专利名称：利用农杆菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的转化效率的方法
技术领域：
本发明涉及一种利用农杆菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的转化效率的方法。
背景技术：
农杆菌介导法是目前研究机理最清楚，应用最广泛的转基因方法{吴霞，焦改丽等.棉花农杆菌介导转化机理及研究进展[J].山西农业科学，2001，29(1)27～30；付永彩等.农感菌介导的禾本科作物遗传转化新进展[J].生物技术学报，1999，10(3)1～5；Stanton B，Gelvin，Agrobacterium-Mediated Plant Ttansformationthe Biology behind the“Gene-Jockying”Tool[J].Microbiology and Molecular Biology reviews，2003，16-37}。由于其可借助于农杆菌及植物的酶系统，实现高频率的自主转化，因而一直是研究的热点之一{Michielse CB，et al.Agrobacterium-Mediated Transformation of Aspergillus awamori in the Absence ofFull-Length VirD2，VirC2，or VirE2 Leads to Insert ion of Aberrant T-DNA Structures.JBacteriol.2004，186(7)2038-2045；K Wang，A Herrera-Estrella，and M Van Montagu.Overexpression of virD1 and virD2 genes in Agrobacterium tumefaeiens enhances T-complexformation and plant transformation.J Bacteriol，1990，172(8)4432-4440；Yumin Tao etal.Expression of plant protein phosphatase 2C interferes with nuclear import of theAgrobacterium T-complex protein VirD2[J].PNAS，2004，101(14)5164-5169；G Hansen，A Das，and M D Chilton.Constitutive expression of the virulence genes improves theefficiency of plant transformation by Agrobacterium[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1994，91(16)7603-7607；杨清，陈敏，文锋.T-D N A转移的寄主植物细胞因子.植物生理学通讯[J]，2004，40(4)521-526.}。其T-DNA转移和整合过程概述如下在农杆菌中，当vir区基因系统激活后，VirD操纵子内的结构基因表达，对T-DNA进行加工剪切。首先有拓扑异构酶I活性virD1蛋白与Ti质粒结合，使其松驰。virD2作为一种位点特异性的核酸内切酶，在T-DNA的25bp边界序列内，对T-DNA进行剪切，产生T-DNA单链。virD2蛋白第29位的酪氨酸通过芳香环上的羟基与切开的DNA的5’端磷酸以共价链结合，接着以类似于细菌接合转移过程的方式将T-DNA与virD2蛋白组成的复合物转入植物细胞。在这个过程中，T-DNA与许多的VirE2蛋白分子(DNA单链结合蛋白，无结合特异性)相结合，形成T链复合物之后，这一复合物在VirD2和VirE2双向核定位信号(NLS)引导下，以virD2蛋白为先导转运进入植物的细胞核。virD2蛋白具有体外连接酶活性，推测参与了T-DNA 5’端同植物基因组DNA的连接{Tinland B.et al.TheAgrobacterium tumefaciens VirD2 Protein virulence D2 protein is responsible for preciseintegration of T-DNA into the plant genome[J].EEO J.1995.143585_3595}。Shurvinton等{Shurvinton CE et al.Nucleear localization signal and the Cterminal omega sequencein the Agrobacterium tumefaciens VirD2 endonuclease are important for tumorformation[J].Proc Nat Acad Sci USA，1992，8911837-11841}发现，在VirD2区的羧基端附近存在一个保守区域，称为ω区。