专利名称：单增李斯特菌快速检测试剂盒的制备和使用方法
技术领域：
本发明涉及一种禾拥环介导紫显扩增(LAMP)技术进行菌样的決速检测的方法，具 体是一种单增李斯特菌决速检测试剂盒的第恪和4顿方法。
背景技术：
单增李斯特菌(Listeria monocytohenes)是一种广泛分布于自然界的病菌，在土 壤、地^7jC、污水、^7]C、植物、青{都司料、烂菜中均有该菌存在，所以动顿艮容易食 入该菌，并通过口腔-粪便的途feS行传播。据报道，健康人粪便中单增李氏菌的携带率 为0.6-16%，有70%的人可短期带菌，4-8%的水产品、5-10%的奶及其产品、30%以上的肉 制品及15%以上的家禽均被该菌污染。单核细胞增生李其飛寺氏菌是一种人畜共患病的病 原菌，是李其麻寺菌中唯一能引起人类疾病的一类。人主要ilil食入软奶酪、未充分加热 的鸡肉、未再次加热的热狗、鲜牛奶、巴氏消毒奶、冰激凌、生牛排、羊排、巻1>菜色 拉、芥菜、西红柿、法式馅饼、冻船等而感染单增李其愤寺菌，约占85-90%的病例是由 被污染的食品引起的。该菌也可通过眼及破损iJl夫、粘膜i4A体内而造成感染，孕妇感 染后通过胎盘,道感染胎儿或新生儿,栖居于阴道、子宫颈的该菌也引起感染，性接触 也是本病传播的可f縫径，且有上升趋势。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细 胞增多。
以往检测单增李斯特菌的主要方法有三种1.生理生化鉴定技术，该法费时，操作 繁琐，不能满足病害防治的需要；2.酶联免疫吸附i验，3.聚合酉敏连式反应法(PCR法)， 该方法较前两种方法决速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪。目前尚未见用环介导紫显扩增 方法检测单增李辦寺菌的试剂M方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、特异性强、灵敏度高而且成本低用环介导等温 (Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)方法检测单增李其愤寺菌的试剂盒， 并掛共一种单增李辦寺菌決速检测试剂盒的《顿方法，从而为水产#11和食品安全^(共 科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别耙DNA六个不同序歹啲两个内引 物(上游内弓l物和下游内弓嫩)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，内引物包含 靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内弓胸首先和靶DNA杂交，随后的f體换DNA 合鹏具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外弓嫩启动，释放出单链DNA，
并作为由杂交至脾巴的另一端的一个内弓嫩和一个外弓胸启动的DNA合i^莫板，产生一个 原始的茎环DNA; (3)内弓嫩以原始茎环DNA做模板，启动,體换DNA的合成，产生一 个原始的茎环DNA和一个新的由两倍莲长度的茎环DNA; (4)在等温条件下，内引物以 茎环DNA为模板，通31,连置换形成多M有耙DNA反复重，列的茎环DNA，在一小时 内该循环反应可使耙DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料*11察扩增结果。
本发明涉及的一种单增李其麻寺菌快速检测试剂盒的检测(j顿)方法，其中的试剂 包括如下(1) - (4):
(1) 环介导等温扩增(LAMP)反应液A:
含有10XThermopol反应缓冲液、300—500ymol/L dNTP、 2—4mmol/L硫^f美 (MgS04)、 0.8—1.2pmol/L上游引内物(FIP)、 0. 8—1. 2 umol/L下有内引物(B工P)、 0. 2—0. 3 timol/L上游外引物(F3)、 0. 2—0. 3 " mol/L下游内引物(B3)和l一l. 5mol/L 甜菜硫
其中所述的上游内弓l物5- AGGGGTTGGTTTTTTAGTCACTGTACGCCATTTMGMTCCATC -3; 下游内引物5-MGACCGCACCAMGCTAGCTGTTTTATTTTCCCTMGTACGG-3; 上游外弓l物5HXGCTCTGATMGTGACAT-3; 下游外引物5^CTTGTTTGTTTCTGCTTGTT-3 ;
