专利名称：：与鼻咽癌的发生相关的mmp2基因多态性及其检测方法
技术领域：
：本发明涉及鼻咽癌的人群预防中的个体易感性及其遗传学检测方法。具体地，本发明涉及与鼻咽癌患病风险相关的易感基因MM尸2的基因型检测方法。本发明进一步涉及上述易感基因基因型的检测试剂盒，以及该试剂盒的应用。另外，本发明还涉及上述检测方法和易感基因在鼻咽癌的预防和控制以及遗传咨询中的应用。
背景技术：
：鼻咽癌(Nasopharyngealcarcinoma,NPC,MIM161550)在世界大多数地方均是比较罕见的肿瘤类型，但是在东南亚却特别流行。多种环境因素与鼻咽癌发病风险相关，这些因素包括EB病毒(Epstein-Barrvirus,EB)感染，长期吸烟，职业暴露于甲醛，以及各种饮食因素，等等。此外，涉及致癌作用各阶段的基因的遗传多态性也在个体对鼻咽癌的遗传易感性中发挥重要作用，这提示遗传易患因素也可能是鼻咽癌发病率在种族和地理上发生明显差异的重要原因。鉴定鼻咽癌的易感基因有助于预测鼻咽癌发生的个体风险和群体风险，且有助于阐明与此疾病相关的发病机制。基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,MMP)是可选择性降解许多种胞外基质和非基质蛋白的蛋白酶家族。根据底物特异性，现在有超过20种人类MMP归类为胶原蛋白酶、间质溶解素、明胶酶和膜型MMP。其宽广的底物范围使得MMP在正常生理过程和病理状态下均发挥着重要作用。关于肿瘤，MMP能够调节肿瘤微环境；与正常组织相比，它们的表达和活性在几乎所有人类肿瘤中均升高。起初，MMP被认为仅参与肿瘤的侵袭和转移过程，但是近来有研究表明MMP涉及肿瘤发生的多个步骤，包括肿瘤细胞的生长、分化、凋亡、迁移与侵袭、肿瘤血管发生的调节以及免疫监视。基于上述的MMP在肿瘤发病机制中的作用，我们假设MMP是极佳的肿瘤的候选易感基因。预计MM尸基因内的遗传多态性在肿瘤发生风险上可能具有基因型依赖性的差异。位于多个Mvl/P基因启动子区域的一些多态性可能以等位特异性的方式影响相应MMP的表达水平，这些多态性已得到广泛的研究。这些多态性分别是Mj^尸/中的-16071G/2G(rsl799750)、MM户2中的C-1306T(rs243865)和C-735T(rs2285053)、MM尸3中的-16125A/6A(rs3025058)、MM尸7中的G-181A(rsl7880821)、MMP9中的C陽1562T(rs3918242)、MM户"中的G-82A(rs2276109)以及MM尸"中的G-77A(rsl7860523)。越来越多的证据显示这些遗传多态性可能在众多肿瘤的易感性方面导致个体间的差异。例如，MM尸7启动子区的-16071G/2G可产生Ets-l结合位点并增强转录活性，该多态性与头颈癌、肺癌、结肠直肠癌和卵巢癌的风险增加有关。近来有研究认为可影响il^MiV启动子转录活性的G-181A与卵巢癌、乳腺癌、食管癌、胃癌和肺癌的易感性增加有关。然而，il^^尸基因多态性在鼻咽癌发生中的作用尚未见报道。在本发明中，我们研究了Mi^P启动子区域的功能性多态性位点是否在鼻咽癌发生风险上发挥作用。
发明内容发明人考察了多个MM尸基因的多态性位点(包括MM尸7中的-16071G/2G、MM尸2中的C-1306T和C-735T、MMP3中的-16125A/6A、MWP7中的G-181A、TliMi^中的C-1562T、MM尸"中的G-82A以及MM户"中的G-77A)与鼻咽癌易感性的相关性。通过基于医院的病例对照研究，进行了大量的临床和实验室实验和大样本的统计分析，判明携带ikari^-1306CC基因型、-735CC基因型或携带由此两位点组成的C-函-C-735单倍型的个体对鼻咽癌有更高的易感性。因此本发明鉴定了鼻咽癌的一种新的易感基因及易感基因型和单倍型。本发明还提供了一种检测与鼻咽癌易感性关联的易感位点Afl^尸2C-1306T及C-735T的方法，该方法为PCR-直接测序法。本发明还提供了一种检测与鼻咽癌易感性关联的易感单倍型^fltf^C.]3Q6-C.735的方法，该方法为以PHASE程序计算单倍型结果的方法。本发明还提供了通过检测MM户2基因的C-1306T位点、C-735T位点或由此两位点组成的单倍型来判定个体对鼻咽癌是否易感的方法。