专利名称：双(5-甲酰基糠基)醚的分离、纯化方法
双(5-甲酰基糠萄醚的分离、纯化方法本发明涉及一种醚的制备方法，尤其涉及一种通过植物组织培养的方法从所培养的仙客来愈伤组织的胞外液体中分离、纯化双(5-甲酰基糠基)醚的方法， 属于植物组织培养领域。
背景技术：
仙客来(Cyclamen/^w'cMill)亦称"兔耳花"、"兔子花"，属报春花科 (primulaceae)仙客来属多年生草本植物，球茎扁球形，叶丛生，花向上反巻，形 似兔耳，有红、白、深红等花色。原产希腊、叙利亚。目前在我国一般作温室 栽培，是北方花卉产业的重要种类之一。仙客来除有观赏价值外，其球茎有多 种生物学活性，在土耳其民间药方有抗生育、促进子宫收縮、通经活血等功能。 仙客来球茎中的化学成分除含有淀粉、胶质等外，主要含有仙客来皂苷。皂苷 类物质具有广泛的生物活性，如抗菌、抗心肌缺氧、抗肿瘤、免疫调节、作为 重组蛋白亚基抗病毒疫苗的佐剂、抗突变与基因保护、促分化、杀精子、治疗 高脂症、在实验性肝损伤中有保肝作用、以及可以作为抗氧化剂等，具有很大 的潜在药用价值而成为近年来海洋药物研究的热点之一。仙客来球茎有多种生物学活性，新鲜球茎制成的一种药膏(ointmentof arlhainta)，可用于驱除蠕虫。使用时涂抹在儿童的肚脐或成人的腹部促使呕吐， 或涂在膀胱部位增加尿液的排除。仙客来的球茎在土耳其民间药方中用于抗生 育、通经活血等。误食其球茎会表现一定的中毒症状，可引发肠炎、盗汗、耳 鸣、甚至痉挛。目前对仙客来中的活性成分的研究较少。相关文献仅有1996年， Ihs Calis等研究的小花仙客来(Cyclamen cowm Miller)和木拉贝仙客来(Cyclamen m/raMeHidebr.)两个野生种球茎中的化学成分的报道。Ihs Calis等从木拉贝仙客 来球茎分离得到6个三萜皂苷化合物，分别是cydaminorin 、脱葡萄糖仙客来阜 苷(deglucocyclamin)、小花仙客来阜苷(cyclacoumin)、仙客来阜苷(cyclamin)、 异仙客来皂苷(isocyclamin)、木拉贝皂苷(mirabilin)。小花仙客来的球茎中分离得 到4个三萜皂苷类化合物，为cyclaminorin、脱葡萄糖仙客来皂苷 (deglucocyclamin)、小花仙客来阜苷(cyclacoumin)、木拉贝内酉旨(mirabilin lactone) o同时研究其生物活性发现，此类物质有促进试验小鼠子宫收縮的功能，而 且有明显的抗真菌活性和相对较弱的抗细菌活性。同样的皂苷脱葡萄糖仙客来 皂苷(deglucocyclamin)据报道在紫金牛科的百两金的根中也含有，此植物的根被 用作泰国的传统药物，用于治疗月经疼痛，有通络活血的功效。据报道百两金 同属植物朱砂根的根中也分离得到了两种新的皂苷，有子宫收縮的功能。朱砂 根的根在中国用于中药药方，主要用来治疗呼吸道感染及月经不调等症状。研 究显示了无论是来自仙客来的球茎还是朱砂根的皂苷在化学结构上有很大的相 似性，同时这种相似性还表现在其传统的药物使用方法上。目前双(5-甲酰基糠基)醚仅从月腺大戟、西南忍冬等植物体内被分离获得， 且报道该化合物对结核菌有一定的抑制活性。利用组织培养方法生产药用成分，已渐渐成为药物生产的新方向之一。它 对探讨和阐明药用植物生理、遗传和活性成分生物合成等一系列理论问题也能 提供一定的实验依据。发明内容本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种新的双(5-甲 酰基糠基)醚的分离、纯化方法。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的 一种从仙客来中分离、纯化双(5-甲酰基糠基)醚的方法，包括以下步骤(1) 按照常规的植物组织培养方法培养得到仙客来愈伤组织的胞外培养液；(2) 将步骤(1)所获得的仙客来愈伤组织的胞外培养液减压浓縮至膏状物，烘 干得浸膏，备用；(3) 将步骤(2)所获得的浸膏酸解，得酸解液；(4) 酸解液过滤，滤液用氯仿萃取1-3次，合并氯仿萃取液，备用；滤渣烘 干包扎，用氯仿回流提取，得氯仿提取液；将氯仿萃取液和氯仿提取液合并， 得氯仿粗提物；将氯仿粗提物浓縮至干用乙醚溶出，得乙醚溶解物；(6)乙醚溶解物减压至干，析晶，氯仿溶解转出，重结晶，即得。 