用。
转膜及固定(1)将凝胶加样孔及不含样品的多余部分切掉，蒸馏水淋洗后，置于0.2mol/LHCl中摇动漂洗5min；(2)用蒸馏水淋洗后，浸于0.4mol/L NaOH变性液中室温变性30min，其间轻摇数次；(3)用蒸馏水淋洗后，浸于中和液中于室温中和30min，其间轻摇数次；(4)将一固体支持物置于盛有20×SSC缓冲液的浅盘中，上面铺一层Whatman 3mm滤纸，边缘浸于20×SSC缓冲液中，赶除滤纸与支持物间的气泡；(5)凝胶块切除一角作记号后背面朝上放于滤纸上，赶除气泡，用保鲜膜做一个窗口，使其恰好封住凝胶的四周；(6)剪一张略大于凝胶块的滤纸及尼龙膜，蒸馏水浸润后置于6×SSC中至少5min，剪去一角与凝胶块对应轻放于凝胶上，赶除气泡；(7)剪Parafilm封在凝胶四周，上面铺一张20×SSC浸润的Whatman 3mm滤纸，将吸水纸剪成略大于滤纸的纸块，置于滤纸上，使高约15cm，其上放一玻璃板，压一个500g左右重物，转膜8-24h，其间更换吸水纸一到两次；
(8)转膜结束后将尼龙膜夹在两层Whatman 3mm滤纸间。
(9)转好的膜放入紫外交联仪(UV-tratalinker)中，在能量为1500焦耳的情况下，对膜进行正反面交联。交联后放于干燥器中备用。
杂交与检测(1)吸64ml无菌ddH2O分两次加至DIG Easy Hyb(bottle7)中，立即在37℃搅拌5min；(2)37℃-42℃预热适量(10ml/100cm2)的DIG Easy Hyb；(3)将膜置于上述DIG Easy Hyb中，轻轻振荡30min；(4)将DIG-labeled DNA探针沸水变性5min，立即冰水冷却；(5)预热适量(3.5ml/100cm2)的DIG Easy Hyb，加入适量上述变性过的探针，充分混匀(注意尽量不要有气泡)；(6)倾去③中的预杂交液，换上⑤中的杂交液，41℃轻微振荡4hr或过夜；(7)将膜取出，用2×SSC，0.1％SDS于15-25℃洗膜两次，每次5min，轻轻振荡；(8)将膜取出，用0.5×SSC，0.1％SDS，于65-68℃洗膜两次，每次5min，轻轻振荡；(9)将膜置于100Washing buffer中，15-25℃轻轻振荡1-5min；(10)将膜置于100ml Blocking solution中，15-25℃轻轻振荡30min；(11)将膜置于20ml Antibody solution中，15-25℃轻轻振荡30min；(12)将膜置于100ml Washing buffer中，轻轻振荡洗涤两次，每次15min；(13)将膜置于20ml Detection buffer中，平衡2-5min；(14)将膜置于10ml现配的显色液中显色，显色反应最好静置于暗处完成；(15)当预期的条带出现，用50ml ddH2O或TE洗膜终止反应。
(16)将膜封存于装有TE的塑料袋中，可长期保存。
7.5实时荧光定量PCR如图8所示所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图，分析处理和未处理该基因的表达情况。
7.6 Western(dot)blot分析如图7所示抗血清的制备(1)大量收集原核表达产物，进行SDS-PAGE电泳，把胶放入预冷的0.25mol/L KCl，1mmol/LDTT溶液中，4℃过夜，切下目的条带，装入透析袋中，在有0.05mol/L PB(PH7.4)缓冲液的水平电泳槽中，120V电泳2个小时，取出胶条，吸出25μl重新进行SDS-PAGE电泳，检查回收的目的条带，同时算出蛋白的含量。把透析袋放入足够量的0.8％的生理盐水中，4℃透析24小时。其间可换几次生理盐水。透析完后，将袋中蛋白溶液转入离心管中，放于-20℃，备用。
(2)在样品加入等体积复氏不完全佐剂(1.5g羊毛脂和8ml石蜡油)和卡介苗，置乳化器中乳化；(3)对兔子进行皮下多点免疫，共免疫三次，每隔9天一次，每次1ml，(4)从第三次免疫5天后，进行心脏采血，所采血液离心后所得上清即为多克隆一抗；植物蛋白的提取(1)取0.2g抗性植株及一非转化植株新鲜叶片，加入500μl植物蛋白提取缓冲液，用玻棒充分研磨；(2)4℃，12000rpm×20min；(3)吸取400μl上清，加2V的丙酮，冰浴1hr，4℃，2500rpm×3min；(4)弃尽上清，除去残存的丙酮，用50μl ddH2O溶解蛋白，置-20℃备用；电泳在上述蛋白样品中加入50μl 2×SDS上样缓冲液，100℃煮沸10min，以非转化烟草为阴性对照进行SDS-PAGE电泳，电泳分离胶浓度为15％，浓缩胶浓度为5％，电压60V，电泳3-4hr。
