专利名称：一种高通量克隆微生物Na的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物工程领域，涉及一种高通量克隆微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因的方法。
背景技术：
在国际上，大肠杆菌缺陷株K被用来从微生物中克隆Na+/H+逆向转运蛋白基因。其通常做法是提取纯培养微生物的基因组DNA，用限制性内切酶对其进行部分酶切，将酶切片段连接到载体，并用连接产物转化大肠杆菌缺陷株K。然后，在含一定浓度NaCl或LiCl的固体培养基上对转化子进行筛选，从而获得携带Na+/H+逆向转运蛋白基因的重组子。采用上述方法，已经从微生物中克隆得到了10余种类型的Na+/H+逆向转运蛋白基因，并对其中部分基因的功能特性进行了研究。由于环境中99％以上的微生物无法通过现有方法得到纯培养，因此，利用已有技术获得微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因的数量有限，极大地限制了对微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因的挖掘和利用。为了加速对微生物Na+/H+逆向转运蛋白功能基因资源的认识和挖掘，需要发展高通量的目的基因筛选方法。
发明内容
本发明的目的是从环境微生物中高通量、规模化克隆Na+/H+逆向转运蛋白基因资源，用于深入研究微生物输出钠离子的分子机制，以及构建转基因耐盐作物和微生物，进而充分开发和利用盐碱地。
一种高通量克隆微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因的方法，经过样品采集、宏基因组DNA的粗提、宏基因组DNA的纯化三个步骤，再通过阳性克隆的筛选、测序和目的基因的亚克隆与再转化，获得Na+/H+逆向转运蛋白单一基因或基因簇，并对基因进行功能鉴定。其特征是1.样品采集从盐湖、盐碱湖和盐碱地等多元化的地域环境中采集土壤样品，样品采集后，-70℃--80℃保存备用。
2.采用CTAB-SDS-冻融法粗提宏基因组DNA宏基因组DNA是指特定环境样品中所有微小生物的DNA总和。CTAB-SDS-冻融法(即十六烷基三甲基溴化铵-十二烷基硫酸钠-冻融法)粗提宏基因组DNA的详细步骤为(1)称取1g土样于15mL离心管中(如果需要大量提取宏基因组DNA，可称取3-10g土样于50mL离心管中，相应试剂的用量按比例增加)，加入2-10mL经35-37℃预热的DNA提取液、50-200mg PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮)、10-100μL(约20-200个活性单位)溶菌酶和5-20粒灭菌玻璃珠，在35-37℃、200-300r/min条件下振荡30-90min。然后加入0.2-1.0mL浓度为20％的SDS(十二烷基硫酸钠)，上下用力颠倒，使之混匀；DNA提取液的配方包括100mmol/LTris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸)，100mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)，100mmol/LNa3 PO4(磷酸三钠)，1.5mol/LNaCl，浓度为1-3％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，pH7.8-8.2。
