专利名称：：同型乳酸的嗜热芽孢杆菌的遗传修饰的制作方法同型乳酸的嗜热芽孢杆菌的遗传修饰本发明涉及用于兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的工业应用的遗传修饰。乳酸及其盐(称为乳酸盐)是市售可得的产品，其可用于各种领域，包括医药、生物可降解聚合物和食品加工。兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种是用于乳酸的工业制备的理想生物。它们能够在30-65lC的温度下生长，并在高于50X:的温度下允许厌氧工业发酵。当以工业规模进行发酵时，该高温度具有几个优点低感染风险并因此更高的对映异构体纯度，更快的反应等等。同型乳酸性质允许从经来源(包括六糖和五糖；参见WO04/063382)生产乳酸，而不形成多于15wt。/。的副产物，例如甲酸和乙酸。所述芽孢杆菌的兼性厌氧性质允许在厌氧条件下进行发酵，或者至少在低氧气分压下进行发酵，由于这允许相对便宜的设备和工艺，所以这对于工业规模来说是所需要的。此外，这些细菌的营养要求比乳酸细菌例如乳杆菌属(ZaWo6ac27/u"物种低，所述乳酸细菌也允许相对^f更宜的工业工艺。已知的兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌的一个缺点是，它们不或者几乎不产生R-礼酸。由于生物可降解乳酸聚合物的成功应用依赖于便宜的S-乳酸和便宜的R-乳酸两者的可用性，因此需要这两种对映异构体的有成本效益的生产。如今，已知的产R-乳酸的细菌是嗜热的(例如左旋乳酸芽孢杆菌(&c27/m/fle^/ac〃cus)或者具有苛求的营养要求(例如德氏乳杆菌(Zfl"o6sc//_tode/6r,h'/))，这使得R-乳酸的制备比S-乳酸的制备要贵得多。因此，本发明的一个目的是利用中度嗜热芽孢杆菌菌林，其是兼性厌氧的并且通过同型乳酸发酵来生产R-乳酸。本发明的另一个目的是利用用于产生经遗传改造的兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌的方法。芽孢杆菌属包括超过200个不同的物种(参见Sneath，P.H.A.,1986:Endospore-formingGram-positiverodsandcocci.Bergey，smanualofsystematicbacteriology.Vol2.Sneath,P.H.A.，Mair,N.S.，Sharpe，M.E.，Holt,J.G.(编辑)Williams&Wilkins，Baltimore).已知这些芽孢杆菌只有少部分是遗传上可了解的。例如，原生质体转化对于许多不同的芽孢杆菌属物种发挥作用，但仅证明感受态细胞的转化通常对于严格需氧的且嗜温的枯草芽孢杆菌(Ac///"s^/"/7")168的细胞的作用是令人满意的。工业菌抹常常对于遗传修饰更具有抗性，如从地衣芽孢杆菌(h'c力e"/尸or边")中所获知的。将这种兼性厌氧的中度嗜热芽孢杆菌属物种用于酶的工业生产。然而，因为其异型乳酸性质，其不能用于乳酸的生产(参见Bulthuis，B.A.，C.Rommens，G.M.Koningstein，A.H.Stouthamer，H.W.vanVerseveld，1991:Formationoffermentationproductsandextracellularproteaseduringanaerobicgrowthof//cAe//尸or/p/sinchemostatandbatch-culture，AntonievanLeeuwenhoek60:355-371)。通常,高频率的感受态转化操作不可用于工业菌林(参见Outtrup，H.和S.T.J0rgensen，2002:Theimportanceof"ac/细speciesintheproductionofindustrialenzymesinApplicationsandsystematicsof^gc/7/usandrelatives,R.Berkeley,M.Heyndrickx，N.Logan,和P.deVos(eds.)，pp.206-218，BlackwellPublishing,Maiden,USA)。可通过原生质体转化来修饰这样的菌抹，如US6，083，718中所公开的。至今，没有记述表明兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的遗传改造的方法。尽管已发表的一个报告要求保护通过原生质体融合来进行从枯草芽孢杆菌(A^/6〃7")至凝结芽孢杆菌(Sac"/u"呵z/7,)的质粒转移(参见Ball,A.S.