这个区域的缺失或取代突变会使转化植株数即稳定遗传的植株数减少大约两个数量级。因此，VirD2在T-DNA向植物基因组整合过程中可能起重要作用。研究表明{方进，翟文学，王文明等.转基因水稻T-DNA侧翼序列的扩增与分析[J].遗传学报，2001，28(4)345-351；Hiei Y，el aL，Efficient transformation of rice(Orzu sutivu J)mediated by Agrobacteriumand sequence analysis of the Boundaries of the T-DNA[J].The Plant Journal 1994，6(2)271-282；Mysore KS.Nam J.Gelvia SB.An Arabidopsis histore H2A mutantis deficient inAgrobacterium T-DNA integration[J].proc.Natl.Acad.Sci，2000，97948-953.}T-DNA优先整合到转录活跃区，转入细胞核的T-DNA多以单拷贝的形式随机整合到植物染色体上，其转化后转录活性相对也较高。
花粉管通道转化法与它最大不同在于，转入到植物细胞中的DNA，没有核定位信号引导，不能实现自主整合。由于以裸露形式存在，容易被细胞内外的核酸酶降解，这可能是该方法转化率低，转化效果稳定性差，易受环境条件影响的根本原因。我们的试验也发现，在花期温度较低的年份，棉花的转化效率明显提高，推测与核酸酶活性在相对较低温度下，活性较低有关。
Hansen G等人(1996)基于农杆菌转化机理结合基因枪法创建了“农杆枪法”(Agrolistic)，将农杆菌中协助转化的virD1、VirD2基因连同T-DNA上的目的基因一同用基因枪打入植物细胞中{Hansen G，Chlton M D.“Agrolistic”transformation of plant cellsintegration of T-strands generatedin planta[J].proc Natl Acad sci USA.1996，9314978-14983；刘兆明，刘宗旨，白庆武，方荣祥.Agroinfiltration在植物分子生物学研究中的应用[J].生物工程学报，18，(4)411-414}。表达的VirD1、VirD2能在植物细胞内切割保守序列的DNA并将T-DNA转入细胞核，其频率在总的转化事件中约占20％。该方法集中了农杆菌转化方法中精确切割转移和低拷贝整合等特性以及基因枪法中无宿主范围限制的优点。用玉米原生质体直接转化法同样证明了上述结论，并且表明另外再加入VirE2基因，可以进一步双倍提高典型T-DNA整合的频率{G Hansen，et al.T-strand integration inmaize protoplasts after codelivery of a T-DNA substrate and virulence genes[J].Proc Natl Acad Sci U SA，1997，94(21)11726-11730}。
应用类似的方法，Ziemienowicz等人在体外构建了一个由农杆菌毒性蛋白VirD2、virE2和单链DNA组成的复合体，能够快速有效地将DNA转运到哺乳动物的细胞核中{A.Ziemienowicz，.Import of DNA into mammalian nuclei by proteins originating from a plantpathogenic bacterium[J]，Proc Natl Acad Sci U S A.1999，96(7)3729-3733}。为我们将农杆菌介导与花粉管通道转化法有机结合，提供了一种很有发展前途的新思路。
农杆菌介导转化和花粉管通道转化法，是目前棉花外源基因转化的主要方法。二者的优缺点极为明显，但互补性很强。如何将二者有机的结合起来，创造一种操作简单，不受组织和细胞再生限制，转化频率高，遗传稳定性好的棉花转基因方法，对于进行功能基因分析和转基因棉花育种，具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用农杆菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的转化效率的方法，主要利用农杆菌介导植物转化机理，利用农杆菌协助转化的毒蛋白基因，在体外同需要转化的目的基因(绿色荧光蛋白基因)组装或混合，经脂质体包装后，采用花粉管通道技术，对植物进行转化，其另一目的则是利用上述的方法对植物、尤其是对棉花进行转化。