(2)50-65℃水浴1-2小时(每隔10-30min上下轻轻颠倒离心管2-4次，切勿振荡！！)。水浴完毕，冷却至室温，然后加5-50μL(约10-100个活性单位)蛋白酶K，35-37℃温度下摇动30-60min；(3)置于-20℃冷冻20min-40min，然后50-65℃冻融、35-37℃温育30-60min；0-10℃、8000-12000r/min离心5-20min，得到上清1和沉淀物1；(4)将得到的上清1转移至另一离心管中，然后向沉淀物1中加入0.9-2.7mL DNA提取液和0.1-0.3mL 20％SDS，混匀，50-65℃水浴1-2小时。然后于-20℃冷冻，50-65℃解冻，冰浴冷却；再冷冻和融化各1次，0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清2；将所得到的上清2吸出，并与上清1合并，所得上清液为上清3；(5)抽提向上清3中加入与上清3等体积预冷的氯仿∶异戊醇(体积比为24∶1)，上下轻轻颠倒离心管，使充分混合，然后0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清4；小心吸取上清液4至另一离心管，加入体积相当于上清液4的0.1倍的预冷的1mMEDTA-3MNaAc溶液(含有1mM乙二胺四乙酸与3M醋酸钠的试剂，pH5.2)和相当于上清液4体积0.6倍的预冷异丙醇。轻混匀后冰浴10-30min、或者在-20℃下放置1-24小时，使DNA沉淀；0-10℃、8000-12000r/min离心5-20min，得到上清5和沉淀物2；(6)倒掉上清5，然后向沉淀物2中加入1-10mL经0-10℃预冷的70％乙醇，冰浴或者置4℃冰箱至少30min，然后0-10℃、8000-12000r/min离心10-20min，得到上清6和沉淀物3；(7)去上清6，用真空干燥机对沉淀物3进行干燥后，向所得粉末状宏基因组DNA中加入20-150μL的ddH2O(灭菌双蒸水)，-20℃保存备用(短时间保存可置4℃冰箱)。
3.宏基因组DNA的纯化采用试剂盒对经粗提获得的宏基因组DNA进行纯化，详细操作方法见Promega公司的DNA凝胶回收试剂盒。用紫外分光光度计测定DNA的纯度和浓度。
4.阳性克隆的筛选对经过纯化的宏基因组DNA进行阳性克隆的筛选依次按以下步骤进行。
(1)宏基因组DNA的部分酶切预实验。用10mM Tris-HCl(pH8.0)稀释宏基因组DNA至900μl，加入100μl 10×酶切缓冲液充分混匀，10×酶切缓冲液成分为500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇，1000mM NaCl，所得溶液为宏基因组DNA稀释液；准备10个离心管，依次编号；用切去尖端的移液器吸头，向1号离心管加入30μl宏基因组DNA稀释液，向2-10号离心管中各加入15μl宏基因组DNA稀释液，并将1-10号离心管置于冰上；向1号离心管中加入3μl(约0.048U)Sau3AI(分离自金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus 3A菌株的第一种限制性内切酶)，并温和混匀，然后从1号离心管中吸出15μl转移至2号离心管中，温和混匀，并吸取15μl转移至3号离心管中，依次类推，直至第10号离心管。将所有离心管于37℃温育60min。酶切消化结束后，快速置70-75℃加热10-20min，以灭活限制性内切酶。待样品降至室温后，用浓度为0.6-0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳，以检测宏基因组DNA部分酶切的效果。酶切消化完全、且酶切产物集中在4-10kb范围的内切酶Sau3AI用量为最适酶量，其大致范围为0.001-0.006个活性单位/管。