免疫分析(1)电泳完毕，剥下胶，切除浓缩胶，并切除一角做标记，置转移液中平衡30min；(2)同时准备6张滤纸，1张硝酸纤维素膜(NC膜)，均与胶同样大小，同样在膜上切除一角与胶对应，将膜在转移液中平衡15min，滤纸用前浸湿即可；(3)i3层滤纸、NC膜、3层滤纸(每放一层必须赶尽气泡)，电压30V转移90min；(4)将膜取出，置热密封袋中，加入50ml封闭液，37℃封闭3hr；(5)倾去封闭液，加入50ml用封闭液稀释的第一抗体(1∶500)，37℃温浴3hr；(6)将膜取出置一干净培养皿中，用TBS洗3次，每次15min；(7)将膜转入热密封袋中，加入用封闭液稀释的酶标第二抗体(1∶1000)，37℃温浴3hr；(8)同步骤(6)；(9)将膜置于显色液中显色。
实施例8转基因植株的模拟寒害处理及叶片质膜透性测定两种类型的转基因植株被鉴定后，通过无性繁殖获得无菌苗，在MS培养基上生根后。植株成活后选取生长一致的苗(5-7叶期)，进行模拟寒害处理。分别用打孔器从叶片中打取小圆片测定叶片质膜透性。如图9所示。
实施例9转基因植株的模拟寒害处理叶片叶绿素含量和光合速率的测定两种类型的转基因植株被鉴定后，通过无性繁殖获得无菌苗，在MS培养基上生根后。植株成活后选取生长一致的苗(5-7叶期)，进行模拟寒害处理以-9℃-10℃，每间隔2-3℃为一个处理。处理前、处理2天、5天后，7-10天，对每个株系植株第3-5位展开叶，用Lc-6400测定净光合速率，每处理重复3次。
第3-5位叶避开叶脉打取小圆片5片，放入研钵中，加CaCO3少许，加80％的丙酮，匀浆，定容至10mL。3000rpm离心10min。取上清，测定470、646.8、663.2、750nm处的吸光值，计算叶绿素含量。如图10、11所示。
序列表<110>石河子大学<120>天山雪莲sikDh基因在培育抗寒植物中的应用<160>3<210>1<211>659<212>DNA<213>天山雪莲(Saussurea.involucrata Kar.et Kir.)<220>
<221>5’UTP<222>(1)...(74)<220>
<221>CDS<222>(75)...(419)<220>
<221>3，UTP<222>(420)...(659)<400>1Translation of DNAMAN2(75-419)Universal codeTotal amino acid number114，MW＝12568Max ORF starts at AA pos 25(may be DNA pos 75)for 114 AA(342 bases)，MW＝135831 ggggaaacca aatcaaaact catctcatta cagatactta cctttgatta atccctttga70 8090 100 11011961aaccgatcat caaa atg gcc gga atc ata aac aag atc gga gat gca ctc cac atc gga20 Met Ala Gly Ile Ile Asn Lys Ile Gly Asp Ala Leu His Ile Gly130 140 150 160 170 179
120ggc ggt aac aag gag gag gac aag aag cac gaa ggc gac tac aag tct gac cag aagaaa40 Gly Gly Asn Lys Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Gly Asp Tyr Lys Ser Asp Gln Lys Lys190200 210 220 230 239180cac gaa ggt gat cac tct gcg tac gat cag aag aag cac gaa ggt gag tac aag tccgac60 His Glu Gly Asp His Ser Ala Tyr Asp Gln Lys Lys