专利名称：雪莲多倍体的诱导方法
技术领域：
本发明涉及一种雪莲多倍体的诱导方法背景技术新疆雪莲Saussurea involucrata Kar et Kir.系菊科凤毛菊属的高山草本植物，又名天山雪莲，雪莲花，雪荷花，主要分布于新疆天山和阿尔泰山一带以及俄罗斯，蒙古，哈萨克斯坦等地，在天山，它主要生长在海拔2400-4100m的高山草甸，流石滩石隙等处，生存的条件恶劣。现代药理研究表明雪莲具有抗炎镇痛、抗癌、扩张血管、降血压、清除自由基、抗疲劳、终止妊娠和收缩子宫等作用。雪莲次生代谢产物成分复杂，具有药用活性的化合物主要集中在黄酮、生物碱和多糖类，是我国中药中的珍稀名贵药材。由于雪莲的药用和保健作用被广泛认识，雪莲的市场需求量大增，因此野生雪莲乱采滥挖现象十分严重，加之人工栽培困难，雪莲已被列为国家2级濒危物种而受到保护！！雪莲的组织培养虽然已有不少报道，但是在诱导多倍体方面未见报道。本方法结合组织培养技术，通过多倍体的研究为获得药用成分含量高，耐候性好的的雪莲多倍体新品种提供技术。
多倍体植物在自然界中是普遍存在的，它们在生理上较二倍体有更强的适应性和遗传上有较大的可塑性。四倍体植株与二倍体植株相比，茎略粗，叶片色泽较深，叶脉明显，花较大，叶型较宽短，营养成分含量显著提高，器官加大，药用活性成分的含量增加！！同时增强了多倍体植株的生态适应性及对逆境的抗逆性！形成多倍体的细胞学机制细胞分裂是从核开始的，当核内染色体正在分裂，而整个细胞还没有开始分裂时，外界条件发生剧烈变化，造成细胞质分裂暂时终止，抑制纺锤丝的形成，核内的染色体则照常进行复制，但不能拉向两极，使全部子染色体包括在同一细胞中，当外界条件影响消失后，细胞再继续分裂时，核内的染色体已增加了一倍，形成了多倍性细胞。
多倍体诱导中，诱导材料的选择主要有愈伤组织，不定芽，茎尖，种子，子叶和叶片，根部等。
多倍体的主要特征(1)巨大性体现在叶宽，茎粗大，花朵大等器官增大的特征；(2)多倍体植株的生长发育一般比二倍体慢；(3)多倍体植株的不育性；(4)次生代谢成分增加。
多倍体的鉴定(1)形态鉴定法多倍体植株的巨大性为其早期形态学鉴定的依据；(2)气孔鉴定法气孔随染色体数量的加倍而增加体积，单位面积内气孔的数量随着染色体数量的加倍而减小。例如四倍体气孔长度明显大于二部体气孔长度，气孔增大，而单位面积气孔数量减少；(3)花粉粒鉴定法花粉粒大小与染色体的数量成正比；(4)染色体数目鉴定可以通过检查花粉母细胞或根尖，茎尖细胞内染色体是否加倍，这是最基本也是最可靠的鉴定方法；(5)流式细胞仪鉴定流式细胞仪分析法可迅速测定细胞核内DNA的含量和细胞核大小，是大范围实验中鉴定倍性的快速有效的方法。
目前人工诱导多倍体的方法分为物理方法，生物技术方法和化学方法。
物理方法可以诱导多倍体的物理方法有温度的激变、机械创伤、离心力、紫外线、x射线和渗透压的改变，但这些方法的普遍缺陷就是嵌合率高，危害性大(射线)，诱导率低，诱变率仅在0.1％-1％之间。化学药剂的使用完全取代了利用物理手段来获得多倍体，上述方法已不常使用。
生物技术方法包括体细胞融合和远缘杂交获得多倍体，生物技术诱导多倍体，尚处于初步的探索阶段，技术还不够成熟，但前景广阔。
化学方法可以诱导多倍体的化学药剂很多，如秋水仙素、吲哚乙酸、萘骈乙烷、芫荽脑、苯及其衍生物、有机砷制剂、磺胺剂、藜芦碱及其它植物碱、麻醉剂和生长素等不下二百种，但使用最多，最有效的为秋水仙素。
化学诱导的方法可分为原位诱导法和离体诱导法。