(2)宏基因组DNA部分酶切产物的大规模制备。根据宏基因组DNA部分酶切预实验所确定的最适Sau3AI用量扩大酶切反应体系，用0.012-0.05个活性单位的Sau3AI对500-2000ng的宏基因组DNA消化1小时，然后用酚∶氯仿小心抽提部分酶切产物两次；用相当于部分酶切产物2倍体积、经0-10℃预冷的无水乙醇进行沉淀，并将沉淀溶于30-200μl的ddH2O中，得到部分酶切产物；用浓度为0.6-1.0％的琼脂糖对部分酶切产物进行凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收4-10kb范围的DNA片段，并将回收的4-10kb范围的DNA片段置-20℃保存；(3)pGEM3Zf(+)载体的酶切和去磷酸化。对pGEM3Zf(+)载体依次用BamHI完全酶切以及牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化处理；(4)用经回收的宏基因组DNA部分酶切片段与pGEM3Zf(+)载体按6∶1-1∶4的比例进行连接，直接用获得的连接产物电转化大肠杆菌缺陷株K，获得转化子。将转化子涂布于含0.2M NaCl或者是含5mM LiCl的LBK固体培养基。LBK固体培养基的配制方法10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5-6.5g氯化钾，15-20g琼脂粉，用去离子水定容至1000mL，121℃灭菌20-30min。待降至50-65℃时，向其中加入50-100mg氨苄青霉素，混匀，然后倒平板。35-37℃培养16-24小时，获得阳性克隆；(5)挑取阳性克隆依次进行质粒的快速检测、质粒提取和测序鉴定。
5.目的基因的亚克隆和再转化根据阳性克隆携带重组质粒的序列比对结果，设计一对特异引物，通过常规的PCR方法，对Na+/H+逆向转运蛋白基因或基因簇的全长(包含推测的启动子和终止子)进行亚克隆，并将亚克隆基因连接到pGEM3Zf(+)载体(一种常用的克隆载体)获得重组质粒，然后用获得的重组质粒再次转化大肠杆菌缺陷株K，获得仅携带Na+/H+逆向转运蛋白单一基因(或基因簇)的重组子。在含0.2-0.8M NaCl或者10-50mM LiCl的培养基中培养携带Na+/H+逆向转运蛋白单一基因的大肠杆菌缺陷株K重组子，从而确定Na+/H+逆向转运蛋白基因提高大肠杆菌缺陷株K耐盐性的能力。
6.翻转膜的制备与Na+/H+逆向转运蛋白的功能特性鉴定(1)翻转膜的制备培养并收集各重组子和阴性对照菌株的菌体，用法式细胞破碎仪(French Press)以1,200-2,500p.s.i.的系统压力破碎细胞，然后80,000-100,000×g超速离心1-2小时，所得沉淀即为翻转膜，将获得的翻转膜置-70--80℃保存备用。
(2)Na+/H+逆向转运蛋白的功能特性Na+/H+逆向转运蛋白的活性测定采用荧光分光光度计法测定翻转膜中Na+/H+逆向转运蛋白在pH4.5-9.5下的活性，测定方法即利用吖啶橙作为荧光探针，向含有翻转膜的反应体系中添加Tris-L-乳酸钾或Tris-L-乳酸至终浓度为5-10mM，使荧光强度逐渐猝灭，并通过荧光分光光度计监控跨膜pH梯度即ΔpH的变化。荧光监测参数为激发光(EX)波长430-505nm，发射光(EM)波长510-530nm。当荧光强度下降至稳态时，向反应体系加入终浓度为2-10mM的NaCl、LiCl或KCl。如果翻转膜具有单价阳离子转运活性，则荧光强度开始恢复。根据荧光强度的恢复程度判断并表示翻转膜中Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性的大小以及转运单价阳离子的特异性。
Na+/H+逆向转运蛋白的表观Km(米氏常数)和Vmax(最大反应速度)的测定在pH4.5-9.5条件下，使用不同浓度的NaCl、LiCl或KCl分别测定翻转膜中的Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性。然后，以底物浓度和荧光强度作双倒数图，并由此计算Na+/H+逆向转运蛋白对Na+、Li+和K+的表观Km值和Vmax值，获得新基因编码蛋白的动力学参数及转运单价阳离子的能力等特征信息。
利用本发明，可以从环境微生物样品中克隆得到大量的Na+/H+逆向转运蛋白基因，实现对微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因克隆的高通量和规模化。
具体实施例方式
以下实施例将对本发明作进一步说明。