本发明还提供了分别用于检测多态性位点C-1306T及C-735T的引物对。本发明进一步提供了分别用于检测与鼻咽癌关联的MM尸2基因的C-1306T及C-735T位点的试剂盒，以及上述试剂盒在人群中预防与控制鼻咽癌的应用。一、如上所述，本发明提供了一种检测与鼻咽癌易感性关联的il^/P2基因的C-1306T及C-735T位点的方法，该方法为PCR-直接测序法。具体的说，包括了如下步骤1、分别对MM户2基因C-1306T及C-735T位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；2、对扩增的含有C-1306T位点和C-735T位点的PCR产物直接测序，并以此判明MM尸2基因C-1306T及C-735T位点的基因型。二、另一方面，本发明还提供了与鼻咽癌易感性关联的易感基因型和单倍型，即MMP2基因的-1306CC和-735CC基因型为鼻咽癌的易感基因型，由上述两个位点组成的C.13Q6-C.735单倍型为鼻咽癌的易感单倍型。并提供了一种通过检测MMP2基因的C-1306T和C-735T基因型或由此两位点组成的单倍型来判定人群或个体对鼻咽癌易感性的方法。该方法包括1、分别对i^l/P2基因C-1306T位点和C-735T位点所在区域设计基因序列特异性引物，并对样本基因组DNA进行热启动和梯度的特异性PCR扩增；2、对PCR产物分别进行测序，并以此判明MM尸2基因C-1306T位点和C-735T位点的基因型；3、当某一个体的MM尸2基因的C-1306T位点表现为-1306CC基因型，或者C-735T位点表现为-735CC基因型，或者由PHASE程序计算出的此两位点构成的单倍型表现为C.1306-C.735时，则表明该个体患鼻咽癌的可能性更高。三、检测MM尸2基因C-1306T位点基因型的特异性引物对的序列为正向引物5'-CCCTCCCAAGAGGGTCCTTTA陽3'反向引物5'-AGCTGTGATGGGGAACTCCAG陽3'检测MMP2基因C-735T位点基因型的特异性引物对的序列为正向引物5'-CAAAATTGGGATTCGACCTGA-3'反向引物5'-GGCCTCGTATAGTGCGAGATG-3'四、本发明进一步提供了检测与鼻咽癌关联的^Ckff2基因的C-1306T位点及C-735T位点的试剂盒，其内装有一个或多个容器，容器内装有用以检测C-1306T位点及C-735T位点基因型的一种或多种组分。与之同时提供的可以是经政府食品与药品监督管理部门审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售方面的信息。例如，在DNA的PCR扩增方法实施中，直接检测样品的C-1306T位点及C-735T位点的基因型的试剂盒，含有PCR的引物对(5'-CCCTCCCAAGAGGGTCCTTTA-3'和5'-AGCTGTGATGGGGAACTCCAG-3';5'陽CAAAATTGGGATTCGACCTGA-3'和5'-GGCCTCGTATAGTGCGAGATG-3')，dNTPs，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等。本领域技术人员己知，以上的组分仅是示意性的，所述用于PCR反应的DNA聚合酶可以是TaqDNA聚合酶，例如，HotStarTaq酶Klenow片段，TthDNA聚合酶，VENTDNA聚合酶等能够用于PCR扩增的酶。但为保证特异性扩增，除了引物和反应条件的优化外，应优选HotStarTaq酶。使用方法说明如下1、C-1306T位点所在区域的PCR扩增对样品基因组DNA(其具体制备方法参见实施例)，用本发明提供的引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增25(al反应体系为10ng基因组DNA，2引物，2.5mMdNTP，0.6UTaKaRaEXTaqDNA聚合酶以及10XEXTaqBuffer(含Mg2+)。95°C15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94。C30s和72。C50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从65。