本发明的目的主要是通过以下过程实现的(1)植物增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)植物表达载体的构建；(2)virD1、virD2和virE2基因克隆、原核表达分析；原核表达载体的构建及表达分析将virD1、virD2和virE2基因从克隆载体上切下，将其融合到分泌型原核表达载体，大肠杆菌周质蛋白phoA或外膜ompA蛋白信号引导肽核酸序列的下游，构建成分泌型原核表达载体，转化到L型细胞壁缺陷的大肠杆菌中，产物直接分泌到培养基中，进行提取纯化(备用方案采用常规的包涵体复性的方法)，用纯化的蛋白加弗氏佐剂免疫新西兰白兔，抽提血清，制备一抗并测定效价，(3)virD1、virD2和virE2基因植物瞬时表达载体的构建；植物瞬时表达载体的构建利用农杆菌Ti质粒的序列图谱和酶切图谱，在virD1、virD2和virE2基因编码区两侧设计特异性引物，并在引物上加上用于克隆的酶切位点，通过高保真PCR技术进行相应的基因扩增，将产物直接构建到带有抗卡那霉素标记基因的植物表达载体上，将带有强植物启动子-毒蛋白基因-终止子的完整的表达框切下，构建到高效克隆载体pUC18的多克隆位点上，获得不带左右边界序列的植物瞬时表达载体；(4)virD1、virD2和virE2基因或蛋白与报告基因(GFP)经脂质体包装，对烟草原生质体转化的瞬时表达和转化整合频率研究；T-DNA蛋白复合物的体外组装将需要转化的带有目的基因(本项目使用绿色荧光蛋白，GFP)pBin-EGFP植物表达载体，加入到植物细胞提取液中，并按顺序加入提取并纯化的virD1、virD2蛋白，接着加入DNA聚合酶I，通过缺口平移产生相应的T-DNA单链，加入virE2蛋白孵育，然后用核酸酶完全消化混合物，凝胶阻滞电泳分析，与此同时酚氯仿抽提蛋白，乙醇沉淀、纯化DNA，最终通过特异性引物，对相应T-DNA片段进行荧光定量扩增，评估virD1、virD2和virE2蛋白活性，研究T-DNA蛋白复合体最佳组装方式和浓度配比；脂质体包装将T-DNA蛋白复合物或virD1、virD2和virE2基因(带有完整的植物表达框架)与含有目的基因GFP质粒载体按一定比例混合，用阳离子脂质体(商品化)进行包装处理，并对烟草原生质体进行转化，用荧光显微镜对转化细胞进行瞬时表达研究，同时利用抗生素，对转化烟草体细胞系进行多代筛选，再生植株并检测其整合效率，以此间接推断毒蛋白在植物体内的组装活性，在此基础上对脂质体最佳转化条件及缓冲液组成进行研究；(5)在virD1、virD2和virE2基因能在植物体内正常表达并具有活性的基础上，利用农杆菌转化植物的机理，将脂质体转化和花粉管通道技术相结合，对棉花转化效率及遗传稳定性进行研究和评价；(6)改良花粉管通道技术体系的评价在(4)(5)研究的基础上，利用农杆菌转化植物的机理，将脂质体转化和花粉管通道技术相结合，田间对特定的棉花进行转化，后代在苗期利用抗生素及长波紫外灯进行筛选，同时进行分子验证，确定其转化频率同时对转基因后代进行连续多代系谱式的跟踪调查，研究其遗传稳定性。
上述的过程，按每1×105～5×106个原生质体细胞分别加浓度为5～25μL pUC-pBin-GFP的质粒，浓度为5～15μL pUC-pBin-VirD1，pUC-pBin-VirD2和pUC-pBin-VirE2的协助基因进行组装。
上述的优化组装是pUC-pBin-VirD1+UC-pBin-VirD2+pUC-pBin-VirE2+pUC-pBin-GFP，pUC-pBin-GFP质粒浓度以15～20μL最佳，协助基因的浓度对转化效率影响不大。
上述的过程脂质体包装时，利用农杆菌协助转化的毒蛋白基因，在体外同需要转化的目的基因(绿色荧光蛋白基因)组装或混合，以质粒浓度[GFP]＝3～6ug/ul；[VirD1]＝3～5ug/ul；[VirD2]＝3～5ug/ul；[VirE2]＝3～5ug/ul，按1∶1∶1∶5组装，经脂质体包装后，用花粉管通道技术，对棉花进行转化，转化的效果比对照明显提高，提高效率达4倍以上，如同时用脂质体包装后，进行转化，转化效率比对照提高4.5倍以上，使用含本发明中的组装也可转化其他植物材料。
上述花粉管通道的转化方法在棉花种植中的应用，选择第二天即将开放的棉花花蕾用夹子夹住花蕾顶部，进行自交，选择每个果枝的第一和第二个果节位的花朵作为转基因操作的对象，开花后18～24h左右进行转化，转化前，不用剥花和分开苞叶，直接用单面刀片在花萼上部横切，将花柱及切面上部花瓣切除，同时在子房顶部切出0.3～0.7cm直径的切面，然后用微量注射器滴加DNA溶液，滴加的量5～10uL，DNA浓度2～5ug/uL。