从红树林土壤微生物中克隆Na+/H+逆向转运蛋白基因。其详细步骤为1.土壤样品采集用样品采集器在红树林区采集20cm深的沉积土样，然后分装于灭菌的50ml离心管中。样品带回实验室后，-80℃保存备用。
2.土壤微生物宏基因组的提取。具体方法是(1)称取1g土样于15mL离心管中，加约50mg PVPP和2.7mL预热的DNA提取液，再加入50μL溶菌酶，37℃、250r/min振荡30min；加入0.3mL 20％的SDS，上下用力颠倒几次，使之混合均匀；65℃水浴2小时(每隔20min左右上下轻轻颠倒离心管几次，切勿振荡！)。水浴完毕，冷却至室温，然后加20μL蛋白酶K，37℃温和摇动30-60min；置于-20℃冷冻30min，然后65℃冻融10min，37℃温育30min；4℃、10,000r/min离心10min，得到上清1和沉淀物1，收集上清1转移至另一离心管中；向沉淀物1中加入0.9mL DNA提取液和0.1mL 20％SDS，混匀，65℃水浴30min。然后于-20℃冷冻，65℃冻融10min，冰浴冷却；4℃、10,000r/min离心10min，得到上清2和沉淀物2，所得到的上清2与上清1合并得到上清3；向上清3中加入与得到上清3等体积预冷的氯仿∶异戊醇(24∶1)，上下轻轻颠倒离心管，使充分混合，然后4℃、10,000r/min离心20min；得到上清4和沉淀物3；小心吸取上清4至另一离心管，加入相当于上清4体积0.1倍的预冷的1mM EDTA-3M NaAc(pH5.2)和相当于上清4体积0.6倍的预冷的异丙醇，轻混匀，然后冰浴15min、或者-20℃放置1小时，使DNA沉淀；4℃、10,000r/min离心20min；得到上清5和沉淀物4倒掉上清5，向沉淀4中加入一定体积4℃预冷的70％乙醇(洗涤1次)，冰浴或者置4℃冰箱至少30min，然后4℃、10,000r/min离心20min，得到上清6和沉淀物5，去上清6；将沉淀物5置超净工作台干燥后重悬于100μL灭菌ddH2O中，-20℃保存备用。
3.宏基因组DNA部分酶切预实验用10mM Tris-HCl(pH8.0)稀释宏基因组DNA至900μl，加入100μl 10×酶切缓冲液，充分混匀，所得溶液为宏基因组DNA稀释液；
用切去尖端的移液器吸头，向1号离心管加入30μl宏基因组DNA稀释液，向2-10号离心管各加入15μl宏基因组DNA稀释液，并将1-10号离心管置于冰上；向1号离心管中加入3μl(0.048U)Sau3AI，温和混匀，然后从1号离心管中吸出15μl转移至2号离心管中，温和混匀；从2号离心管中吸取15μl转移至3号离心管，依次类推。将所有离心管于37℃温育1小时；酶切消化结束后，70℃加热15min，以灭活限制酶。待反应体系降至室温后，用0.8％的琼脂糖对部分酶切产物进行凝胶电泳，发现使宏基因组DNA酶切消化完全、且酶切产物集中在4-10kb范围的最适酶量为0.003个活性单位/管。
4.宏基因组DNA部分酶切产物的大规模制备根据宏基因组DNA部分酶切预实验所确定的最适Sau3AI用量扩大酶切反应体系，用Sau3AI对1000ng的宏基因组DNA消化1小时，然后用酚∶氯仿小心抽提两次，用相当于部分酶切产物2倍体积、经4℃预冷的无水乙醇沉淀部分酶切产物，并将所得沉淀溶于200μl的ddH2O中；用0.8％的琼脂糖对部分酶切产物进行凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收4-10kb范围的DNA片段，并将回收产物置-20℃保存；5.pUC18载体的酶切和去磷酸化对pUC18载体(是一种常用的克隆载体)依次用BamHI完全酶切以及CIAP去磷酸化处理，得到线性化的pUC18载体。其中，BamHI为分离自Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)H菌株的第一种限制性内切酶，CIAP为牛小肠碱性磷酸酶。
pUC18载体的酶切和去磷酸化反应体系如表1。