C开始每个循环降0.5。C，第二阶段扩增的退火温度则固定在59。C，最后的72'C延伸时间为7min。PCR产物经常规测序，根据峰图判断基因型。2、C-735T位点所在区域的的PCR扩增对样品基因组DNA(其具体制备方法参见实施例)，用本发明提供的引物，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增25(^1反应体系为10ng基因组DNA，2pM引物，2.5mMdNTP，0.6UTaKaRaEXTaqDNA聚合酶以及10XEXTaqBuffer(含Mg2+)。95。C15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94°C30s和72°C50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从64。C开始每个循环降0.5。C，第二阶段扩增的退火温度则固定在58。C，最后的72'C延伸时间为7min。PCR产物经常规测序，根据峰图判断基因型。五、本发明还提供了与鼻咽癌易感性关联的Mikf尸2基因C-1306T基因型、C-735T基因型以及由此两位点组成的单倍型的检测方法及其在鼻咽癌人群预防和控制中的应用。例如，由于本发明证实了i/MP2基因的-1306CC基因型、-735CC基因型或由此两位点组成的C.^6-C.735单倍型与鼻咽癌易感性存在关联，因此，在鼻咽癌人群的预防和控制中，就需要对所咨询的对象进行MMP2基因C-1306T和C-735T位点的基因型进行分析，以判断该对象是否携带有鼻咽癌易感基因型-1306CC、-735CC或C-no6-C.735单倍型(表现为对鼻咽癌具有更高的易感性)。对具有基因型-1306CC、-73503或(113()6-(1735单倍型的个体，则可对之进行科学的干预，例如建议及早进行治疗性预防等，这样可以针对性地降低这些易感人群的鼻咽癌的发生风险。具体实施例方式实施例l该实施例设计并合成了两套引物对，并且在该引物对的基础上，设计了一种检测与鼻咽癌易感性关联的MMP2基因C-1306T位点基因型、C-735T位点基因型及由此两位点组成的单倍型的方法。1、基因组DNA的提取采取本领域酚/氯仿法提取外周血白细胞的基因组DNA。1)取柠檬酸钠或EDTA-Na2抗凝全血5ml(尽量不用肝素抗凝)，置于50ml有盖离心管；2)加入3-5倍体积冷蒸馏水，反复颠倒混匀，冰中放置5分钟，4°C2000rpm离心20分钟；3)缓慢倾倒上清，沉淀加入预冷的0.1。/。Triton-X100(体积同上)，轻柔混匀沉淀，如上离心，弃上清；4)沉淀加入4ml裂解液(50MmTris-Cl-10mMEDTA,pH8.0)，彻底打碎沉淀，然后加入10%SDS至终浓度为0.5%，混匀；5)加入蛋白酶K(10mg/ml)至终浓度为200pg/ml，混匀，55°C3小时或37。C过夜消化(以过夜消化为佳)；6)加入等体积平衡酚，倒转混匀，4000rpm离心IO分钟，将上清转移至另一个有盖离心管；7)转移上层水相，重复酚抽提一次；8)转移上层水相，加入等体积的氯仿异戊醇(24:1)，倒转混匀，4000rpm离心10分钟；9)转移上层水相，加入1/1O体积的3mol/L乙酸钠(pH5.2)和2.5倍体积预冷的无水乙醇混匀；10)置液氮冷冻10分钟或-2(TC60分钟后，4000rpm离心10分钟；11)以70%乙醇洗涤沉淀12次，吹干或真空抽干；12)以0.5mlTE(10mMTris-Cl-EDTA，pH8.0)或蒸馏水溶解DNA沉淀，电泳检测DNA片段大小，或测260/280nmOD比值。2、PCR扩增用本发明提供的扩增C-1306T位点所在区域的引物对(检测C-735T位点则选用与其相对应的PCR引物对)，按照如下反应体系和条件进行PCR扩增25^1反应体系为10ng基因组DNA，2引物，2.5mMdNTP，0.6UTaKaRaEXTaqDNA聚合酶以及10XEXTaqBuffer(含Mg2。。95。C15min预变性后进行2个阶段的扩增，其变性和延伸条件一致，均为94°C30s和72°C50s，在第一阶段的13个循环中，退火温度从65°C(对C-735T位点则是64°C)开始每个循环降0.5°C，第二阶段扩增的退火温度则固定在59°C(对C-735T位点则是58°C)，最后的72'C延伸时间为7min。