优选的，步骤(l)中的仙客来愈伤组织的胞外培养液按照以下组织培养方法 培养得到仙客来无菌种苗球茎或叶柄接种于下述培养基上1/2MS+6-苄基嘌 呤(6-BA)2mg/l+激动素(KT)0.2 mg/1 +2，4-D 0.5 mg/l;诱导产生胞内愈伤组织； 将胞内愈伤组织连续继代培养于下述液体培养基中1/2MS+6-BA 0.5mg/l+萘乙 酸(NAA)0.5 mg/l;振荡培养(优选的，振荡培养的条件为25°C， 120r/min摇床 培养20天)，得胞外培养液；(MS培养基刘庆昌，吴国良主编的植物细胞培养 技术[M]，中国农业大学出版社，33);步骤(2)中所述的烘干优选用60QC的温度烘干； 歩骤(3)中所述的酸解优选用1N的NH2S04酸解1小时； 木发明人在进行仙客来的组培快繁研究中发现，利用初培养诱导得到的愈 伤组织进行液体培养，愈伤组织不仅增殖速度快，且培养液10d左右即呈现褐红 色，培养液中的愈伤组织也呈现同样的变化，说明有胞内和胞外次生代谢物的 产牛，同时发现培养液被细菌污染的几率非常低，本发明人又深入研究了仙客 來液体培养提取物对常见的几种食品腐败菌的抑菌活性，同时研究并比较了栽 培植株各组分的抑菌活性，以寻找和开发新的抗菌活性成分和食品防腐剂。在 此基础上，本发明人发现，可以从仙客来愈伤组织的胞外培养液中分离并纯化 双(5-甲酰基糠基)醚(经红外、质谱、核磁鉴定，所分离、纯化的产物确系双(5-甲酰基糠基)醚)，实验证实，本发明所分离得到的双(5-甲酰基糠基)醚具有显著
的抑菌活性，尤其可抑制结核菌的活性。本发明方法所分离得到的双(5-甲酰基糠基)醚属液体培养液次生代谢产物 经酸解改构的产物，其含量较高，从1.6升液体培养液即可分离得到130mg左右 的纯品，产率高且有一定的产业化前景，可为结核菌的防治等方面提供需求。
图l薄层层析结果。图2诱导的仙客来愈伤组织。图3仙客来液体培养液。图4晶体a在甲醇溶液中的UV图谱。图5晶体a的IRwm"图谱。图6本发明方法所分离得到晶体(双(5-甲酰基糠基)醚)的EI-MS图谱。图7本发明方法所分离得到晶体a(双(5-甲酰基糠基)醚)的^-NMR图谱。图8本发明方法所分离得到晶体a(双(5-甲酰基糠基)醚^C-NMR的图谱。图9晶体a的13C-dept90的图谱。图10晶体a的13C-deptl35图谱。图ll晶体a的HMBC图谱。图12 晶体a的HSQC图谱。图13晶体a的iH」H COSY谱图谱。JH木实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着 描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何 限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对 本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发 明的保护范围内。
实施例1仙客来无菌种苗球茎或叶柄接种于下述培养基上l/2MS+6-BA2mg/l+KT0.2 mg/1+2，4-D 0.5 mg/l，诱导产生胞内愈伤组织；将胞 内愈伤组织连续继代培养于下述液体培养基中l/2MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.5 mg/l，振荡培养(振荡培养的条件为25°C， 120r/min摇床培养20天)，得到胞外 培养液(1600ml);将胞外培养液减压浓縮至膏状物，6(^C烘干得54g浸膏粉， 将浸膏粉用100ml IN的NH2S04酸解1小时，得酸解液；酸解液过滤，滤液用 氯仿萃取3次，合并氯仿萃取液，备用；滤渣烘干包扎，用氯仿回流提取，得 氯仿提取液；将氯仿萃取液和氯仿提取液合并，得氯仿粗提物；将氯仿粗提物 浓縮至干用乙醚溶出，得乙醚溶解物；乙醚溶解物减压至干，析晶，氯仿溶解 转出，重结晶，得130mg晶体a，理化数据鉴别如下 l.物理特性晶体a熔点测定结果为112-112.5GC，乙醚析晶呈浅黄色针晶，易溶解于 氯仿、丙酮，微溶j^n醉、乙醚，元素分析结果显示，C元素含量为61.63%、 H元素含量为4.25"/。，无N元素。 2.波谱数据品体a在甲醇溶液中的UV (图4)最大吸收峰为280nm， IRvcm"(图5): 3150， 2900、 2360, 1675(s)， 1560， 1435， 1415， 1360， 1280， 1200， 1060-1040， 990， 970, 950， 890， 817， 780， 745，推测可能有羰基的伸縮振动。