与现有技术相比，本发明将农杆菌-脂质体-花粉管通道技术有机的结合起来，利用农杆菌协助转化的毒蛋白基因(virD1、virD2和virE2)，在体外同需要转化的目的基因(绿色荧光蛋白基因)按一定的比例混合，经脂质体包装后，采用花粉管通道技术转入植物，这对于提高花粉管通道的转化效率和遗传稳定性是一种极有发展潜力的改良途径。在基因VirD1、VirD2、VirE2的共同作用下，原生质体的转化率明显高于其他的处理，达到了60～66％。
改进后的转化方法利用脂质体易入被细胞膜摄取特性，帮助外源质粒从胚囊进入细胞胞质，然后，带有核定位信号的毒蛋白，携带目的基因自主穿过核孔进入细胞核。质粒不仅在进行入胚囊阶段，受脂质体保护，而且在进入卵细胞后，能被表达的毒蛋白包被，提高了外源DNA在细胞转化过程中的稳定性，能够精确的在T-DNA区加工切割，插入基因组的方式多是单拷贝，并且毒蛋白virD1具有促进T-DNA与基因组整合，提高转化效率的功能。
图1是绿色荧光蛋白基因GFP的克隆及原核表达图图2是VirD1基因的克隆及原核表达载体构建的技术路线流程图图3是VirD2与原核表达载体pET30a的构建流程图图4是VirE2基因的克隆及原核表达流程图图5是virD1、virD2和virE2基因植物瞬时表达载体的构建的技术流程图图6是显微镜下GFP在原生质体中瞬时表达结果图图7是显微镜下GFP在原生质体中培养第28天时的细胞团表达结果图图8是转化的原生质体的PCR检测结果图图9棉花花粉管通道法导入时间实验PCR检测结果图图8中1阳性对照，2、3阴性对照，4、6细胞处理的液体中沉淀的PCR结果，5、7细胞处理的液体中上清的PCR结果，8DNA Marker DL2000。
图9中1～318小时导入，4～622小时导入，7～948小时导入，10阴性对照，11DNA Marker，12、1324小时导入，14、1536小时导入，16～18黄化苗阴性对照，19阳性对照。
具体实施例方式实施例1植物增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)植物表达载体的构建(参见图1)。
实施例2virD1、virD2和virE2基因克隆1、根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD1基因的克隆(参见图2)根据U.Washington发表的根癌土壤农杆菌C58 VirD1蛋白基因全序列，自行设计一对引物，如下所示P1为<210>1，5’-CGGATATCATGTCGCAAGGCAGTAGG-3’Eco V(下划线)26bp；P2为<210>2，5’-CGAAGCTTTTACAAGGCGTCTTTCAGCA-3’HindIII(下划线)28bp，两条引物之间跨幅459bp，加酶切位点和保护碱基扩增后的片段大小为474bp。
2、根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirD2基因的克隆(参见图3)根据U.Washington发表的根癌土壤农杆菌C58 VirD2基因全序列，自行设计一对引物，由上海生工生物公司合成，其正向引物基因序列P1为<210>3，5’-CGCCATGGATGCCCGATCGAGCTCAAG-3’；反向引物P2为<210>4，5’-CGGTCGACTGCCATCACTCGGTCCTTC-3’。
引物P1，P2的跨幅为1380bp，其中P1包含有编码VirD1的起始密码子ATG和Nco I(下画线处)酶切位点，P2包括SalI(下画线处)酶切位点。
3、根癌土壤农杆菌Ti质粒毒性区VirE2基因的克隆(参见图4)根据U.Washington发表的根癌土壤农杆菌C58 VIRE2基因全序列，自行设计一对引物，由上海生工生物公司合成，其正向引物基因序列P1为<210>5，
5’-CGAAGCTTATGGATCCGAAGGCCGA-3’；反向引物P2为<210>6，5’-CGCTCGAGTGACGCGGTATCAGGAA-3’。
引物P1，P2的跨幅为1690bp，其中P1包含有编码VirE2的起始密码子ATG和HindIII(下画线处)酶切位点，P2包括Xho I(下画线处)酶切位点。
实施例3virD1、virD2和virE2基因植物瞬时表达载体pUC-pBin-VirD1、pUC-pBin-VirD2、pUC-pBin-VirE2以及pUC-pBin-GFP的构建。技术路线见图5。
实施例4烟草原生质体的瞬时表达1提取质粒用碱裂解法小量提取pUC-pBin-VirD1、pUC-pBin-VirD2、pUC-pBin-VirE2和pUC-pBin-GFP、pBin-GFP、pUC-pBin质粒，用0.22μm的滤膜过滤灭菌，后于-20℃保存备用。