和C.Edwards,1989:Propertiesofprotoplastsfromthethermophile"ac!7/"sandtheirsignificanceforgeneticstudies.LettAppl.Microbiol.9:141-144)，但其没有提供凝结芽孢杆菌确实具有该质粒的证据。所声称的仅仅基于观察到抗生素抗性菌落的生长，所述菌落能够非常好地成为自发抗生素抗性突变体。常常对于各种类型的抗生素，我们已观察到凝结芽孢杆菌的此类自发抗生素抗性突变体。在另一篇出版物中Transformationofspp.:^ExaminationofthetransformationofAac/'/^toprotoplastsbyplasmidsp腿lOandpHV33，CurrentMicrobiology,Vol13(1986)，pp191-195，描述了在各种芽孢杆菌中的原生质体转化。然而，在凝结芽孢杆菌中的转化被报道为不成功，电穿孔广泛用于细菌，但需要对生长培养基和电穿孔緩冲液进行物种特异性的(或者甚至菌林特异性的)优化。芽孢杆菌属物种的成功电穿孔经常需要质粒DNA的体内或体外甲基化以防止其在转化后的限制。W002/29030公开了对通过电穿孔将经体内甲基化的质粒引入嗜热芽孢杆菌菌抹TN的细胞中。所使用的质粒基于热敏感型质粒pUB110。然而，我们发现，当用于转化兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种时，该质粒不能产生经转化的细胞。我们现在已发现，通过遗传改造对兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种进行遗传修饰是可能的。因此，本发明第一次显示了通过转化来对中度嗜热的兼性厌氧且同型乳酸的芽孢杆菌属物种进行遗传改造。除了就R-乳酸生产来改造所述兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌外，还可以就工业化合物的生产来遗传改造所述芽孢杆菌，所述工业化合物包括除乳酸以外的其他有机酸、醇、酶、氨基酸和维生素。根据本发明，重要的是该中度嗜热芽孢杆菌属物种是同型乳酸的，因为这确保了新引入的功能性将会导致高产量生产，并有少量副产物。此外，使用同型乳酸的芽孢杆菌属物种使得能够只必须应用少量修饰以获得工业上可应用的微生物。将中度嗜热芽孢杆菌属物种定义为能够在30-65t:之间的温度生长的细菌。中度嗜热的兼性厌氧且同型乳酸的物种的实例是凝结芽孢杆菌和史氏芽孢杆菌(&C/〃M^7"力/2')。同型乳酸的芽孢杆菌可通过同型乳酸发酵而天然地生产S-乳酸。本领域技术人员可容易地确定哪种特定菌林可通过同型乳酸发酵来生产乳酸。本发明还包括衍生自中度嗜热的兼性厌氧的芽孢杆菌属物种的菌抹，其中该同型乳酸表型被修饰。优选地，选择具有在孢子形成方面具有缺陷的菌林和衍生物。由于关于中度嗜热的兼性厌氧且同型乳酸的芽孢杆菌没有可用的文献，发明人需要发现能够在这些芽孢杆菌中复制的质粒，需要优化用于将DNA引入这些细胞的方法，以及需要发现用于所定义的芽孢杆菌属物种类群的合适的选择标记，以能够通过转化来遗传改造这些芽孢杆菌。发明人决定使用电穿孔作为方法来发现何种质粒能在这些芽孢杆菌中复制。所测试的质粒为pIL253(参见Simon，D.和A.Chopin，1988:Constructionofavectorplasmidfamilyanditsuseformolecularcloningin""ej^ococc:^/ac〃s.Biochimie70:559-566)、pMV158(参见Burdett，V.，1980:IdentificationoftetracyclineresistantR-plasmidsiny"e;7fococcMaga/ac〃ae(groupB)，Antimicrob.AgentsChemother.18:753-766.)、pHP13(参见Haima,P.，S.Bron，G.Venema，1987:Theeffectofrestrictiononshotguncloningandplasmidstabilityin^gc"b励〃/i、Marburg.Mol.Gen.Genet.209:335-342.)、pUBllO(参见Keggins，K.M.，P.S.Lovett，E.J,Duvall，1978:MolecularcloningofgeneticallyactivefragmentsofSac/"usDNAin^ac/77^w6〃7/sandpropertiesofthevectorplasmidpUBllO,Proc.Natl.Acad.Sci.USA75:1423-1427)、pAMS100(参见Kiewiet，R.