专利名称：大肠杆菌快速检测试剂盒的制备和使用方法
大肠杆菌快速检测试剂盒的制备和使用方法駄领域本发明涉及一种利用环介导^^显扩增(LAMP)技术进行菌样盼决速检测的方法，具 体是一种大肠杆菌快速检测试剂盒的制备和使用方法。
技术背景大肠杆菌(Vibrio cholerae)是一种广泛分布在人和动物肠道中的菌种。大肠杆菌 是埃希氏属细菌，是Escherich在1885年发现的，在相当长的一段时间内， 一直被当作 正常肠道菌群的组成部分，认为是非致病菌。直到20世纪中叶，才认识到一^f寺殊血清 型的大肠杆菌对人和动物有病原性，尤其对婴儿和幼畜(禽)，常引起严動复泻和败血症， 它是一种普通的原核生物，是人类和大多数温血动物肠道中的正常茵群。但也有某些血 清型的大肠杆菌可弓跑不同症状的腹泻，根据不同的生物学特性将致病性対射干菌分为 5类致病性大肠杆菌(EPEC)、肠产毒性大肠杆菌(ETEC)、肠侵袭性大肠杆菌(EIEC)、 肠出血性大肠杆菌(E. 1〃IEC)、肠黏附性大肠杆菌(EAEC)。大肠杆菌生活在人和动物肠 道中，不生活在水中，如果在水中发现，说明水被粪便污染。卫生学上常以大肠杆菌作 为检查水源是否被粪便污染附旨标。大肠杆菌繁殖腿，培养容易，变异容易被检出， 因此是生物学上的重要实验材料。大肠杆菌对于^T遗传学的建立和发展以及生物工程 的兴起對军了重要作用。大肠杆菌的致病物质为定居因子，即大肠杆菌的菌毛和肠毒素，此外鹏旨多糖的 类脂A具有毒性，O特异多糖有抵抗宿主防很卩屏障的作用。大肠杆菌的K抗原有吞噬作用。由大肠杆菌导致的疾病1、肠道外感染。多为内源性感染，以泌尿系感染为主， 如 炎、膀胱炎、肾盂肾炎。也可引起腹膜炎、胆囊炎、阑尾炎等。婴儿、年老体弱、 慢性消耗性疾病、大面积烧伤患者，大肠杆菌可侵入血流，引起败血症。早产儿，尤其 是生后30天内的新生儿，易患大肠杆菌糊細莫炎；2、急性膨写。某些血清型大肠杆菌 能引起人类腹浑。其中肠产毒性大肠杆菌会引起婴幼儿和旅游者腹泻，出现，水泻， 也可呈严重的霍乱样症状。腹泻常为自限性， 一般2 3天即愈，营养不良者可达数周， 也可反^作。肠致病性大肠杆菌是婴儿腹湾的主要病原菌，有高度传染性，严重者可 致死。细菌侵入肠道后，主要在十二指肠、空肠和回肠上段大量繁殖。此外，肠出血性 大肠杆菌会弓胞散发性或暴发性出血性结肠炎，可产生志贺氏毒素样细胞毒素。以往检测大肠杆菌的主要方法有三沐1.生理生化鉴定技术，该法费时，操作繁琐， 不能满足病害防治的需要；2.酶联免疫吸附试验，3.聚合S敏连式反应法(PCR法)，该 方法较前两种方 去决速、灵敏，但需要昂贵的PCR仪。目前尚未见用环介导等温扩增方 法检测大肠杆菌的试剂錢方法。发明内容本发明的目的是^f共一种快速、特异性强、灵每娘高而且) 低的用环介导等显扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)方法检测大肠杆菌的试剂盒， 并衞共一种大肠杆菌决速检测试剂盒的检测({顿)方法，，从而为水产辭直和食品安全 IH共科学的依据和指导作用。本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别革巴DNA六个不同序歹啲两个内 引物(上游内引物和下游内弓嫩)和两个外引物(上游外引物和下游夕卜弓胸)，内引物包 含革巴DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内弓l物首先和靶DNA杂交，随后的链置换DNA 合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外弓l物启动，释放出单链DNA， 并作为由杂交到靶的另一端的一个内弓l物和一个外弓i物启动的DNA合成模板，产生一个 原始的茎环DNA; (3)内弓胸以原始茎环DNA做樹及，启动f體换DNA的合成，产生一 个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环DNA; (4)在^^显条件下，内引物以 茎环DNA为^il反，Mil链置换形成多^有革E DNA反M,列的茎环DNA，在一小时 内该循环反应可使革巴DNA累积到109拷贝，可通过荧光染料来观察扩增结果。本发明涉及的一种大肠杆菌快速检测试剂盒的制备和使用方法，其中的试剂包括如 下(1) - (4):(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液A:其中包括10XThermopol反应缓冲液、300—500 umol/L dNTP、 2—4mmol/L硫酸 镁(MgSCU、 0.8—1.2umol/L上游引内物(FIP)、 . 8—1. 2 u mol/L下有内引物(BIP)、0. 2—0. 3umol/L上游外引物(F3)、 0. 2—0. 