PCR产物以测序法鉴定C-1306T和C-735T这2个位点的基因型。3、单倍型构建将经过PCR-直接测序方法得到的C-1306T位点和C-735T位点基因型数据输入PHASE程序，可以计算得到各个体的单倍型。实施例2该实施例用实施例1建立起来的方法，对两个人群(广西人群593例鼻咽癌患者和480例对照；广东人群239例鼻咽癌患者和286例对照)的MMi32基因的C-1306T位点基因型、C-735T位点基因型及由此两位点组成的单倍型进行了分析。1、试验对象本研究包括两个鼻咽癌病例对照人群，其居住地分别是中国南方的广西壮族自治区和广东省。广西人群包括593例鼻咽癌患者和480例对照。所有的个体均是居住于南宁市及周边地区的血缘上无关的中国人。鼻咽癌患者在2003年9月至2005年7月间连续从广西肿瘤医院(中国南宁)收集，均是新诊断并经过病理上确认的，且不患有其它肿瘤。患者的反应率是95%。肿瘤的分期根据1997年AJCC体系的国际TNM(TumorNodeMetastasis)分期法进行。所有的TNM分期由医院的资深病理学家在术后组织病理学检查的基础上决定。对照从一社区肿瘤筛查计划中随机选取，该计划的目的是为了早期确诊肿瘤，其实施是在鼻咽癌患者收集的同一时期和同一地区进行的。对照的选择标准包括无肿瘤个人史，且与病例的年龄匹配。对照的反应率是91%。每个参与者均签署知情同意书，通过结构化的问巻来收集个人的人口统计学资料，病史，吸烟史和饮酒史。广东人群包括239例鼻咽癌患者和286例对照，均为血缘上无关中国成年人，于2000年2月至2003年5月间从广州市和周边地区收集。简而言之，共239例鼻咽癌患者从广州市南方医院和江门中心医院收集。患者的唯一选择标准是其鼻咽癌诊断已得到病理学确诊。对照组包括286例无关献血者、实验室人员和医务人员。对照的选择标准是没有肿瘤及其它严重疾病的个人史和家族史。本研究得到中国国家人类基因组中心伦理委员会的批准。2、MM尸2基因C-1306T、C-735T位点基因型及由此两位点组成的单倍型的确定两个人群中71^//^基因C-1306T位点和C-735T位点的基因型的频率分布如表1所示。在广西人群中，对C-1306T而言，与-1306TC或TT基因型相比，-1306CC基因型与鼻咽癌发病风险增加有关，OR值为2.01[95%置信区间(95%CI)=1.30-3.10;P=0.0017，见表l]。类似地，对C-735T而言，与-735TC或TT基因型相比，-735CC基因型与鼻咽癌发病风险增加有关(OR=1.56,95%CI=1.17-2.09,P=0.0024，见表1)。此关联在经过多重检验校正后仍然具有显著性意义。当分析局限于低分化鳞状上皮细胞癌患者时，结果大致类似。在广西人群中根据性别、年龄、吸烟和饮酒状态、吸烟量以及民族进行分层分析后，发现与轻度吸烟者相比，重度吸烟者(>19年包数，pack-years)中携带MAff2-1306CC基因型的个体患鼻咽癌的风险显著增加(P<0.001，同质性检验，testforhomogeneity);对MM尸2C-735T基因型而言，结果类似(见表2)。在含有239例鼻咽癌和286例对照的广东人群中也进行了分型以验证MM尸2在广西人群中的关联结果。结果发现，M雄2-1306CC基因型(OR=2.19,95%CI=1.21-3.96，P=0.0083)或陽735CC基因型(OR=1.60,95%CI=1.13-2.28,P=0.0081)在患者中比在对照中更多(见表l)。LD分析显示MMP2C-1306T和C-735T多态性在广西人群(/)'=1.0;P<0.05)和广东人群(D'=0.94;P<0.05)中均处于强的连锁不平衡(linkagedisequilibrium,LD)。我们基于这两个处于强连锁不平衡的位点构建了单倍型并观察到三种单倍型。与单倍型T—13C6-C-735或C.13C6-T.735(单倍型中的两个位点按照C-1306T在前C-735T在后的顺序排列)相比较，C.，-C.735单倍型与鼻咽癌易感性升高相关，其中广西人群的OR值为1.64(95%CI=1.35-1.99:P<0.001)，广东人群的OR值为1.68(95%CI=1.29-2.19,P<0.001)，见表3。