，J.Kok，J.F.M.L.Seegers，G.Venema，S.Bron，1993:ThemodeofreplicationisamajorfactorinsegregationalplasmidinstabilityinZa"ococc:/s/ac〃s.Appl,Environ.Microbiol.59:358-364)、pWCFS105(参见VanKranenburg，R.，N.Golic，R.Bongers，R.J.Leer,W.M.deVos，R.J.Siezen，M.Kleerebezem,2005:FunctionalanyalysisofthreeplasmidsfromZa"o6ac/7/^//a/7&r咖，Appl.Environ.Microbiol.71:1223-1230)、pNZ280(参见Platteeuw，C.，F.Michiels，H.Joos，J.Seurinck和W.M.deVos，1995:Characterizationandheterologousexpressionofthegeneandidentificationofiso-ISWelementsfromiWerococc^,aeca//^plasmidpJHl，Gene160:89-93.)、pNZ124(参见Platteeuw，C.，G,Simons和W.M.deVos.1994:Useofthe■gscAer/cA/aco//P-glucuronidasegeneasareportergeneforanalyzingpromotersinlacticacidbacteria,Appl.Environ.Microbiol.60:587-593)和pNW33n(参力口Zeigler，D.R.2001:ThegenusCeo6a"7/^:introductionandstraincatalog,第7版，第3巻.GeneticStockCenter,諷bgsc.org)。在各种试验之后，发现后三种质粒能够复制并获得转化体。一旦鉴定了能够在这些芽孢杆菌中复制的质粒，就可以方便地优化与转化方案相关的其他操作参数。另外，还就可行性测试了用于引入DNA的其他方法，例如天然转化或接合。使用抗生素抗性标记物的测试证明，至少可使用氯霉素抗性、四环素抗性和卡那霉素抗性。应当小心避免过低的浓度，因为这些会导致产生自发抗生素抗性菌落。引入克隆在pNZ124或pNW33n中的来自PIL253的红霉素抗性基因不能得到转化体。因此，在第一个方面中，本发明公开了用于通过遗传改造来对兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种进行遗传修饰的方法。该方法包括以下步骤将克隆在包含PSH71复制子或其同系物的热敏感型质粒系统中的DNA引入兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的细胞中；于对于质粒复制而言的许可温度下在选择培养基上培养所述细胞，以选择能够于所述许可温度下在所述选择培养基上生长的经转化的细胞；于对于质粒复制而言的非许可温度下在选择培养基上培养所述经转化的细胞，以选择能够于所述非许可温度下在所述选择培养基上生长的经转化的细胞。于所述许可温度下在选择培养基上培养所述细胞允许选择转化体，即才聂取了所述转化性DNA(transformingDNA)的细胞。优选地，于非许可温度下培养经转化的细胞之前分离经转化的菌落，以允许检查所述转化性DNA的完整性。然后于非许可温度下培养一个或少量独个菌落的细胞，以允许选择整合体。根据本发明，将目的DNA克隆入包含pSH71复制子(GenBank登录号A09338)或其同系物的热敏感型质粒系统中。pSH71复制子是提供热敏感复制功能性的复制子。热敏感复制功能性提供了包含该复制子的质粒在许可温度下的复制，以及所述质粒在非许可温度下的复制的缺乏。通过复制起点和由该复制子编码的复制蛋白质(RepA)提供了pSH71复制子的该热敏感复制功能性。在本发明的情况下，将"PSH71复制子或其同系物"定义为包含编码多肽的DNA序列的DNA，所述多肽具有热敏感复制功能性(RepA蛋白)并具有SEQIDNO:1的氨基酸序列或与SEQIDNO:1具有80%同一性，优选地90%同一性，更优选地95%、96%、97%、98%、99%同一性的氨基酸序列。pSH71复制子或其同系物进一步包括复制起点，在所述复制起点中上述RepA蛋白能够发挥作用。pSH71复制子的同系物的一个实例是pWVOl(GenBank登录号X56954)。pSH71复制子或其同系物可进一步包括调节蛋白(RepC)。对于本发明的目的，2个氨基酸序列之间的同一性的程度指在这2个序列之间相同的氨基酸的百分比。使用BLAST算法来确定同一性的程度，该算法描述在Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990)。用于实施BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)7>开获得。