3 umol/L下游内引物(B3)和l一l. 5mol/L 甜熟咸。其中戶，的上游内引物5KXXGTTMACTGAGTTTGCTCAGTCCA GGCTGAMTTACTCMC-3;上游外弓l物5-TGACAGCGATCTTTCTTCT-3; 下游外弓l物5"CGATATTAAAACCGTCCAGG-3 。其中dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP二2:1:1:1。 其中所述的10 X Thermopol反应缓冲液中含有200mmol/L pH8. 8的三羟基甲基, 甲烷一盐酸(Tris—HC1)、 lOOmmol/L氯化钾(KC1)、 100咖ol/L硫M^安((NH4) 2S04)、 20mmol/L硫^l美(MgS04)禾口1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) UNG酶1U/uL;(3) Bst隐聚合酶B: 8U/化(4) 显色剂C:为10X的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面戶，环介导等温扩增(LAMP)反应液A每管23yL的最佳会滅为2.5uL 10XThermopol反应缓冲液、1. 0 u L lOramol/L dNTP、 1. 0 u L 20 u mol/L上游内弓l物(FIP)、1. OuL 20timol/L下游内弓l物(BIP)、 0. 25u L 20ixmol/L上游外引物(F3)、 0. 25pL20]i mol/L下游外弓(物(B3)、 0. 5 y L 100咖ol/L MgS04、 12. 5卩L 2mol/L甜^ 殿卩4 n L ddH" (灭菌双蒸水)。^ffl，试剂盒检测大肠杆菌的方法，依次包括下列(1) - (3)步骤(1) 样品(待检样品或者培养菌液)DNA的提取A. 取200mg待检样品或者1.0—1.5mL过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用 台式离心机10000-12000转/分离心5—10min，弃上清液；B. 加入1. 0—1. 5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000转/分离心5 一10min，弃上清液；C. 加入100—150 uL灭菌双蒸水，混匀，l(XTC沸水浴中加热10—15min;D. 然后用台式离心机10000-12000转/分离心5—10min，取上清至一个新的1. 5mL 离心管中，即为待检模板DNA;(2) 进行大肠杆菌的环介导等显扩增反应A. 在装有23 " L LAMP反应液A的反应管中加入1 u L待检样品t對反DNA，和0. 5 " L的UNG酶，于瞎驢属浴上5(TC放置3min，再于恒M^属浴上95。C放置3—5min，然 后立即置于冰上l一3min;B. 在，反应管中加入luLBst DNA聚合酶B;C. 于恒^^属浴上60—65。C放置45—9(Mn;D. 将金属浴调到80—95T:中止反应，3—5min后取出待检；(3) 显色检测在待检的每个反应管中加入lyL显色剂C，直接用肉船见察颜色变化，如果颜色为 黄色，说明待检样品或者细菌不含或者不是大肠杆菌，如果颜色变为绿色，则说明样品 含有或者是大肠杆菌。本发明粒了大肠杆菌快速检测试剂盒的制备和4顿方法，本试剂舒艮据大肠杆菌 的f liC基因的基本保守区的六个序列设计了两W寺异性内引物和两M寺异'龄卜弓嫩，该 保守基因序列为大肠杆菌各不同血清型和菌株型所M，以保ffiM种的水平上检测不同 来源的大肠杆菌株的可靠性。本发明采用环介导等温扩±曾(LAMP)技术，该技术特异性 强，与PCR检测方法有相同的高灵每娘，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的金属浴或 水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方 ail察，4柳荧光染料^11察即可，简单而快 速。可用于大肠杆菌的检测，特别适用于基层医疗机构以及养殖场现场应用。
具体实施方式