表1 pUC18载体的酶切和去磷酸化体系和反应条件
6.pUC18载体与基因组DNA部分酶切片段的连接将经过酶切和去磷酸化后产生的线性pUC18载体与经Sau3AI部分酶切的宏基因组DNA以1∶1的摩尔比进行连接，形成连接产物。连接体系如表2。
表2 pUC18与宏基因组部分酶切片段的连接体系和反应条件
7.阳性克隆的筛选(1)从-70℃冰箱取出大肠杆菌缺陷株K的感受态细胞放入电激杯，冰上冻融，同时冰浴电激杯；(2)向感受态细胞中加入5μl连接产物，轻旋管以混匀内容物，然后冰浴5min；(3)调节基因导入仪参数V＝1.6kV，R＝250Ω，电容25μF；(4)将感受态细胞和重组质粒的混合物转入电激杯，将电激杯推入电激槽，然后启动电脉冲；(5)取出电激槽，向电激杯内加入500μl经过37℃预热的LBK液体培养基，并抽吸3-5次；将杯内菌悬液移至离心管，37℃、180rpm温育1小时；(6)将菌悬液涂布于含0.2M NaCl或者是含5mM LiCl的LBK固体培养基平板(含100μg ml-1氨苄青霉素)，37℃培养16小时，由此获得的阳性克隆。
(7)挑取阳性克隆依次进行质粒的提取和测序鉴定。质粒的提取按照上海生工生物技术公司的质粒提取试剂盒的说明操作，序列测定在上海英俊广州分公司进行。
8.Na+/H+逆向转运蛋白基因的亚克隆用于亚克隆的PCR反应体系及条件如表3所示。
表3目的基因的亚克隆体系及反应条件
9.目的基因的再转化将亚克隆基因连接到pGEM3Zf(+)载体，然后用获得的重组质粒再次转化大肠杆菌缺陷株K，用获得的仅携带Na+/H+逆向转运蛋白单一基因的重组子进行目的基因的功能研究，且均以携带空载体的大肠杆菌缺失株K/pGEM3Zf(+)作为阴性对照。
10.重组子在不同条件下的生长能力测试功能性表达的Na+/H+逆向转运蛋白基因能不同程度地提高大肠杆菌缺陷株K的耐盐能力。在含0.2M-0.8M NaCl的培养基中对重组子进行盐耐受性实验。
11.翻转膜的制备与性质研究(1)翻转膜的制备培养并收集各重组子和阴性对照菌株的菌体，用French Press方法以1,500p.s.i.的系统压力破碎细胞，然后100,000×g超速离心1小时，将获得的翻转膜置-70℃保存备用。
(2)翻转膜的性质Na+/H+逆向转运蛋白的活性测定采用荧光分光光度计法测定翻转膜中Na+/H+逆向转运蛋白在不同pH下的活性，即利用吖啶橙作为荧光探针，首先，向含有翻转膜的反应体系中添加7mM的Tris-L-乳酸钾，使荧光强度逐渐猝灭，并通过荧光分光光度计监控跨膜pH梯度的变化。荧光监测参数为激发光(EX)波长495nm，发射光(EM)波长530nm。当荧光强度下降至稳态时，向反应体系加入终浓度为6mM的NaCl、LiCl或KCl。如果翻转膜具有单价阳离子转运活性，则荧光强度开始恢复。根据荧光强度的恢复程度判断并表示翻转膜中Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性的大小以及转运单价阳离子的特异性。
表观Km值和Vmax测定在最适pH条件下，分别测定翻转膜中的Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性。然后，以底物浓度和荧光强度作双倒数图，并由此计算Na+/H+逆向转运蛋白对Na+、Li+和K+的表观Km值和Vmax，获得新基因编码蛋白的动力学参数及转运单价阳离子的能力等特征信息。
权利要求