BLAST算法参数W、T和X决定了该算法的灵敏度和速度。BLAST程序使用ll的字长(W)、BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))、50的比对(B)、10的期望值(E)、M=5、N--4以及2条链的比较作为缺省设置。当想要获得转化性DNA的染色体整合时，具有条件复制子的整合质粒的可用性是希望的。可以在许可条件下引入这样的质粒，其后改变生长条件(例如通过变为非许可温度)，从而致使该质粒不复制并且允许就由同源或非同源重组造成的染色体整合事件进行选择。作为条件克隆栽体，可以使用热敏感型复制子例如在pNZ124中存在的pSH71，或者基本与其等同(同源)的质粒或保留了该质粒的热敏感特性的其衍生物。在兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种中，对于该复制子而言的许可温度优选地为37-50t:。非许可温度优选地大于50"C。许可和非许可温度可能不只依赖于复制子，而且还依赖于宿主芽孢杆菌属物种。后者在现有技术中是已知的现象，其由pG+宿主质粒所例示，对于所述pG+宿主质粒而言，37T在德氏乳杆菌中是许可温度而对于乳酸乳球菌("c^cocc^hc〃s)是非许可温度(参见US5919678)。也可以作为pNW33n的热敏感衍生物或能够在兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种中复制的其他质粒，来获得条件克隆载体。通过以下方法，将克隆在包含pSH71复制子或其同系物的热敏感型质粒系统中的目的DNA引入兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的细胞中A.原生质体转化或原生质体融合，B.电穿孔，C.基因枪转化，D.接合，或E.天然感受态细胞的转化。可以通过经过含有兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种和合适的转化性DNA的悬浮液进行高压放电来实现通过电穿孔进行的这些芽孢杆菌属物种的转化，所述转化性DNA包含所需的功能性和/或与该特定的芽孢杆菌的基因组序列同源的DNA序列。可以通过将兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种(群落)与含有具有所需功能性的自我转移或可移动的质粒的供体细胞(群落)接触，来实现通过接合进行的这些芽孢杆菌属物种的转化。自我转移质粒编码它们在细胞之间迁移所需要的所有功能，并且有时候它们也帮助染色体DNA和可移动质粒的转移。可移动质粒不编码转移所需要的所有蛋白质，并因而需要由供体基因组(染色体或质粒编码的)来提供这些功能。可移动质粒至少包含转移起点(or/r)区域。可与待修饰的中度嗜热芽孢杆菌共培养的任何供体细胞基本上适合用作供体细胞。合适的供体细胞的实例是下列物种的细胞芽孢杆菌属物种，包括嗜碱芽孢杆菌(Afl/irfl/0/;//7wi)、解淀粉芽孢杆菌(及a/zy^o"^;e尸ac/e/7i)、短芽孢杆菌广及6rer/s入蜡状芽孢杆菌(及cerews)、环状芽孢杆菌(及c/rcw/a/2sj、凝结芽孢杆菌(及coa^//a/7s)、杣烂芽孢杆菌(A/aW"s)、迟緩芽孢杆菌(及/e/7"s)、地衣芽孢杆菌(及//c力e/7/尸or边/s)、巨大芽孢杆菌(及"r/咖)、史氏芽孢杆菌(及^Z7"力//)、枯草芽孢杆菌(及w6〃/")、热噬淀粉芽孢杆菌(及Mei7Z70fl/Z/y/0^7rfl/7S)、苏云金芽孢杆菌(及^fti/r/z^/e/^/s)，嗜热月旨肪地芽抱軒菌(Ceo6flc/77i^"earc^/er銜p力"M)，大肠杆菌(五.co7/)，粪肠球菌(f/^erococcz;s尸a"a/")，乳杆菌属("cWflc"/us)物种，包括嗜酸乳杆菌(厶ac/^/力27i^)、嗜淀粉乳杆菌(厶腫^op力27i/s)、食淀粉乳杆菌(丄.a边y/oFori^)、干路乳軒菌(厶case/)、棒状乳軒菌(Z.cor//7/'/o_nz7/s)、巻曲乳軒菌(厶cr/s/7fl&s)、弯曲乳軒菌(Z.curFfl&s)、德氏乳軒菌(厶de76rueci7/)、加氏乳軒菌(Z.^^ser/)、瑞士乳軒菌(丄.力e/ref/cws)、约氏乳軒菌(厶yo力i^0/7//)、植物乳杆菌(丄.p7fli3"r咖)、路氏乳杆菌(厶reu&r/)、鼠李糖乳杆菌(厶r力a/zw7c^i/s)、清酒乳軒菌(厶saire/)、Z.sa//V/sce/7s/s，链球菌属(S"e/^,c，)物种，包括无乳链球菌(S.ag"ac〃fle)、变异链球菌/Z7"^;^)、口腔链球菌ora/")、肺炎链球菌(S./7/7e"膨/7/ae)、唾液链球菌(51.sa/2>ar/i/s)、表兄链球菌(S.so6r//7i/s)和嗜热链球菌^ei7Z7C^力27i^)。