下列实例进一步说明本发明，但不应当作对本发明柳蹄iJ。 实施例l按下列配方制作大肠杆菌决速检测试剂盒，包括如下(1) - (4):(1) LAMP反应液A:包括2. 5 u L lOXThermopol反应缓冲液、1. 0 u L 10腿ol/L dNTP、 1. 0 u L20 u mol/L上游内引物(FIP)、 1.0uL20"mol/L下游内弓i物(BIP)、 0. 25 y L20umol/L上游外引 物(F3)、 0. 25 u L20 p mol/L下游外弓|物(B3)、 0. 5 u /L 100咖ol/L MgS04、 12. 5 u L 2mol/L 甜熟戯口"L ddH20 (灭菌双蒸水)。其中所述的上游内引物5"GCCGTTAAACTGAGTTTGCTCAGTCCAGGCTGAMTTACTCMC-3;上游外弓l物5-TGACAGCGATCTTTCTTCT-3; 下游外弓l物5"CGATATTMAACCGTCCAGG-3。其中所述的lOXThermopol反应缓冲液中含有200mmol/L pH8. 8的三羟基甲基氨基 甲烷一盐酸(Tris—HCl)、 100臓ol/L氯化钾(KC1)、 100咖ol/L硫^l安((肌)2S04)、 20咖ol/L硫^f美(MgS04)禾口1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) 艦酶1U/uL(3) Bst DNA聚合酶B:每微升含8个活性单位(8U/yL);(4) 显色剂C:为10X的荧光染料SYBR GREEN I。按照以下程序进行检测(1) 细菌DNA的提取A. 取200 mg待检样品或者1.0过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离 心机10000转/分离心0min，弃上清液；B. 加入1.5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机12000转/分离心5min，弃上清液；C. 加入100uL灭菌双蒸水，混匀，100。C沸水浴中加热10 min;D. 用台式离心机12000转/分离心5—10min，取上清^娃另一个1. 5mL离心管中， 即为待检模板DNA;(2) 进行大肠杆菌的环介导等温扩增反应A. 在歸23 u LLAMP反应液A的反应管中加入1 u L待检模板DNA和0. 5 u L的UNG 酶，于睦驢属浴上5(TC放置3min，然后再在95。C的条件下放置5min，立即置于冰上 lmin;B. 在上述反应管中加入lyLBst DNA聚合酶B;C. 于叵驢属浴上65。C放置1小时；D. 将金属浴调到8(TC中止反应，3min后取出待检；(3) 显色检测在待检的針反应管中加入1^L显色剂C，直接用剛歐见察颜色变化，如果颜色为 黄色，说明待检样品或者细菌不含或者不是大肠杆菌，如果颜色变为绿色，则说明样品 含有或者是大肠杆菌。鄉例2按下列配方制作大肠杆菌快速检测试剂盒包括如下(1) - (4):(1) LAMP反应液A:含有2. 5 u L 10 XThermopol反应衝中液、1. 0 u L 10聽1/L dNTP、 1. 0 u L20 u mol/L 上游内引物(FIP)、 1.0uL20umol/L下游内引物(BIP)、 0. 25 u L20 umol/L上游外引 物(F3)、 0. 25 y L20 y mol/L下游外弓|物(B3)、 0. 5 ii /L 100咖ol/L MgS0b 12. 5 u L 2mol/L甜熟卿4"LddH2。(灭菌双蒸水)。其中戶舰的上游内弓嫩、F游内引物、上游外引物、下游外引物同上。 其中所述的10XThermopol反应缓冲液中含有200mrno1 pH8. 8的三羟基甲基氨基甲烷一盐酸(Tr i s —HC1) 、 100咖ol/L氯化钾(KC1) 、 100mmol/L硫酉数安(肌)2S04) 、 20mmol/L硫酸镁(MgS04)和1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) UNG酶1U/uL(3) Bst DNA聚合酶B:每微升含8个活性单位(8U/"U;(4) 显色剂C:为10X的荧光染料DNAGreen。按照以下禾，进行检测(1) 细菌DNA的提取A. 取200 mg待检样品或者1.0过夜培养的菌液，置于1.5mL离心管中，用台式离 心机10000转/分离心10min，弃上清液；B. 加入1. 5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机12000转/分离心5min，弃上清液；C. 力口入100tiL灭菌双蒸水，混匀，100。C沸水浴中加热15min;D. 用台式离心机12000转/分离心5min，取上清^娃另一个1. 5mL离心管中，即 为待检模板DNA;(2) 进行大肠杆菌的环介导等温扩增反应A. 在装有23 y LLAMP反应液A的反应管中加入1 u L待检模板DNA和0. 5 y L的UNG 酶，于叵齢属浴上5(TC方爐3min，然后再在95。C的^^牛下方爐5min，立即置于冰上 lmin;B. 在反应管中加入luLBst DNA聚合酶B;C. 于瞎j^属浴上6(TC放置1小时；D. 将金属浴调到90。C中止反应，3min后取出待检；(3) 显色检测在待检的齡反应管中加入1"显色剂C，直接用卿歐il察颜色变化，如果颜色为 黄色，说明待检样品或者细菌不含或者不是大肠杆菌，如果颜色变为绿色，则说明样品 含有或者是大肠杆菌。