在广西人群中进行交互作用分析显示与C13C)6-C735关联的鼻咽癌易感性在重度吸烟者中更加明显(P<0.001，同质性检验，见表3)。因此，用本发明的方法解析了MM尸2的C-1306T位点基因型、C-735T位点基因型及由此两位点组成的单倍型与鼻咽癌的易感性之间的相关性。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但所作改动或修改的等价形式同样落在本中请权利书所限定的范围之内。表1鼻咽癌患者与健康对照中MM尸2基因的C-1306T和C-735T位点基因型的分布<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>吸烟量，年包数S196/1053/751.17(0.40-3.45)<0.00121/2839/600.86(0.43-1.75)<0.001>1912/13110/502.38(1.01-5.60)42/3482/302.21(1.18-4.11)饮酒状态非饮酒着29/45313/2851.70(1.03-2.80)0.35109/140239/1931.58(1.15-2.19)0.53饮酒着21/26207/1172'19(1.17-4,07)74/57158/881.38(0.89-2.14〉民族汉族38/50361/3021.56(1.00-2.47)0.21121/139282/2181.48(1.09-2.02)0.82非汉族12/21159/1002.78(1.30-5.91)62/58115/631.70(1.06-2,75)注MMP2多态性位点的系统术语根据GenBankNTJM0498而来。0R，比值比(oddsratio);CI，置信区间(confidenceinterval)。a病例数/对照数。b数据经过logistic回归分析，并在适用时进行了年龄、性别、吸烟和饮酒状态、吸烟量和民族的校正。MMP2C-1306T和C-735T的次要等位纯和子和杂合子一起(即TT或TC基因型)作为参考组。e在每个分层中OR值的差异。表3广西和广东人群中根据不同潜在风险因素分层后鼻咽癌发病风险与7kfikrP2单倍型之间的关联广西人群广东人群分类T—1306-C—735+C-1306-T-735C-顺-G-735OR(95%CI)MT-J306-C-735+C-i:j恥一T-73iiC—j，—C-7:!iiOR(95%CI广所有个体257/299929/6611.64(1,35-1.99)122/209356/3631.68(1.29-2.19)性别男性183/237673/5311.64(1.31-2.05)88/112238/1901.59(1.14-2.24)女性74/62256/1301.65(1.11-2.46)34/97118/1731.95(1.23-3.07)年龄邻岁134/132488/3261.48(1.12-1.95)60/115180/1771.95(1.34-2.84)〉47岁123/167441/3351.79(1.36-2.35)62/94176/1861.44(0.98-2.10吸烟状态非吸烟者170/200636/4561.63(1.28-2.09)吸烟者87/99293/2051,62(1.16-2.27)吸烟量，年包数S1930/4392/133100(057-1.71)〉1957/56201/72274(172-4.34)饮酒状态非饮酒着156/208558/452160(125-2.06)饮酒着101/91371/199168(120-2.35)民族汉族173/205645/513148(117-189)非汉族84/94284/148214(150-307)注MMP2多态性位点的系统术语根据GenBankNT—010498而来。OR,比值比(oddsratio);CI,置信区间(confidenceinterval)。a病例中单倍型数目/对照中单倍型数目；单倍型根据MMP2C-1306T在前C-735T在后的顺序构建。b(3R值由l0gistic回归计算得来，T^。6-C-735及C-i3。6-T-735单倍型一起作为参考组，且在适用时经过性别、年龄吸烟和饮酒状态、吸烟量以及民族的校正。