合适的自我迁移质粒包括pRK24、pLS20、pAM01，或者与其基本上相同的质粒或保留了质粒自我迁移能力的其衍生物。合适的可移动载体包括pAT18、pAT28、pJS28，或者与其基本上相同的质粒或保留了质粒移动能力的其衍生物。发明人进一步设法开发用于这些芽孢杆菌属物种的天然转化方案。这需要确定用于生长、饥饿和转化的正确培养基组成、用于形成和收获感受态细胞的正确时机以及正确的转化操作程序。尽管已知天然转化在芽孢杆菌属物种中不是广泛存在的，但发明人发现，兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌可被制成天然感受态。对于电穿孔和原生质体转化，转化性DNA的来源可以影响到转化的结果。待转化的DNA来源(从乳酸乳球菌MG1363、大肠杆菌DH5a、大肠杆菌JM109或大肠杆菌JM110中分离的)不影响在所述芽孢杆菌属物种中的转化效率，这说明DM的甲基化状态不是重要的。这与其他芽孢杆菌属物种相反(参见例如WO02/29030)。在本发明的优选实施方案中，用于引入至芽孢杆菌中的转化性DNA分离自乳酸乳球菌。更优选地，还在乳酸乳球菌中进行用于构建该转化性DNA的克隆步骤。这是因为在大肠杆菌中的克隆经常似乎导致所克隆的DNA中的缺失和/或重排。通过本发明，提供了用于优选地通过天然感受态的诱导进行转化、转化电感受(electrocompetent)细胞以及接合的方法，显示了热敏感型质粒的用途，并显示了这些要素用于产生经遗传改造的兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的应用，例如用于生产R-乳酸。转化性DNA包含pSH71复制子或其同系物，以及能够为芽孢杆菌细胞提供所需功能性的目的DNA。染色体修饰是兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的优选修饰，因为染色体修饰可确保所述功能性在后代细胞中稳定散布。可以釆用非同源重组以及同源重组来进行在染色体中引入所需要的功能性。同源重组是优选的，因为其开启了引入、去除或者同时引入和去除功能性的机会。在本发明的情况下，功能性可以是编码待由该细胞产生的所需多肽的基因和/或编码参与由该细胞进行的初级或次生代谢物生产的多肽的基因和/或使得能够从该细胞的染色体中删除DNA序列的DNA序列。与在细胞中具有功能的调节序列(例如启动子序列)一起提供编码多肽的基因。所述调节序列可以是与编码序列天然相连的序列，或者与其异源的序列。编码多肽的基因可以与在所选择的芽孢杆菌属物种中具有功能的任何调节或启动子序列融合。合适的启动子序列包括从所选择的芽孢杆菌属物种中可获得的启动子、来源于不同天然芽孢杆菌启动子的杂合启动子和人工启动子。优选的启动子是待通过同源重组进行失活的芽孢杆菌基因的启动子。特别优选的是来自凝结芽孢杆菌的/WZ启动子或在US5171673中公开的淀粉酶基因的启动子。为使得能够从大量未转化的细胞中选择经转化的芽孢杆菌细胞，将选择标记作为转化性DNA的一部分。所述选择标记可存在于与目的功能性相同的DNA片断或质粒上，或者存在于分开的DM片断或质粒上。优选的选择标记是来自pMH3的编码氯霉素乙酰转移酶的cW基因。可以引入的所需功能性是如下文描迷的R-乳酸生产，以及提供可从丙酮酸代谢而来的化合物的生产的其他功能性。这些化合物的实例是丙酮酸、乙酸乳酸、双乙酰、3-羟基丁酮、2，3-丁二醇、1，2-丙二醇、醋酸、甲酸、乙醛、乙醇、L-丙氨酸、草酰乙酸、S-苹果酸、琥珀酸、富马酸、2-酮戊二酸、草酰琥珀酸、异柠檬酸、柠檬酸、乙醛酸。当想要进行同源重组时，转化性DM进一步包含与待改造的特定芽孢杆菌的基因组耙序列同源的DM序列。本领域技术人员应当理解，对于获得同源重组而言100%的同一性并不是必需的。大约90%的同一性百分比也是足够的。一般而言，待通过同源重组插入到染色体中的目的DNA序列的侧翼为具有足够长度的同源序列以使得能够同源重组。该长度是至少大约200bp，例如大约200-大约1500bp，优选大约200-大约1000bp。本发明旨在借助于对兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种进行遗传改造来进行的修饰，其中优选地通过同源重组引入所需的功能性。本发明还旨在借助于对兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种进行遗传改造来进行的修饰，其中通过同源重组去除不需要的功能性。本发明进一步旨在借助于对兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种进行遗传改造来进行的修饰，其中通过同源重组向染色体中引入所需的功能性并同时去除不需要的功能性。