原位诱导法是也叫活体诱导法，即把供试植物的种子、正在生长的幼苗、茎尖等在非离体条件下用不同浓度的诱变剂处理，从而诱导染色体加倍。这是早期采用的一种多倍体诱导的方法，取得了一定的成效，现在仍然在一些植物上使用。原位诱导法包括浸渍法、注射法、琼脂法、滴液法等。例如浸根法就是将植株从土壤中拔出来，洗净根部泥土.然后将根浸泡在一定浓度秋水仙素溶液中一定时间.流水洗净根部的药液后，再把植株栽到土中；浸种法就是运用秋水素溶液直接浸泡种子；琼脂法为在茎尖，子叶等处用含有秋水仙素的琼脂做诱导处理。
离体诱导法是通过组织培养，在离体水平上诱导细胞内染色体加倍，然后获得再生多倍体植株。选用的诱变材料通常有离体的茎尖、叶片、愈伤组织、胚状体、原生质体、子房等，具有诱导率高、重复性强、实验条件易于控制、获得的多倍体嵌合率低等优势，但受植物再生频率低的限制。离体培养较之原位培养具有下面的四点最突出优点(1).效率高(2).鉴定方便(3).减少嵌合体(4).试验条件易控制。因此目前离体培养在多倍体诱导中普遍采用。
多倍体诱导中有待解决的问题(1)秋水仙素的毒害作用秋水仙素有剧毒，对外植体有毒害作用.秋水仙素的毒害作用主要体现在诱导材料死亡，抑制根的生长和种子的萌发，抑制不定芽分化，再生植株生长缓慢或者生长停滞。目前可通过缩短继代时间，增加继代次数，使得外植体释放体内积累的秋水仙素。(2)嵌合体现象这种现象的产生是由于在处理过程中，并不是全部分生细胞的染色体数都同样的加倍，有可能是某些细胞加倍了，而有的细胞没加倍。目前国内有报告采用不定芽技术，对多倍体进行稳定，从而大大提高了多倍体细胞的比率，如郑思乡等(1995)采用不定芽诱导技术对苎麻多倍体进行稳定，稳定效果很好，获得的四倍体细胞高达94％。这是因为不定芽一般由一个或几个表皮细胞发育而来，若这部分细胞是多倍体，则形成的不定芽即为完全多倍体。
目前国内多种药用植物通过各种方法都得到了多倍体植株，但雪莲多倍体的诱导未见报道。本方法针对雪莲特殊的生理特性，结合组织培养技术，在多倍体诱导方面，对诱导材料的选择，处理，加以改进促进多倍体的诱导率得到提高，从而得到了雪莲多倍体植株。
发明内容
本发明的目的是通过雪莲种子萌发产生无菌苗，然后将无菌苗根部、叶片切除，茎干部分接种于添加有二甲基亚砜和秋水仙素的出芽诱导培养基上进行诱导后，再转移到不含二甲基亚砜和秋水仙素的出芽诱导培养基上进行诱导出芽，然后对无菌苗的茎尖生长点做染色体检测以确定染色体的倍性，从而得到了雪莲多倍体植株。
本发明所述的雪莲多倍体的诱导方法按下列步骤进行a、将雪莲种子先用75％乙醇表面消毒20sec-50sec，然后用0.1％HgCl2溶液消毒7min-15min，接着用15％H2O2溶液消毒30min-50min，将消毒后的种子用灭菌水漂洗4-7次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种10-15粒种子，7-10天后雪莲种子萌发产生无菌苗；b、选择生长30d-50d的无菌苗，将其根部、叶片完全切除，仅保留茎干部分；c、将切割后保留下来的无菌苗茎干部分接种于添加有二甲基亚砜2％-5％，秋水仙素浓度为100-500mg·L-1的出芽诱导培养基上，诱导2d～4d，出芽诱导培养基配方为MS+6-BA 0.1-0.9mg·L-1+TDZ0.3-1.1mg·L-1；d、无菌苗茎干诱导2d-4d后，转移到不含秋水仙素与二甲基亚砜的出芽诱导培养基MS+6-BA 0.1-0.9mg·L-1+TDZ0.3-1.1mg·L-1上诱导出芽，20天后，经过秋水仙素处理的无菌苗茎干部分抽出新生芽，植株外观与对照苗差异显著，然后对新生芽的茎尖生长点做染色体检测以确定染色体的倍性；e、染色体的检测切取新生芽茎尖生长点，先置蒸馏水中于0-4℃冰箱处理12hr-24hr，然后转移到0.002mol·L-18-羟基喹啉溶液处理6hr-12hr，接着用卡诺氏固定液为(乙醇∶冰乙酸＝3∶1)室温下固定12-24hr，用蒸馏水漂洗后，在58℃1mol·L-1HCL溶液中解离处理10min-15min，再用45％乙酸软化5min-15min，之后再用蒸馏水洗净，将其置于改良苯酚品红溶液中染色10min-30min，压片，最后在显微镜下镜检观察即可。