其中所述的10XThermopol反应缓冲液中含有200mmol/L pH8. 8的三羟基甲基氨基 甲烷一盐酸(Tris—HCl)、 100咖ol/L氯化钾(KC1)、 100mmol/L硫^^安(肌)2S04)、 20mmol/L硫^l美(MgS04)禾口1X曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) 腦酶1U/uL
(3) Bst DNA聚合酶B:每微赠8个活性单位(8U/pL);
(4 )显色剂C:为10 %的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen 。 其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP二2:1:1:1。 上面戶iftl环介导等温扩增(LAMP)反应液A每管23 u L的最佳组成为2. 5 u L 10 XThermopol反应缓冲液、l.Ota 10mmol/L dNTP (四种脱氧核糖核酸的混合物)、1.0 tiL 20umol/L上游内引物(FIP)、 l.OuL 20umol/L下游内引物(BIP)、 0.25uL 20 mol/L上游外弓l物(F3)、0. 25 u L 20 n raol/L下游外弓1物(B3)、0. 5 u L 100ramol/L MgS04、 12. 5 u L 2mol/L甜熟卿4 u L ddH20 (灭菌双蒸水)。
{顿±^试剂盒的制备和4顿方法，依次包括下列(1) - (3)步骤 (1)样品(待检样品或者培养菌液)DNA的提取 A.取200呢待检样品或者1.0—L5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用 台式离心机10000-12000转/分离心5—10min，弃上清液；
B. 加入1.0—1.5raL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5 一10min，弃上清液；
C. 加入100—150 liL灭菌双蒸xK，混匀，100。C沸水浴中加热10—15min;
D. 然后用台式离心机10000-12000转/分离心5—10min，取上清至一个新的1. 5mL 离心管中，即为待^M莫板DNA;
(2) 进行與曾李其万特菌的环介导等温扩增反应
A. 在装有23 p L LAMP反应液A的反应管中加入1 u L待检样品模板DNA，和0. 5 u L的UNG酶，于恒M^属浴上5(TC放置3min，再于恒 j^属浴上95。C放置3—5min，然 后立即置于冰上l一3min;
B. 在上述反应管中加入luL Bst DNA聚合酶B;
C. 于恒M^属浴上60—65。C放置45—90min;
D. 然后将金属浴调到80—95"C中止反应，3—5min后取出待检；
(3) 显色检测
在待检的針反应管中加入1"显色剂C，直接用肉fMi察颜色变化，如果颜色为 黄色，说明待检细菌不是单增李其愤寺菌，如果颜色变为绿色，贝ij说明样品为单增李船寺菌。
本发明粒了单增李斯特菌〖魏检测试剂盒的制备和4顿方法，本试剂龢艮据单增 李辦寺菌的actA基因的基本保守区的六个序歹殿计了两^f寺异性内弓嫩和两M寺异性 外引物，该保守基因序列为单增李其佛摘各不同血清型和菌株型所共有，以保iB人种的 水平上检测不同来源的单增李其M争菌株的可靠性。本发明采用环介导^^尉广增(LAMP) 技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪， 只需普通的金属浴或水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方fe^见察，使用荧光染料来 观察即可，简单而快速。可用于单增李其欣寺菌的检测，特另隨用于基层医疗机构以及养 殖场现场应用。
具体实施例方式
下列实例进一歩说明本发明，但不应当作对本发明的限制。 鄉例l
按下歹鹏己方制作单增李其愤寺菌決速检测试剂盒包括如下(1) - (4):
(1) LAMP反应液A:
2. 5 u L 10 X Thermopol反应缓冲液、1. 0 u L 1O咖ol/L dNTP、 1. 0 y L20 u mol/L 上游内引物(F工P)、 1.0yL20umol/L下游内引物(BIP)、 0. 25 " L20 " mol/L上游外弓| 物(F3)、 0. 25 n L20 u肪1/L下游外弓l物(B3)、 0. 5 u /L 100咖ol/L MgS04、 12. 5 u L 2mol/L
甜熟卿4uL ddH20 (灭菌双蒸水)。
其中所述的上游内引物5- AGGGGTTGGTTTTTTAGTCACTGTACGCCATTTMGMTCCATC -3; 下游内引物5- MGACCGCACCAMGCTAGCTGTTTTATTTTCCCTMGTACGG -3; 上游外弓卿5- CGGCTCTGATMGTGACAT-3; 下游外引物5_ GCTTGTTTGTTTCTGCTTGTT-3 ;
其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP二2:1:1:1。 其中所述的lOXThermopol反应缓冲液中含有200咖ol/L pH8. 8的三羟基甲基tt 甲烷一盐酸(Tris—HCl)、 100nmol/L氯化钾(KC1)、 100mmol/L硫酸银((肌)2S04)、 20mmol/L硫酸1美(MgS0j禾口1X曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) UNG酶1U/uL
(3) Bst DNA聚合酶B:每微升含8个活性单位(8U/pL);
(4) 显色剂C:为10X的荧光染料SYBR GREEN I。
按照以下辦进行检测
(1) 细菌DNA的提取
A. 取200 mg待检样品或者1.0过夜培养的菌液，置于1.5raL离心管中，用台式离 心机10000转/分离心0min，弃上清液；
B. 加入1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机12000转/分离心5min，弃上清
液；
C加入100uL灭菌双蒸水，混匀，100。C沸7K浴中加热10 min; D.用台式离心机12000转/分离心5—10min，取上清液至另一个1. 5mL离心管中， 即为待检模板DNA;
(2) 进行单增李其愤寺菌的环介导等显扩增反应
A. 在装有23 u LLAMP反应液A的反应管中加入1 u L待检丰對反DNA禾口 0. 5 u L的UNG 酶，于恒^^属浴上5CTC放置3min，然后再在95。C的^^牛下方爐5min，立g卩置于冰上 lmin;
B. 在上述反应管中加入:ULBst DNA聚合酶B;
C. 于恒M属浴上65。C放置1小时；
D. 将金属浴调到8(TC中止反应，3min后取出待检；
(3) 显色检测
在待检的每个反应管中加入1 "显色剂C，直接用肉船见察颜色变化，如果颜色为 黄色，说明待检样品或者细菌不是大肠杆菌，如果颜色变为绿色，则说明样品为单增李 鹏菌。
鄉例2
按下列配方制作单增李期特菌决速检测试剂盒包括如下(1) - (4):
(1) LAMP反应液A:
2. 5 u L 10 XThermopol反应缓冲液、1. 0 u L 10mmol/L dNTP、 1. 0 ix L20 u mol/L 上游内引物(FIP)、 1.0uL20iimol/L下游内弓l物(BIP)、 0. 25 u L20 u mol/L上游外引 物(F3)、 0. 25 u L20 ii mol/L下游外弓l物(B3)、 0. 5 u /L 100腿ol/L MgS04、 12. 5 u L 2mol/L 舌&^f戯n4iiLddH20 (灭菌双蒸水)。
其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外弓嫩、下游外引物同上。 其中所述的lOXThennopol反应缓冲液中含有200mmo1 pH8. 8的三羟基甲基,甲 垸一盐酸(Tris—HCl)、100咖ol/L氯化钾(KCl)、100咖ol/L硫^l安((肌)2S0丄20,ol/L 硫酉数美(MgS04)和1X曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) 跳酶WuL
(3) Bst DNA聚合酶B:每微升含8个活性单{立(8U/ixL);