His Glu Gly Glu Tyr Lys Ser Asp250 260 270 280 290 299240cac aag ccg gag cac aaa gaa ggc atc gct gat aag atc aag gac aag atc cac ggt gga80 His Lys Pro Glu His Lys Glu Gly Ile Ala Asp Lys Ile Lys Asp Lys Ile His Gly Gly310 320 330 340 350 359300gat ggc gaa agc aaa gaa cac tgc ggc gaa ggt gag aag aaa aag aag aag gag aagaag100Asp Gly Glu Ser Lys Glu His Cys Gly Glu Gly Glu Lys Lys Lys Lys Lys Glu Lys Lys370 380390400 410 419360aag aag aag gac ggc gat cac cac gac ggc ggc agc agc agc agc agc gac agc gattag120Lys Lys Lys Asp Gly Asp His His Asp Gly Gly Ser Ser Ser Ser Ser Asp Ser Asp***430 440 450 460 470420agctccttga tcgttcaccc tcttcgatct cgaatcgatg ggaggcatgt acgagacaga481gagctttcat acgttttagt atgcttttcg gttggtgaaa taaatatgta ataaaaaaca541gtaaaagaaa atagaaaatg aaaaaaccga gagttacgga atgttgctta atccataacc601tatggaagta ttgatgtaat tgctattgac atggtggaat gaagttcagt gatttgtctg<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2cgactcaaaacaaacttacgaa<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3aatcaaaccctttattcctga
权利要求
1.一种从天山雪莲中克隆sikDh基因，其特征在于其序列为<210>1。
2.一种从天山雪莲中克隆sikDh基因的方法，其特征在于过程如下构建天山雪莲富含全长的cDNA文库，随机挑取不少于96个单菌进行测序，运用生物信息学，通过BlastX和BlastN得到每个基因的预测信息；sikDh基因原核表达载体的构建及表达sikDh与原核表达载体pTHIO-His(C)构建sikDh基因原核表达载体pTHIO-sikDh；构建sikDh基因两种植物表达载体一是组成型表达pCAMBIA 2301-35S-sikDh；二是诱导型表达pCAMBIA 2301-RD29-sikDh。
3.一种从天山雪莲中克隆序列为<210>1的sikDh基因的用途，其其特征在于利用上述基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化获得抗寒转基因植物。
全文摘要
本发明涉及一种天山雪莲sikDh基因在培育抗寒植物中的应用，本发明从天山雪莲中克隆sikDh基因并构建天山雪莲富含全长的cDNA文库，随机挑取不少于96个单菌进行测序，运用生物信息学，通过BlastX和BlastN得到每个基因的预测信息，利用上述基因构建植物表达载体，通过农杆菌介导法遗传转化获得抗寒转基因植物。本发明从天山雪莲中克隆sikDh基因，并在转基因植物中得到表达，提高转基因植物的抗寒性，通过该基因的过量表达，使植物的抗低温胁迫性能得到提高，最终获得抗低温能力明显增强的优良植物品种，对于揭示雪莲的抗寒机理，丰富植物抗寒分子生物学理论，提高植物的耐低温能力，都具有重要的意义。
文档编号C12N15/82GK101092625SQ20071008995
公开日2007年12月26日 申请日期2007年3月23日 优先权日2007年3月1日
发明者祝建波, 刘海亮, 张煜星, 崔百明, 王爱英 申请人:石河子大学