权利要求
1.一种大肠杆菌快速检测试剂盒，其特征是其中的试剂包括(1)环介导等温扩增反应液A包括10×Thermopol反应缓冲液、300-500μmol/L dNTP、2-4mmol/L硫酸镁、0.8-1.2μmol/L上游内引物、0.8-1.2μmol/L下游内引物、0.2-0.3μmol/L上游外引物、0.2-0.3μmol/L下游外引物和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；其中所述的上游内引物5-GCCGTTAAACTGAGTTTGCTCAGTCCAGGCTGAAATTACTCAAC-3；下游内引物5-GAAATGAAAATTCAGGTTGGTGCTCGCATCAATTTTTGCCAGAT-3；上游外引物5-TGACAGCGATCTTTCTTCT-3；下游外引物5-CGATATTAAAACCGTCCAGG-3。(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶B8U/μL；(4)显色剂C为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 根据权利要求1中所述的大肠杆菌快速检测试剂盒，其特征是上述的混 合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。
3. 根据权利要求1中所述的大肠杆菌快速检测试剂盒，其特征是上述的环 介导等温扩增反应液A每管L的组成为2. 5ii L lOXThermopol反应 缓冲液、1. 0u L lOmmol/L dNTP、 1. 0 u L 20 u mol/L上游内引物、l.OuL 20wmol/L下游内引物、0.25UL 20umol/L上游外引物、0. 25 n L 20 y mol/L下游外引物、0.5uL 100mmol/L MgSO" 12.5uL 2mol/L甜菜碱禾口 4uL ddII2O。4. 一种大肠杆菌快速检测试剂盒使用方法，其特征是依次包括下列步骤 (1)待检样品DNA的提取A. 取200 mg待检样品或者1.0—1.5mL过夜培养的菌液，置于1. 5mL 离心管中，用台式离心机10000-12000转/分离心5 — 10min，弃上清液；B. 加入1. O—l. 5mL灭菌双蒸水，混匀，用台式离心机10000-12000 转/分离心5 — 10min，弃上清液；C. 加入100 — 150 uL灭菌双蒸水，混匀，IOCTC沸水浴中加热IO — 15minjD. 然后用台式离心机10000-12000转/分离心5 — 10min，取其上清 液至一个1.5mL离心管中，即为待检样品模板DNA;(2) 进行大肠杆菌的环介导等温扩增反应A. 在装有23uL LAMP反应液A的反应管中加入luL待检样品模板DNA， 和O. 5uL的UNG酶，于恒温金属浴上5(TC放置3min，然后95。C放置3 — 5min，立即置于冰上1 一3min;B. 在上述反应管中加入1 " L Bst DNA聚合酶B;C. 于恒温金属浴上60 — 65。C放置45 — 90min;D. 将金属浴调到80 — 95。C中止反应，3 — 5min后取出待检；(3) 显色检测在待检的每个反应管中加入luL显色剂C，直接用肉眼观察颜色变化， 如果颜色为黄色，说明待检样品或者细菌不含或者不是大肠杆菌，如果颜 色变为绿色，则说明样品含有或者是大肠杆菌。
全文摘要
本发明涉及一种大肠杆菌快速检测试剂盒的制备和使用方法。其中试剂盒内包括环介导等温扩增反应液A、Bst DNA聚合酶B、显色剂C；反应液A含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5-GCCGTTAAACTGAGTTTGCTCAGTCCAGGCTGAAATTACTCAAC-3、下游内引物5-GAAATGAAAATTCAGGTTGGTGCTCGCATCAATTTTTGCCAGAT-3、上游外引物5-TGACAGCGATCTTTCTTCT-3、下游外引物5-CGATATTAAAACCGTCCAGG-3和甜菜碱；检测大肠杆菌的方法包括待测样品或者细菌DNA的提取、大肠杆菌的环介导等温扩增反应和显色检测。本发明的优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
文档编号C12Q1/68GK101260427SQ200710115180
公开日2008年9月10日 申请日期2007年12月13日 优先权日2007年12月13日
发明者梁成珠, 岩 王, 雷质文, 高宏伟 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心