e在按照吸烟量分层时，同质性检验P值小于0.001;在其它分层情况下，同质性检验P值均大于0.05。参考文献1.BergersG,BrekkenR，McMahonG,VuTH,ItohT，TamakiK，TanzawaK，ThorpeP，ItoharaS,WerbZ，HanahanD.2000.Matrixmetalloproteinase-9triggerstheangiogenicswitchduringcarcinogenesis.NatCellBiol2:737-744.2.DengG，ZhouQZhaiY,LiS,LiX,LiY,ZhangR,YaoZ,ShenY，QiangB,WangY,HeF.2004.AssociationofestrogenreceptoralphapolymorphismswithsusceptibilitytochronichepatitisBvirusinfection.Hepatology40:318-326.3.EgebladM,WerbZ.2002.Newfunctionsforthematrixmetalloproteinasesincancerprogression.NatRevCancer2:161-174.4.ElliottRL,BlobeGC.2005.RoleoftransforminggrowthfactorBetainhumancancer.JClinOncol23:2078-2093.5.FlemingID，CooperJS,HensonDE.1997.AmericanJointCommitteeonCancer.AJCCcancerstagingmanual.5thed.Philadelphia(PA):Lippincott-Raven.6.HeY,ZhouG,ZhaiY,DongX,LvL,HeF,YaoK.2005,AssociationofPLUNCgenepolymorphismswithsusceptibilitytonasopharyngealcarcinomainaChinesepopulation.JMedGenet42:172-176.7.HildesheimA，LevinePH.1993.Etiologyofnasopharyngealcarcinoma:areview.EpidemiolRev15:466-485.8.LahmanC,BergemannJ,HarrisonG,YoungAR.2001.Matrixmetalloproteinase-1andskinaginginsmokers.Lancet357:935-936.9.WerbZ.1997.ECMandcellsurfaceproteolysis:regulatingcellularecology.Cell91:439—442.10.YuC，ZhouY,MiaoX,XiongP,TanW,LinD.2004.Functionalhaplotypesinthepromoterofmatrixmetalloproteinase-2predictriskoftheoccurrenceandmetastasisofesophagealcancer.CancerHes64:7622-7628.11.ZhangJ,JinX,FangS,WangR，LiY,WangN,GuoW,WangY,WenD,WeiL,DongZ,KuangG.2005.Theflmctionalpolymorphisminthematrixmetalloproteinase-7promoterincreasessusceptibilitytoesophagealsquamouscellcarcinoma,gastriccardiacadenocarcinomaandnon-smallcelllungcarcinoma.Carcinogenesis26:1748-1753.12.ZhouQZhaiY,DongX，ZhangX,HeF，ZhouK,ZhuY,WeiH，YaoZ,ZhongS,ShenY,QiangB，HeF.2004.HaplotypestructureandevidenceforpositiveselectionatthehumanIL13locus.MolBiolEvol21:29-35.