2瞬时表达2.1设置以下几种处理1阴性对照不加质粒；2加载体pUC-pBin质粒；3阳性对照加pUC-pBin-GFP质粒；4加载体质粒pUC-pBin和pUC-pBin-GFP质粒；5加pUC-pBin-VirD1、pUC-pBin-VirD2、pUC-pBin-VirE2和pUC-pBin-GFP质粒；6加pUC-pBin-VirD2和pUC-pBin-GFP质粒；7加pUC-pBin-VirE2和pUC-pBin-GFP质粒；8加pUC-pBin-VirD1和pUC-pBin-GFP质粒；2.2设置以下几种质粒浓度处理按上述设计加入质粒。通常用碱裂解法提得的质粒浓度大约为0.1mg/mL，按每105个原生质体细胞分别加pUC-pBin-GFP质粒5μL，10μL，15μL，20μL，25μL几种不同的浓度梯度，协助基因pUC-pBin-VirD1，pUC-pBin-VirD2和pUC-pBin-VirE2以5μL，10μL，15μL几种不同的浓度梯度，加入后轻轻混匀，使原生质体与质粒静置共同于室温下暗培养；从培养30min后开始在荧光显微镜下观察。
实施例5烟草原生质体的制备与纯化(1)将愈伤组织移入无菌的培养皿中，并切成小块，加入酶液A，每2g组织加10mL酶液；(2)将培养皿用封口膜封好，于28℃条件下缓慢振荡7-9hr，在倒置显微镜下检查，直到产生足够的原生质体；(3)将酶解后的原生质体悬液用80目不锈钢网筛(或双层擦镜纸)过滤，以除去未酶解完全的组织；(4)将滤液分装在刻度离心管中，4000rpm离心5min，使原生质体沉淀下来；(5)用移液管吸去上清，将沉淀的原生质体悬浮在2/3体积0.2M的CaCl2中；(6)用注射器向离心管底部缓慢注入20％的蔗糖溶液0.5mL，4000rpm离心5min；(此步完成以后，在两相溶液界面之间将出现一层纯净的完整原生质体带，杂质和碎片将沉到管底。)(7)用注射器吸去管底的杂质和下部的蔗糖溶液以及上部的CaCl2溶液；(此时离心管中只留下纯净的原生质体)(8)用0.2M的CaCl2悬浮，4000rpm离心5min，吸去上清，用DPD液体培养基重复洗涤2-3次；(9)将收集的原生质体悬浮在适量的DPD液体培养基中，分装，每个培养皿2mL，原生质体平板密度约为1×105～5×106个/mL；(10)用封口膜封口，26℃条件下暗培养16～20hr。
实施例6烟草原生质体瞬时表达的结果统计与分析本实施例设计了8种处理(参见实施例42.1)，在荧光显微镜下(参见图6、图7)对发荧光的细胞进行了计数统计每种处理设5个重复，每个重复随机选10个视野，每个视野选5个点，统计出每个点200个细胞中发荧光的细胞个数，然后将各组数据平均得出以下结果。由于处理1和加载体pUC-pBin质粒的处理2中在波长365nm的紫外光激发下没有绿色荧光产生，而且原生质体呈黑色，统计数据为0，故没有列入下表。别的处理在紫外光激发下都有不同程度的绿色荧光产生。以下是目的基因和协助基因在各种浓度组合下每连续200个细胞中发荧光的细胞个数表不同处理下转化率统计表
从统计表可以看出，在载体质粒pUC-pBin存在的情况下GFP对原生质体的转化率没有区别，统计结果显示原生质体的转化率最低，在0.3％左右，说明载体质粒pUC-pBin在GFP转化原生质体时不起作用。
在VirD1、VirD2、VirE2分别介导的转化中，转化率与阳性对照相比有不同程度的提高，其中VirD2、VirE2分别介导的转化明显高于由VirD1介导的转化，达到了7～13％左右，而VirD1介导的转化率约为3～10％。
在基因VirD1、VirD2、VirE2的共同作用下，原生质体的转化率明显高于其他的处理，达到了60～66％。
实施例7转化的原生质体的PCR检测(参见图9)将用pUC-pBin-VirD1、pUC-pBin-VirD2、pUC-pBin-VirE2和pBin-GFP质粒转化的原生质体在培养42天时，将细胞培养混合液以4000rpm离心5min，弃上清，将沉淀悬浮于TE(pH＝8.0)溶液中，于高温煮沸5min，使烟草的基因组释放出来，再分别以上清和沉淀为模板，进行PCR检测(设两个重复)，用1.0％的琼脂糖电泳检测PCR结果。如图8所示，4和6为以沉淀为模板的PCR没有目的条带，因为沉淀可能是死亡的细胞和组织；5和7为以上清为模板的PCR结果，与预期结果相符，说明GFP已整合到烟草基因组中。
实施例8棉花花粉管通道转化法1.花粉管通道的转化方法选择第二天即将开放的花蕾用塑料衣夹夹花蕾顶部，进行自交。选择每个果枝的第一和第二个果节位的花朵作为转基因操作的对象。开花后18-24h左右进行转化。转化前，不用剥花，分开苞叶，直接用单面刀片在花萼上部横切，将花柱及切面上部花瓣切除，同时在子房顶部切出0.5cm直径的切面。然后用微量注射器滴加DNA溶液。滴加的量5～10uL，DNA浓度2～5ug/uL.