同型k酸的亲本菌林的衍生物;通过所迷借助于;传改造的修饰-获得，这形成了本发明的进一步的方面。借助于遗传改造的修饰包括对于细菌染色体引入功能性、去除功能性或者同时引入功能性和去除功能性。在优选的实施方案中，通过同源重组来进行借助于遗传改造的修饰。在一个优选的实施方案中，兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的经遗传改造的衍生物是这样的菌抹，在所述菌林中阻断了丙酮酸转化为乳酸并且积累丙酮酸，或者在所述菌林中应用另外的修饰以将丙酮酸重新定向到其他产物的生产，所述其他产物包括乙酸乳酸、双乙酰、3-羟基丁酮、2，3-丁二醇、1,2-丙二醇、醋酸、甲酸、乙醛、乙醇、L-丙氨酸、草酰乙酸、S-苹果酸、琥珀酸、富马酸、2-酮戊二酸、草酰琥珀酸、异柠檬酸、柠檬酸、乙醛酸。在另一个优选的实施方案中，兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的经遗传改造的衍生物是这样的菌林，在所述菌抹中通过同源重组去除编码S-乳酸脱氢酶活性的7&Z基因。在另一个优选的实施方案中，兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的经遗传改造的衍生物是这样的菌林，在所述菌林中通过同源重组将编码s-乳酸脱氢酶活性的A/力i:基因替换为编码具有r-乳酸脱氢酶活性的NADH依赖性2-羟基酸脱氢酶的基因。在这些实施方案中，用于同源重组的构建体包含不编码具有功能的S-乳酸脱氢酶的缺陷型A/力Z基因。可以由其中删除了部分或全部W/丄编码序列的构建体来提供缺陷型W力Z基因。可通过将部分或全部/W丄基因替换为另一种基因例如编码选择标记或目的基因的基因来制作缺陷型/WZ基因。优选地，将编码S-乳酸脱氢酶活性的A/力力基因替换为构建体，所述构建体包含编码具有R-乳酸脱氢酶活性的NADH依赖性2-羟基酸脱氢酶(包括EC号为EC1.1.1.28的酶)的基因。合适的编码R-乳酸脱氢酶活性的基因是能够补偿大肠杆菌A/W一突变体例如由Bernard等人(参见Bernard,N.，T.Ferrain，D，Garmyn，P.Hols和J.Delcour，1991:CloningoftheD-lactatedehydrogenasegenefrom^fl"o^c///ustfe/6rt/eci://subsp.6"/^sr/cusbycomplementationin■gscAer/cA/aco7厶FEBSLett.290:61-64)描述的大肠杆菌FMJ114的那些基因。合适的编码R-乳酸脱氢酶活性的基因例如是来自德氏乳杆菌保加利亚亚种(Za"o6(3"7/w"e/6ri/ech7subsp.的/f/力J基因(也可参见Bernard等人)，或来自相同物种的力W"基因(Bernard,N.，K.Johnsen，T.Ferain，D.Garmyn，P.Hols,J.J.Holbrook和J.Delcour.1994.NAD+-dependentD-2-hydroxyisocaproatedehydrogenaseof""o6ac///^de/6rueci7/subsp.^/gar/c〃s.Eur.J.Biochem.224:439-446)。由基因编码的R-乳酸脱氩酶的氨基酸序列描述在SEQIDN0:2中。看起来，由能够补偿上述大肠杆菌突变体的基因所编码的多肽在氨基酸序列方面基本上不同。与SEQIDN0:2的氨基酸序列的低至30%的同一性百分比是可行的。A//^和力W"基因似乎编码具有大约50%同一性程度的蛋白质。合适的编码R-乳酸脱氬酶活性的基因是编码SEQIDNO:2的氨基酸序列的那些基因，或者同源基因，所述同源基因编码与SEQIDNO:2的氨基酸序列显示出至少30%，更优选地至少40%,更加优选地至少50%、60%、70%、80%、90%的同一性程度的氨基酸序列，并且能够补偿大肠杆菌Af/^-突变体例如大肠杆菌FMJ144。此类同源序列可包括多态性，所述多态性可以存在于来自不同群体的细胞中或者由于天然的等位基因或菌林内变异而存在于一个群体中。进一步地，同系物可以来自除该指定DNA或氨基酸序列所源自的物种以外的其他芽孢杆菌属物种，或者可以人工设计和合成。除了引入所需的功能性之外，遗传改造还可用于优化工业发酵，例如使得能够发酵便宜的底物例如衍生自木质素纤维素的糖(包括木糖和阿拉伯糖)，和/或去除不需要的功能性。在进一步的方面，本发明提供了用于生产目的化合物的方法，包括在有益于产生所述化合物的条件下培养前述方面的经遗传改造的菌附图描述图l显示了分离自3种大肠杆菌分离林的p冊33N的限制性分析，所述大肠杆菌分离林用分离自3种经转化的凝结芽孢杆菌DSMl分离林的质粒材料转化。