本发明所述的雪莲多倍体的诱导方法，与传统的秋水仙素处理茎尖生长点不同，传统方法一类是采用秋水仙素点滴，涂抹茎尖生长点，但由于雪莲无菌苗的茎尖生长点深埋于茎干下部，难以用这些方法处理，且这些方法也不利于与组织培养相结合，使得在获得多倍体苗后，通过组织培养方法进行扩繁；另一类是采用将茎段直接插入培养基中，但是基本上要保留叶片，或者保留根部。本发明对由种子产生的无菌苗采取根叶完全切除，仅保留茎干的处理，抑制原有叶片与根部的生长，同时在细胞分裂素的作用下，能够充分刺激茎尖生长点的分裂，促进直接出芽，并且在二甲基亚砜(DMSO)的渗透作用下，更有利于秋水仙素作用于旺盛分裂的茎尖生长点细胞，提高四倍体细胞比例与多倍体植株的获得率。本方法苗的诱导成活率高，植株体现出显著的多倍体特征，并经过染色体检测证明了该方法获得了多倍体雪莲苗，茎尖生长点细胞的染色体数量由2n＝2x＝32(图7)转变为2n＝4x＝64(图8)，多倍体雪莲的诱导率(诱导率＝多倍体植株株数/处理的雪莲苗株数)最高达到33％。
参见附1为本发明雪莲无菌苗处理图，其中A生长30-50天的雪莲无菌苗，B根叶完全切除后，保留下来的茎干部分。
图2为本发明没有加入秋水仙素的对照图。
图3为本发明加入秋水仙素100mg·L-1处理2d后得到多倍体植株图。
图4为本发明加入秋水仙素300mg·L-1处理3d后得到多倍体植株图。
图5为本发明加入秋水仙素400mg·L-1处理3d后得到多倍体植株图。
图6为本发明加入秋水仙素500mg·L-1处理4d后得到多倍体植株图。
图7为本发明二倍体雪莲染色体数目为32条图2n＝2x＝32图8为本发明四倍体雪莲染色体数目为64条图2n＝4x＝具体实施方式
实施例1将雪莲(S.involucrata)种子先用75％乙醇表面消毒20sec，然后用0.1％-HgCl2溶液消毒7min，接着用15％H2O2溶液消毒30min，将消毒后的种子用灭菌水漂洗4次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种10粒种子，7天后雪莲种子萌发产生无菌苗；选择生长30d的无菌苗30株，将其根部、叶片完全切除，仅保留茎干部分；将切割后保留下来的无菌苗茎干部分接种于添加有二甲基亚砜(DMSO)为2％，秋水仙素浓度为100mg·L-1的出芽诱导固体培养基上，诱导2d，出芽诱导固体培养基配方为MS+6-BA 0.1mg·L-1+TDZ0.3mg·L-1；无菌苗茎干诱导3d后，转移到不含秋水仙素的出芽诱导固体培养基MS+6-BA 0.1mg·L-1+TDZ0.3mg·L-1上诱导出芽，20天后，经过秋水仙素诱导的无菌苗茎干部分长出新生芽，与对照株相比，叶片短小，植株矮小，生长缓慢，然后对新生芽的茎尖生长点做染色体检测以确定染色体的倍性；染色体的检测切取新生芽茎尖生长点，先置蒸馏水中于0℃冰箱处理12hr，然后转移到0.002mol·L-18-羟基喹啉溶液处理6hr，接着用卡诺氏固定液(乙醇∶冰乙酸为3∶1)室温下固定12hr，用蒸馏水漂洗后，在58℃1mol·L-1HCL溶液中解离处理10min，再用45％乙酸软化5min，再用蒸馏水洗净，将其置于改良苯酚品红溶液中染色10min，压片，最后在显微镜下镜检观察，无菌苗经过100 mg·L-1的秋水仙素处理2d后，多倍体的诱导率达到33％(诱导率＝多倍体植株株数/30)。