序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所<120>与鼻咽癌的发生相关的ikfil/P2基因多态性及其检测方法<160>4<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1CCCTCCCAAGAGGGTCCTTTA21<210>2<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>2AGCTGTGATGGGGAACTCCAG21<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3CAAAATTGGGATTCGACCTGA21<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>4GGCCTCGTATAGTGCGAGATG2权利要求1、一种通过检测MMP2基因的C-1306T位点、C-735T位点或由此两位点组成的单倍型来判定个体对鼻咽癌是否易感的方法，其特征在于当某一个体的MMP2基因的C-1306T位点或C-735T位点表现为基因型CC，或由此两位点组成的单倍型表现为C-1306-C-735时，则表明该个体对鼻咽癌具有更高的易感性。2、一种检测MMP2基因的C-1306T位点的基因型的方法，该方法为PCR-直接测序法，即聚合酶链式反应-直接测序法，其特征在于包括以下方面(1)对包含C-1306T多态位点的MMP2基因序列，设计特异性的引物，其序列为正向引物见序列表中序列l;反向引物见序列表中序列2;(2)对包含C-1306T多态位点的MM尸2基因区域，以所设计引物，通过热启动和梯度的聚合酶链式反应，以基因特异性引物进行DNA扩增；(3)对PCR产物以常规测序法测序，根据测序峰图结果判断C-1306T的基因型。3、一种检测MMP2基因的C-735T位点的基因型的方法，该方法为PCR-直接测序法，即聚合酶链式反应-直接测序法，其特征在于包括以下方面(1)对包含C-735T多态位点的MM尸2基因序列，设计特异性的引物，其序列为正向引物见序列表中序列3;反向引物见序列表中序列4;(2)对包含C-735T多态位点的MM尸2基因区域，以所设计引物，通过热启动和梯度的聚合酶链式反应，以基因特异性引物进行DNA扩增；(3)对PCR产物以常规测序法测序，根据测序峰图结果判断C-735T的基因型。4、一种与鼻咽癌易感性关联的il/Mi^基因C-1306T位点的检测试剂盒，包括扩增用基因特异性引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种，以及用于测序的试剂中的一种或多种。5、一种与鼻咽癌易感性关联的MMP2基因C-735T位点的检测试剂盒，包括扩增用基因特异性引物、dNTPs、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液的一种或多种，以及用于测序的试剂中的一种或多种。6、一种检测MM尸2基因的C-1306T位点及C-735T位点组成的单倍型的方法，该方法关键特征是利用2-5项或其它方法得到个体的C-1306T位点及C-735T位点的基因型数据，以PHASE程序计算出个体的单倍型。7、如权利要求l-6任一项所述的方法或其试剂盒在鼻咽癌的人群预防和控制以及遗传咨询中的应用。全文摘要本发明涉及与鼻咽癌患病风险相关的易感基因MMP2的C-1306T、C-735T位点以及由此两位点组成的单倍型的检测方法。所述方法为PCR-直接测序法(即聚合酶链式反应-直接测序法)，单倍型的构建应用PHASE程序进行。本发明进一步涉及检测上述易感位点的试剂盒及其应用。另外，本发明将基因的C-1306T、C-735T位点以及由此两位点组成的单倍型与鼻咽癌的患病风险联系起来，确定了MMP2是鼻咽癌的一个新型易感基因，为鼻咽癌的人群预防和控制提供了新的遗传咨询内容。文档编号C12Q1/68GK101314791SQ200710099669公开日2008年12月3日申请日期2007年5月28日优先权日2007年5月28日发明者周钢桥,张小爱,张红星,芸翟,贺福初申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所