E1-MS(图6): 234，206,109,81,53,27。 234为该晶体的分子离子峰，基峰为 U)9',山质谱结合元素分析可推出化合物的分子式为C12H1Q05。分子的不饱和度 为8，推侧可能含有芳环结构。^-NMR(DMSO，图7)显示四组核磁峰号9.57， 7.49， 6.74， 4.61，峰面积 为l: 1: 1: 2, 13C-NMR(DMSO，图8)有6个碳信号63.69， 112.28， 123.71， 152.31， 157.24， 178.37，推测此化合物为一对称结构。由^-dept90(图9)、 "C-deptl35(图IO)可知63.69属仲碳，112.28、 178.37和123.71属叔碳，152.31
和157.24属季碳。由、HMBC(图11)、 HSQC(图12yH」H COSY谱(图13)推测 晶体a分子结构如下结合相关文献数据(月腺大戟根的有效成分鉴定，张涵庆等，植物学报， 1987， 29(4): 429-431)进一步证实其结构是正确的。该晶体a为双(5-甲酰基 糠基)醚。核磁各相关信号归属如下^-NMR : 4.61(6-H,6'-H),6.74(3-H,3'-H)， 7.49(4-H,4'-H) ， 9.57(誦CHO上7-H， 7'-H) 。
13C-NMRS: 63.69(6-C, 6'-C)， 112.28(3-C,3'-C) ， 123.71(4-C，4'國C) ， 152.31 (2國C,2'-C) ， 157.24(5-C,5'-C)， 178.37(-CHO上7-C， 7'-C)。将实施例1所制备的晶体a与仙客来愈伤组织、仙客来液体培养液和仙客 来栽培植株球茎的氯仿提取物共薄层层析，以氯仿乙酸乙酯15: l为展开剂， 紫外254nm观察，由薄层层析可以看出，各供试材料的氯仿提取物中均没有与 双(5-甲酰基糠基)醚相同的成分(图1)，说明本发明方法所制备得到的双(5-甲酰 甚糠趣),是仙客来液体培养液次生代谢产物经酸解改构后的化合物。试验例权利要求
1、一种从仙客来(Cyclamen persicum Mill)中培养、分离及纯化双(5-甲酰基糠基)醚的方法，包括(1)按照常规的植物组织培养方法培养得到仙客来愈伤组织的的胞外培养液；(2)仙客来愈伤组织的的胞外培养液减压浓缩至膏状物，烘干得浸膏粉；(3)浸膏粉酸解，得酸解液；(4)酸解液过滤，滤液用氯仿萃取1-3次，合并氯仿萃取液，备用；滤渣烘干包扎，用氯仿回流提取，得氯仿提取液；将氯仿萃取液和氯仿提取液合并，得氯仿粗提物，将氯仿粗提物浓缩至干用乙醚溶出，得乙醚溶解物；(5)乙醚溶解物减压至干，析晶，氯仿溶解转出，重结晶，即得。
2、 按照权利要求1的方法，其特征在于，步骤(l)中所述的仙客来愈伤组 织的胞外培养液按照以下组织培养方法培养得到将仙客来无菌种苗球茎或叶 柄接种于下述培养基中1/2 MS+6-BA 2mg/l+KT 0.2 mg/1 +2,4-D 0.5 mg/l;诱导产生愈伤组织；将愈伤组织连续继代培养于下述液体培养基中1/2 MS+6-BA ().5mg/l+NAA 0.5 mg/1;振荡培养，得到胞外培养液。
3、 按照权利要求2的方法，其特征在于所述的振荡培养按照以下条件 进行培养温度为25t:，转速为120r/min的摇床培养20天。
4、 按照权利要求1的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的烘干用60QC的 温度烘干。
5、 按照权利要求1的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的酸解是用1N的
全文摘要
本发明公开了一种双(5-甲酰基糠基)醚的培养及分离、纯化方法，属于植物组织培养领域。本发明方法以仙客来为原料，通过常规植物组织培养方法得到仙客来的胞外培养液，将胞外培养液通过酸解、过滤、萃取(或回流提取)、浓缩、析晶、重结晶等一系列方法，得到纯化的双(5-甲酰基糠基)醚。本发明方法所制备的双(5-甲酰基糠基)醚属仙客来液体培养液次生代谢产物经酸解改构的产物，其含量较高，从1.6升液体培养液中可分离得到130mg左右的双(5-甲酰基糠基)醚纯品，产率高且有一定的产业化前景，可为结核菌的防治等方面提供需求。
文档编号C12N5/04GK101148654SQ20071014625
公开日2008年3月26日 申请日期2007年8月30日 优先权日2007年8月30日
发明者曲复宁, 由翠荣, 龚雪琴 申请人:由翠荣;曲复宁