实施例2将雪莲种子先用75％乙醇表面消毒30sec，然后用0.1％HgCl2溶液消毒10min，接着用15％H2O2溶液消毒40min，将消毒的种子用灭菌水漂洗5次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种12粒种子，8天后雪莲种子萌发产生无菌苗；选择生长35d的无菌苗30株，将其根部、叶片完全切除，仅保留茎干部分；将切割后保留下来的无菌苗茎干部分接种于二甲基亚砜3％，秋水仙素浓度为300mg·L-1的出芽诱导培养基上，诱导3d，出芽诱导固体培养基配方为MS+6-BA 0.3mg·L-1+TDZ0.6mg·L-1；无菌苗茎干诱导3d后，转移到不含秋水仙素的MS+6-BA 0.3mg·L-1+TDZ0.6mg·L-1出芽诱导固体培养基上诱导出芽，20天后，经过秋水仙素诱导的无菌苗茎干部分长出新生叶，与对照株相比，叶片短小，植株矮小，生长缓慢，然后对新生叶的茎尖生长点做染色体检测以确定染色体的倍性；染色体的检测切取新生叶茎尖生长点，先置蒸馏水中于1℃冰箱处理15hr，然后转移到0.002mol·L-18-羟基喹啉溶液处理8hr，接着用卡诺氏固定液(乙醇∶冰乙酸为3∶1)室温下固定15hr，用蒸馏水漂洗后，在58℃1mol·L-1HCL溶液中解离处理12min，再用45％乙酸软化10min，再用蒸馏水洗净，将其置于改良苯酚品红溶液中染色15min，压片，最后在显微镜下镜检观察，无菌苗经过300mg·L-1的秋水仙素处理3d后，多倍体的诱导率达到7％(诱导率＝多倍体植株株数/30)。
实施例3雪莲(S.involucrata)种子先用75％乙醇表面消毒35sec，然后用0.1％HgCl2溶液消毒10min，接着用15％H2O2溶液消毒45min，将消毒的种子用灭菌水漂洗6次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种13粒种子，9天后雪莲种子萌发产生无菌苗；选择生长40d的无菌苗30株，将其根部、叶片完全切除，仅保留茎干部分；将切割后保留下来的无菌苗茎干部分接种于添加二甲基亚砜4％，秋水仙素浓度为400 mg·L-1的出芽诱导培养基上，诱导3d，出芽诱导固体培养基配方为MS+6-BA 0.6mg·L-1+TDZ0.8mg·L-1；无菌苗茎干诱导3d后，转移到不含秋水仙素的MS+6-BA 0.6mg·L-1+TDZ0.8 mg·L-1出芽诱导固体培养基上诱导出芽，20天后，经过秋水仙素诱导的无菌苗茎干部分长出新生芽，与对照株相比，叶片短小，木质化程度高，植株矮小，生长缓慢，然后对新生芽的茎尖生长点做染色体检测以确定染色体的倍性；染色体的检测切取新生芽茎尖生长点，先置蒸馏水中于2℃冰箱处理20hr，然后转移到0.002mol·L-18-羟基喹啉溶液处理10hr，接着用卡诺氏固定液(乙醇∶冰乙酸为3∶1)室温下固定20hr，用蒸馏水漂洗后，在58℃1mol·L-1HCL溶液中解离处理14min，再用45％乙酸软化12min，再用蒸馏水洗净，将其置于改良苯酚品红溶液中染色20min，压片，最后在显微镜下镜检观察，无菌苗经过400mg·L-1的秋水仙素处理3d后，多倍体的诱导率达到10％(诱导率＝多倍体植株株数/30)。