1.一种高通量克隆微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因的方法，经过样品采集、宏基因组DNA的粗提、宏基因组DNA的纯化三个步骤，再通过阳性克隆的筛选、测序、目的基因的亚克隆和再转化操作，获得Na+/H+逆向转运蛋白单一基因或者基因簇，并对目的基因进行功能鉴定，其特征是土壤样品来自高盐环境，样品采集后保存温度为-70℃--80℃；提取宏基因组DNA的详细步骤为(1)称取1g土样于15mL离心管中，加入2-10mL经过35-37℃预热的DNA提取液和50-200mgPVPP及10-100μL溶菌酶和5-20粒灭菌玻璃珠，在35-37℃、200-300r/min条件下振荡30-90min，加入0.2-1.0mL浓度为20％的SDS，10-100μL溶菌酶-合20-200个活性单位；DNA提取液的配方包括100mmol/L Tris-HCl，100mmol/L EDTA，100mmol/L Na3PO4，1.5mol/L NaCl，浓度为1-3％CTAB，pH7.8-8.2；(2)50-65℃水浴1-2小时，每隔10-30min上下颠倒离心管；水浴完毕，冷却至室温，然后加5-50μL蛋白酶K，35-37℃温度下摇动30-60min，5-50μL蛋白酶K-合10-100个活性单位；(3)置于-20℃冷冻20min-40min，然后50-65℃冻融、35-37℃温育30-60min；0-10℃、8000-12 000r/min离心5-20min，得到上清1和沉淀物1；(4)将得到的上清1转移至另一离心管中，然后向沉淀物1中加入0.9-2.7mL DNA提取液和0.1-0.3mL 20％SDS，混匀，50-65℃水浴1-2小时，然后于-20℃冷冻，50-65℃解冻，冰浴冷却；重复冷冻和融化1次，0-10℃、8000-12 000r/min离心5-20min，得到上清2；将所得到的上清2吸出，并与上清1合并，所得上清液为上清3；(5)抽提向上清3中加入与上清3等体积预冷的氯仿∶异戊醇，氯仿与异戊醇体积比为24∶1，上下颠倒离心管，然后0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清4；吸取上清液4至另一离心管，加入体积相当于上清液4的0.1倍的预冷的pH＝5.2的1mM EDTA-3M NaAc和体积相当于上清液4的0.6倍的预冷的异丙醇，混匀后冰浴10-30min、或者在-20℃下放置1-24小时使DNA沉淀；0-10℃、8,000-12,000r/min离心5-20min，得到上清5和沉淀物2；(6)倒掉上清5，然后向沉淀物2中加入1-10mL经0-10℃预冷的70％乙醇，冰浴或者置4℃冰箱至少30min，然后0-10℃、8,000-12,000r/min离心10-20min，得到上清6和沉淀物3；(7)去上清6，用真空干燥机对沉淀物3进行干燥后，向所得粉末状宏基因组DNA中加入20-150μL灭菌ddH2O，-20℃保存备用；对于大量提取宏基因组DNA，则土样的称取数量和相应试剂的用量要按比例增加。
2.如权利要求1所述的一种规模化筛选微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因的方法，其特征是阳性克隆的筛选对经过纯化的宏基因组DNA进行阳性克隆的筛选依次按以下步骤进行(1)宏基因组DNA的部分酶切预实验用10mM pH8.0的Tris-HCl稀释宏基因组DNA至900μl，加入100μl 10×酶切缓冲液充分混匀，10×酶切缓冲液成分为500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，10mM二硫苏糖醇，1000mM NaCl，所得溶液为宏基因组DNA稀释液；准备10个离心管，依次编号；用切去尖端的移液器吸头，向1号离心管加入30μl宏基因组DNA稀释液，向2-10号离心管中各加入15μl宏基因组DNA稀释液，并将1-10号离心管置于冰上；向1号离心管中加入3μlSau3AI-合0.048U，并混匀，然后从1号离心管中吸出15μl转移至2号离心管中，混匀，并吸取15μl转移至3号离心管中，依次类推，直至第10号离心管；将所有离心管于37℃温育60min；酶切消化结束后，置70-75℃加热10-20min，以灭活限制性内切酶；待样品降至室温后，用浓度为0.6-0.8％的琼脂糖进行凝胶电泳，以检测宏基因组DNA部分酶切的效果；酶切消化完全、且酶切产物集中在4-10kb范围的内切酶Sau3AI用量为最适酶量，最适酶量范围