2.转基因棉花的初步筛选收获的种子用95％浓硫酸脱绒处理。将卡那霉素配制成300～500ppm浓度的浸种水溶液，进行浸种，浸种时间24h，以水洗的细沙为发芽床，播种后保持发芽28℃，湿度保持75～80％；经过7天左右，棉苗子叶完全平展，对棉苗进行计数，按黄斑率初步鉴定转基因抗性单株。提取具卡那霉素抗性的植株的总DNA，将子叶发黄或发自的植株和没有转化的植株分别做阴性对照，进行PCR鉴定。
3.提高棉花花粉管通道转化效率研究棉花授粉后不同时间段导入数据统计
以自花授粉24h为准，导入时间越早，脱铃率越高。随着自花授粉时间的延长，成铃率越高。以绿苗率代表转基因阳性率，以18～24h较好。其余时间转化效率较差。
不同导入组合花粉管通道法数据统计
质粒浓度[GFP]＝5.23ug/ul；[VirD1]＝3.48ug/ul；[VirD2]＝4.92ug/ul；[VirE2]＝4.33ug/ul表中看，以农杆菌毒蛋白基因辅助转化的效果比对照明显提高，提高效率达3.4倍以上，如果同时用脂质体包装后，进行转化，转化效率比对照提高4.25倍。农杆菌直接滴加的转化效果不明显。
序列表<110>石河子大学<120>利用农杆菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的转化效率的方法<160>6<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1atgtcgcaaggcagtagg<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2ttacaaggcgtctttcagca<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>3cgccatggatgcccgatcgagctcaag<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>4cggtcgactgccatcactcggtccttc<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>5atggatccgaaggccga<210>6<211>17<212>DNA<213>人工序列<400>6tgacgcggtatcaggaa
权利要求
1.一种利用农杆菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的转化效率的方法，其特征是通过以下过程实现的(1)植物增强型绿色荧光蛋白基因植物表达载体的构建；(2)virD1、virD2和virE2基因克隆、原核表达分析；原核表达载体的构建及表达分析将virD1、virD2和virE2基因从克隆载体上切下，将其融合到分泌型原核表达载体，大肠杆菌周质蛋白phoA或外膜ompA蛋白信号引导肽核酸序列的下游，构建成分泌型原核表达载体，转化到L型细胞壁缺陷的大肠杆菌中，产物直接分泌到培养基中，进行提取纯化，用纯化的蛋白加弗氏佐剂免疫新西兰白兔，抽提血清，制备一抗并测定效价，(3)virD1、virD2和virE2基因植物瞬时表达载体的构建；植物瞬时表达载体的构建利用农杆菌Ti质粒的序列图谱和酶切图谱，在virD1、virD2和virE2基因编码区两侧设计特异性引物，并在引物上加上用于克隆的酶切位点，通过高保真PCR技术进行相应的基因扩增，将产物直接构建到带有抗卡那霉素标记基因的植物表达载体上，将带有强植物启动子-毒蛋白基因-终止子的完整的表达框切下，构建到高效克隆载体pUC18的多克隆位点上，获得不带左右边界序列的植物瞬时表达载体；(4)virD1、virD2和virE2基因或蛋白与报告基因经脂质体包装，对烟草原生质体转化的瞬时表达和转化整合频率研究；T-DNA蛋白复合物的体外组装将需要转化的带有目的基因pBin-EGFP植物表达载体，加入到植物细胞提取液中，并按顺序加入提取并纯化的virD1、virD2蛋白，接着加入DNA聚合酶I，通过缺口平移产生相应的T-DNA单链，加入virE2蛋白孵育，然后用核酸酶完全消化混合物，凝胶阻滞电泳分析，与此同时酚氯仿抽提蛋白，乙醇沉淀、纯化DNA，最终通过特异性引物，