实施例4雪莲种子先用75％乙醇表面消毒50sec，然后用0.1％HgCl2溶液消毒15min，接着用15％H2O2溶液消毒50min，将消毒的种子用灭菌水漂洗7次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种15粒种子，10天后雪莲种子萌发产生无菌苗；选择生长50d的无菌苗30株，将其根部、叶片完全切除，仅保留茎干部分；将切割后保留下来的无菌苗茎干部分接种于添加二甲基亚砜5％，秋水仙素浓度为500mg·L-1的出芽诱导固体培养基上，诱导4d，出芽诱导固体培养基配方为MS+6-BA 0.9mg·L-1+TDZ1.1mg·L-1；无菌苗茎干诱导4d后，转移到不含秋水仙素的MS+6-BA 0.9mg·L-1+TDZ1.1mg·L-1出芽诱导固体培养基上诱导出芽，20天后，经过秋水仙素诱导的茎干部分长出新生芽，与对照株相比，叶片短小，植株矮小，生长缓慢，然后对新生芽的茎尖生长点做染色体检测以确定染色体的倍性。
染色体的检测切取新生芽茎尖生长点，先置蒸馏水中于4℃冰箱处理24hr，然后转移到0.002mol·L-18-羟基喹啉溶液处理12hr，接着用卡诺氏固定液(乙醇∶冰乙酸为3∶1)室温下固定24hr，用蒸馏水漂洗后，在58℃1mol·L-1HCL溶液中解离处理15min，再用45％乙酸软化15min，之后再用蒸馏水洗净，将其置于改良苯酚品红溶液中染色30min，压片，最后在显微镜下镜检观察，显微镜下观察发现，无菌苗经过500mg·L-1的秋水仙素处理4d后，多倍体的诱导率达到7％(诱导率＝多倍体植株株数/30)。
权利要求
1.一种雪莲多倍体的诱导方法，其特征在于该方法按下列步骤进行a、将雪莲种子先用75％乙醇表面消毒20sec-50sec，然后用0.1％HgCl2溶液消毒7min-15min，接着用15％H2O2溶液消毒15min-50min，将消毒后的种子用灭菌水漂洗4-7次，再播种于MS培养基上，每瓶MS培养基播种10-15粒种子，7-10天后雪莲种子萌发产生无菌苗；b、选择生长30d-50d的无菌苗，将其根部、叶片完全切除，仅保留茎干部分；c、将切割后保留下来的无菌苗茎干部分接种于添加有二甲基亚砜2％-5％，秋水仙素浓度为100-500mg·L-1的出芽诱导培养基上，诱导2d～4d，出芽诱导培养基配方为MS+6-BA 0.1-0.9mg·L-1+TDZ0.3-1.1mg·L-1；d、无菌苗茎干诱导2d-4d后，转移到不含秋水仙素与二甲基亚砜的出芽诱导培养基MS+6-BA 0.1-0.9mg·L-1+TDZ0.3-1.1mg·L-1上诱导出芽，20天后，经过秋水仙素处理后的无菌苗茎干部分抽出新生芽，植株外观与对照苗差异显著，然后对新生芽的茎尖生长点做染色体检测以确定染色体的倍性；e、染色体的检测切取新生芽茎尖生长点，先置蒸馏水中于0-4℃冰箱处理12hr-24hr，然后转移到0.002mol·L-18-羟基喹啉溶液处理6hr-12hr，接着用卡诺氏固定液为乙醇∶冰乙酸＝3∶1室温下固定12-24hr，用蒸馏水漂洗后，在58℃1mol·L-1HCL溶液中解离处理10min-15min，再用45％乙酸软化5min-15min，之后再用蒸馏水洗净，将其置于改良苯酚品红溶液中染色10min-30min，压片，最后在显微镜下镜检观察即可。
全文摘要
本发明涉及一种雪莲多倍体的诱导方法，该方法是针对雪莲特殊的生理特性，通过雪莲种子萌发产生无菌苗，然后将切除根叶后保留下来的无菌苗茎干部分接种于添加有二甲基亚砜和秋水仙素的出芽诱导培养基上进行诱导后，再转移到不含二甲基亚砜和秋水仙素的出芽诱导培养基上进行诱导出芽，经过秋水仙素处理的无菌苗抽出新芽，植株外观与对照苗差异显著，然后对无菌苗的茎尖生长点做染色体检测以确定染色体的倍性，从而得到了雪莲多倍体植株。
文档编号C12Q1/68GK101019508SQ20071008925
公开日2007年8月22日 申请日期2007年3月19日 优先权日2007年3月19日
发明者张蜀敏, 王晓军, 郝秀英, 徐琴 申请人:中国科学院新疆理化技术研究所