为0.001-0.006个活性单位/管；(2)宏基因组DNA部分酶切产物的大规模制备根据宏基因组DNA部分酶切预实验所确定的最适Sau3AI用量扩大酶切反应体系，用0.012-0.05个活性单位的Sau3AI对500-2000ng的宏基因组DNA消化1小时，然后用酚∶氯仿小心抽提部分酶切产物两次；用相当于部分酶切产物2倍体积、经0-10℃预冷的无水乙醇进行沉淀，并将沉淀溶于30-200μl的ddH2O中，得到部分酶切产物；用浓度为0.6-1.0％的琼脂糖对部分酶切产物进行凝胶电泳，然后用DNA凝胶回收试剂盒回收4-10kb范围的DNA片段，并将回收的4-10kb范围的DNA片段置-20℃保存；(3)pGEM3Zf(+)载体的酶切和去磷酸化，对pGEM3Zf(+)载体依次用BamHI完全酶切以及牛小肠碱性磷酸酶去磷酸化处理；(4)用经回收的宏基因组DNA部分酶切片段与pGEM3Zf(+)载体按6∶1-1∶4的比例进行连接，直接用获得的连接产物电转化大肠杆菌缺陷株K，获得转化子；将转化子涂布于含0.2M NaCl或者是含5mM LiCl的LBK固体培养基，LBK固体培养基的配制方法10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5-6.5g氯化钾，15-20g琼脂粉；用去离子水定容至1000mL，121℃灭菌20-30min。待降至50-65℃时，向其中加入50-100mg氨苄青霉素，混匀，然后倒平板；35-37℃培养16-24小时，获得阳性克隆；(5)挑取阳性克隆依次进行质粒的快速检测、质粒提取和测序鉴定。
3.如权利要求1所述的一种高通量克隆微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因的方法，其特征是根据阳性克隆携带重组质粒的序列比对结果，对Na+/H+逆向转运蛋白基因的全长进行亚克隆，并将亚克隆基因连接到pGEM3Zf(+)载体，然后用获得的重组质粒再次转化大肠杆菌缺陷株K，获得仅携带Na+/H+逆向转运蛋白单一基因或基因簇的重组子。
4.如权利要求1所述的一种高通量克隆微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因的方法，其特征是翻转膜的制备培养并收集各重组子和阴性对照菌株的菌体，用French Press方法以1,500-2,500 p.s.i.的系统压力破碎细胞，然后80,000-100,000×g超速离心1-2小时，将获得的翻转膜置-70--80℃保存备用。
5.如权利要求1所述的一种高通量克隆微生物Na+/H+逆向转运蛋白基因的方法，其特征是Na+/H+逆向转运蛋白的活性测定在pH4.5-9.5下，利用吖啶橙作为荧光探针，向含有翻转膜的反应体系中添加Tris-L-乳酸钾或Tris-L-乳酸至终浓度为5-10mM，使荧光强度逐渐猝灭，并通过荧光分光光度计监控跨膜pH梯度的变化；荧光监测参数为激发光EX波长430-505nm，发射光EM波长510-530nm；当荧光强度下降至稳态时，向反应体系加入终浓度为2-10mM的NaCl、LiCl或KCl，根据荧光强度的恢复程度判断并表示翻转膜中Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性的大小以及转运单价阳离子的特异性；然后，在pH4.5-9.5条件下，使用不同浓度的NaCl、LiCl或KCl分别测定翻转膜中的Na+/H+、Li+/H+和K+/H+逆向转运蛋白活性；以底物浓度和荧光强度作双倒数图，并由此计算Na+/H+逆向转运蛋白对Na+、Li+和K+的表观Km值和Vmax值。
全文摘要
本发明属于微生物工程领域，涉及一种从高盐环境微生物中高通量克隆微生物Na
文档编号C12Q1/68GK101092629SQ20071009967
公开日2007年12月26日 申请日期2007年5月28日 优先权日2007年5月28日
发明者杨礼富, 王真辉 申请人:中国热带农业科学院橡胶研究所