泳道1、4和7是用fcoRI消化的pNW33N;4217-bp片段。泳道2、5和8是用fcoRI-&"I消化的p冊33N;333-bp和3884-bp片段。泳道3和6是KbDM梯(Stratagene)250bp、500bp、750bp、1.0kb、1.5kb、2.0kb、3.0kb、4.0kb、5.0kb、6.0kb、7.0kb、8.0kb、9.0kb、10.0kb和12.0kb。图2显示了pJS28的质粒图镨。以箭头表示复制基因(repB)和氯霉素抗性基因(cat)。将IncP质粒RK2转移起点(oriT)和大肠杆菌复制起点(ori)显示为加框的区域。图3显示了基于在US5171673中公开的序列的合成的凝结芽孢杆菌ATCC23498淀粉酶启动子区的核苷酸序列。对(AGATCT)、(GGATCC)和^ccI(CCATGG)克隆位点加下划线。A^I位点允许与淀粉酶启动子的翻译融合。以黑体显示淀粉酶基因的ATG起始密码子。图4显示了pJS25的质粒图语。以箭头表示复制基因(reW和re;C)、没有Ycol位点的氯霉素抗性基因(cm4)。将凝结芽孢杆菌启动子区(P)显示为加框的区域。图5显示了pJS26的质粒图傳。以箭头表示复制基因(repA和repC)、没有vVcoI位点的氯霉素抗性基因(cm*)和LMG6901WW基因(ldhA6901)。加框显示凝结芽孢杆菌启动子区(P)。图6显示了pJS27的质粒图傳。以箭头表示复制基因(repB)、氯霉素抗性基因(cat)和保加利亚乳杆菌(Zac&6flc/〃i^6"^sr/c"s)LMG6901^/M基因(ldhA6901)。将凝结芽孢杆菌启动子区(P)和大肠杆菌复制起点(ori)显示为加框的区域。图7显示了pRKl的质粒图语。以箭头表示复制基因(repA和repC)、氯霉素抗性基因(cat)和保加利亚乳杆菌A/M基因(ldhA)。将凝结芽孢杆菌启动子区(PamyATTC)以及凝结芽孢杆菌Af力Z上游和下游区域显示为加框的区域。通过下述非限制性的实施例来进一步示例性地描述本发明。实施例材料和方法从NIZO食品研究所获得质粒pNZ124(Platteeuw，C.，G.Simons和￥.M.deVos.1994.Useofthei^cAer/c力/aco//0-glucuronidasegeneasareportergeneforanalyzingpromotersinlacticacidbacteria.Appl.Environ.Microbiol.60:587-593)。其基于在EP0228726Bl中公开的克隆栽体pNZ12。从^2"7/mGeneticStockCenter,OhioStateUniversity,Columbus,Ohio,USA获得质粒pNW33N(Zeigler，D.R.2001:Thegenus^o6gg///^y;introductionandstraincatalog.第7版，第3巻.a2c/7/iAjGeneticStockCenter,www.bgsc.org)，并在大肠杆菌DH5ot(InvitrogenLifeTechnologies)中进行繁殖。pNW33N的核苷酸序列可以以GenBank登录号AY237122获得。从巴斯德研究所(InstitutePasteur)获得包含IncP质粒RK2转移起点(WD的质粒pAT厶S28(Namy,0.,M.Mock,A.Fouet，1999:Co—existenceofandc/pCintheBaciliceae.FEMSMicrobiol.Lett.173:297-302)。从DSMZ，Braunschweig,Germany获得凝结芽孢杆菌DSM1。乳酸孔球菌乳月旨亚种(ZflctococcM/flc"ssubsp.cre/z/or/s)MG1363由Gasson所描述(M.J.Gasson.1983:Plasmidcomplementsof^re/^ococci;s/s"/sNCD0712andotherlacticstreptococciafterprotoplast—inducedcuring.J.Bacteriol.154:l-9)。从BCCM/LMG细菌保藏中心，Gent,Belgium获得德氏乳杆菌保加利亚亚种LMG6901。含有pRK24的大肠杆菌HB101由Trieu-Cuot等人描述(Trieu-Cuot，P.，C.Carlier，P.Martin和P.Courvalin，1987:PlasmidtransferbyconjugationfromAscAer/cA/aco//'toGram-positivebacteria.FEMSMicrobiol.Lett.48:289-294)。