对相应T-DNA片段进行荧光定量扩增，评估virD1、virD2和virE2蛋白活性，研究T-DNA蛋白复合体最佳组装方式和浓度配比；脂质体包装将T-DNA蛋白复合物或virD1、virD2和virE2基因与含有目的基因GFP质粒载体按一定比例混合，用阳离子脂质体进行包装处理，并对烟草原生质体进行转化，用荧光显微镜对转化细胞进行瞬时表达研究，同时利用抗生素，对转化烟草体细胞系进行多代筛选，再生植株并检测其整合效率，以此间接推断毒蛋白在植物体内的组装活性，在此基础上对脂质体最佳转化条件及缓冲液组成进行研究；(5)在virD1、virD2和virE2基因能在植物体内正常表达并具有活性的基础上，利用农杆菌转化植物的机理，将脂质体转化和花粉管通道技术相结合，对棉花转化效率及遗传稳定性进行研究和评价；(6)改良花粉管通道技术体系的评价在(4)(5)研究的基础上，利用农杆菌转化植物的机理，将脂质体转化和花粉管通道技术相结合，田间对特定的棉花进行转化，后代在苗期利用抗生素及长波紫外灯进行筛选，同时进行分子验证，确定其转化频率同时对转基因后代进行连续多代系谱式的跟踪调查，研究其遗传稳定性。
2.如权利要求1所述的利用农杆菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的转化效率的方法，其特征在于所述的过程中，按每1×105～5×106个原生质体细胞分别加浓度为5～25μLpUC-pBin-GFP的质粒、浓度为5～15μL pUC-pBin-VirD1、5～15μL pUC-pBin-VirD2和5～15μLpUC-pBin-VirE2的协助基因进行组装。
3.如权利要求2所述的利用农杆菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的转化效率的方法，其特征在于所述的过程中，其组装是pUC-pBin-VirD1+UC-pBin-VirD2+pUC-pBin-VirE2+pUC-pBin-GFP，pUC-pBin-GFP质粒浓度为15～20μL。
4.如权利要求1、或2、或3所述的利用农杆菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的转化效率的方法，其特征在于所述的过程脂质体包装时，利用农杆菌协助转化的毒蛋白基因，在体外同需要转化的目的基因(绿色荧光蛋白基因)组装或混合，以质粒浓度[GFP]＝3～6ug/ul；[VirD1]＝3～5ug/ul；[VirD2]＝3～5ug/ul；[VirE2]＝3～5ug/ul，按1∶1∶1∶5组装，经脂质体包装后，用花粉管通道技术，对棉花进行转化。
5.一种利用农杆菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的转化效率的方法在棉花种植中的应用，其特征在于选择第二天即将开放的棉花花蕾用夹子夹住花蕾顶部，进行自交，选择每个果枝的第一和第二个果节位的花朵作为转基因操作的对象，开花后18-24h左右进行转化，转化前，不用剥花和分开苞叶，直接用单面刀片在花萼上部横切，将花柱及切面上部花瓣切除，同时在子房顶部切出0.3～0.7cm直径的切面，然后用微量注射器滴加DNA溶液，滴加的量5～10uL，DNA浓度2～5ug/uL。
全文摘要
本发明涉及一种利用农杆菌毒蛋白基因提高花粉管通道法的转化效率的方法，主要利用农杆菌介导植物转化机理，利用农杆菌协助转化的毒蛋白基因，在体外同需要转化的目的基因(绿色荧光蛋白基因)组装或混合，经脂质体包装后，采用花粉管通道技术，对植物进行转化，并利用上述的方法对植物、尤其是对棉花进行转化。本发明将农杆菌－脂质体－花粉管通道技术有机的结合起来，原生质体的转化率明显提高，质粒不仅在进行入胚囊阶段受脂质体保护，而且在进入卵细胞后，能被表达的毒蛋白包被，提高了外源DNA在细胞转化过程中的稳定性，能够精确的在T－DNA区加工切割，提高了转化效率。
文档编号C12N15/31GK101092633SQ20071008995
公开日2007年12月26日 申请日期2007年3月23日 优先权日2007年3月1日
发明者祝建波, 张煜星, 崔百明, 王爱英, 刘红玲, 李小红, 王彦芹 申请人:石河子大学