(4) 显色剂C:为10X的荧光染料DNAGreen。
按照以下辦进行检测
(1) 细菌DNA的提取
A. 取200呢待检样品或者1.0过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离 心机12000转/分离心10min，弃上清液；
B. 加入1. 5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000转/分离心5min，弃上清
液；
C. 加入100uL灭菌双蒸水，混匀，10(TC沸;K浴中加热10min;
D. 用台式离心机10000转/分离心5min，取上清液至另一个1. 5mL离心管中，即 为待检模板DNA;
(2) 进行单增李其J^寺菌的环介导^M扩增反应
A. 在装有23 u LLAMP反应液A的反应管中加入1 y L待检模板DNA和0. 5 u L的UNG 酶，于恒齡属浴上50。C放置3iiiin，然后再在95。C的条件下放置5min，立即置于冰上 lmin.'
B. 在反应管中加入1 u LBst DNA聚合酶B;
C. 于瞎驢属浴上6(TC放置1小时；
D. 将金属浴调到90。C中止反应，3min后取出待检；
(3) 显色检测
在齡反应管中加入1"显色剂C，直接用肉目M察颜色变化，如果颜色为黄色， 说明待检样品不含或者不是单增李其M寺菌，如果颜色变为绿色，则说明样品含有或者为 单增李鹏菌。
权利要求
1.一种单增李斯特菌快速检测试剂盒，其特征是其中的试剂包括(1)环介导等温扩增反应液A含有10×Thermopol反应缓冲液、300—500μmolmol/L dNTP、2—4mmol/L硫酸镁、0.8—1.2μmol/L上游内引物、0.8—1.2μmol/L下游内引物、0.2—0.3μmol/L上游外引物、0.2—0.3μmol/L下游外引物和1—1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/LpH8.8的三羟基甲基氨基甲烷—盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X—100；其中所述上游内引物5-AGGGGTTGGTTTTTTAGTCACTGTACGCCATTTAAGAATCCATC-3；下游内引物5-AAGACCGCACCAAAGCTAGCTGTTTTATTTTCCCTAAGTACGG-3；上游外引物5-CGGCTCTGATAAGTGACAT-3；下游外引物5-GCTTGTTTGTTTCTGCTTGTT-3(2)UNG酶1U/μL(3)Bst DNA聚合酶B每微升含8个活性单位(8U/μL)；(4)显色剂C为10％的荧光染料SYBR GREENI或者DNAGreen。
2. 根据权利要求1中所述的单增李斯特菌快速检测试剂盒，其特征是上述 的混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。
3. 根据权利要求1中所述的单增李斯特菌快速检测试剂盒，其特征是上述 的环介导等温扩增反应液A每管23ii L的组成为2. 5u L lOXThermopol反 应缓冲液、1.0uL 10mmol/L dNTP、 1.0uL 20ymol/L上游内引物、1.0 U L 20u mol/L下游内引物、0. 25 u L 20 u mol/L上游外引物、0. 25 w L 20 li mol/L下游外引物、0.5iiL 100mmol/L MgSO,、 12.5yL 2mol/L甜菜碱 禾口 4u L ddH20。
4. 一种单增李斯特菌快速检测试剂盒的使用方法，其特征是依次包括下列步骤(1)待检样品DNA的提取A. 取200 mg待检样品或者1.0—1.5mL过夜培养的菌液，置于1. 5mL 离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5 — 10min，弃上清液；B. 加入1. 0—1. 5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5—10min，弃上清液；C. 加入100—150 yL灭菌双蒸水，混匀，IO(TC沸水浴中加热IO — 15min;D. 然后用台式离心机10000-12000 液至一个1.5mL离心管中，即为待检模杉(2)单增李斯特菌的环介导等温扩增A. 在装有23u L LAMP反应液A的反应1 和O. 5uL的UNG酶，于恒温金属浴上5(TC放置3min，然后在95。C放置3 一5min，立即置于冰上1 一3min;B. 在上述反应管中加入1 y L Bst DNA聚合酶B;C. 于恒温金属浴上60 —65。C放置45 — 90min;D. 将金属浴调到80 — 95。C中止反应，3 — 5min后取出待检； (3)显色检测在待检的每个反应管中加入lii L显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化， 如果颜色为黄色，说明待检样品不含或者不是单增李斯特菌，如果颜色变 为绿色，则说明待检样品含有或者是创伤弧菌。转/分离心5 —10min，取其上清 腿；中加入1 u L待检样品模板DNA，
全文摘要
本发明涉及一种单增李斯特菌快速检测试剂盒的制备和使用方法。其中试剂盒内包括环介导等温扩增反应液A、Bst DNA聚合酶B、显色剂C；反应液A含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5-AGGGGTTGGTTTTTTAGTCACTGTACGCCATTTAAGAATCCATC-3、下游内引物5-AAGACCGCACCAAAGCTAGCTGTTTTATTTTCCCTAAGTACGG-3、上游外引物5-CGGCTCTGATAAGTGACAT-3、下游外引物5-GCTTGTTTGTTTCTGCTTGTT-3和甜菜碱；检测单增李斯特菌的方法包括待测样品或者细菌DNA的提取、单增李斯特菌的环介导等温扩增反应和显色检测。本发明的优点是快速、特异性强、灵敏度高，而且成本低。
文档编号C12Q1/04GK101368201SQ20071011518
公开日2009年2月18日 申请日期2007年12月13日 优先权日2007年12月13日
发明者梁成珠, 肖西志, 雷质文, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心