凝结芽孢杆菌常规地在需氧条件下于45X:在含有10g/L酵母提取物、2g/L磷酸二铵、3.5g/L硫酸二铵、10g/LBis-Tris緩冲剂(双[2-羟曱基]亚氨基三[幾甲基]-甲烷)、3mg/LCaCl2、5mg/LMgCl2的BC-液体培养基(用于凝结芽孢杆菌的BC)中生长；如果合适，向培养基中补充50g/L蔗糖；将pH调节到6.6-6.7并且在使用前对培养基高压灭菌(20分钟，121"C)。对于平板，向培养基中补充10g/L脱乙酰吉兰糖胶(Gelrite)和lg/LMgCl2。分开地添加过滤灭菌的痕量元素。终浓度为0.2mg/LCoCl2.6H20、0.01mg/LCuCl2.2H20、0.3mg/LH3B03、0.03mg/LNa2MoO,2H20、0.02mg/LNiSO,6H20、0.03mg/LMnCl2.4H20、0.05mg/LZnCl2。如果合适，以7mg/L向培养基中补充过滤灭菌的氯霉素。感受态培养基(C-液体培养基)包含O.05g/L酵母提取物、2g/L磷酸二铵、3.5g/L硫酸二铵、10g/L葡萄糖、10mg/LCaCl2、0.5g/LKC1、25mg/LMgCl2;将pH调节到6.8，并且在使用前对培养基高压灭菌(20分钟，。分开地添加过滤灭菌的痕量元素和维生素。终浓度为2.4mg/LCoCl2、3.6迈g/LFeCl3、3mg/LMnCl2、1.2mg/LZnCl2、0.024mg/L生物素、0.012mg/L石充胺素、20mg/L甲疏氨酸。转化培养基(T-液体培养基)是用0.025g/L酵母提取物代替0.05g/L酵母提取物的C-液体培养基。大肠杆菌常规地在需氧条件下于37-C在LB液体培养基(MolecularCloning,alaboratorymanual.第3版，J.Sambrook和D.W.Russell.2001.ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)中进行培养。如果合适，分别以5mg/L和10Qmg/L的浓度使用氯霉素和/或氨爷青霉素。保加利亚乳杆菌常规地在厌氧条件下于37C在MRS液体培养基@(BDBiosciences)中进行培养。乳酸乳球菌常规地在厌氧条件下于30t:在补充有0.5%葡萄糖的M17液体培养基⑧(BDBiosciences)中进行培养。如果合适，以5mg/L的浓度使用氯霉素。顺橫賴i如Sambrook和Russell所描迷的(J.Sambrook和D.W.Russell.2001:MolecularCloning,alaboratorymanual.第3版.ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)来实施标准腿操作技术。分别在乳酸乳球菌和大肠杆菌中进行pNZ124和pNW33N衍生物的构建。根据制造商的说明书，使用Jetstar2.0PlasmidMaxiprepKit(Genomed)从100mL培养物中进行大规模的大肠杆菌质粒DM分离。根据制造商的说明书，使用NucleospinPlasmidQuickPure(Macherey-Nagel)试剂盒从1mL培养物中进行小规模的大肠杆菌质粒DNA分离。使用在氯化铯-溴化乙锭梯度中的平衡离心来进行大规模的凝结芽孢杆菌质粒DNA分离。通过离心收获2个300raL的于45C在需氧条件(170rpm)下生长的过夜培养物。汇集细胞粒状沉淀并重悬在7mL含有2mg/mL溶菌酶、30mMTris/HCl(pH8.0)、3mMMgCh和25%蔗糖的緩冲液中，并且在水上温育15分钟。通过添加16mL含有0.2MNaOH和1%SDS的溶液来裂解细胞。5分钟后，通过添加12mL的3MKAc并混合来中和该样品在水上的温育。通过离心去除沉淀。通过添加20mL异丙醇来沉淀上清液中的DNA。通过离心来使所述DNA形成粒状沉淀、干燥并溶解在含有1.0g/fflLCsCl和0.4mg/mL溴化乙锭的TE緩沖液中。通过使用垂直转子(Stepsaver65V13;Sorvall)以45000rpm进行氯化铯密度梯度离心16小时，来分开染色体和质粒DNA。收集质粒DNA，并如在別处的描述来去除溴化乙锭(MolecularCloning,alaboratorymanual.第3版.J.Sambrook和D.￥.Russell.2001.ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)。根据用于革兰氏阳性细菌的小量制备方案(Rapidmini-prepisolationofhighqualityplasmidDNAfromLg"ococc^yandi^a"o6ac///^spp.D.J.0'Sul1ivan和T.R.Klaenhammer.1993.Appl.Environ.Microbiol.59:2730-2733)从10ml培养物中进行小规模的乳酸乳球菌和凝结芽孢杆菌质粒DNA分离。如Sambrook和Russell所描述的(MolecularCloning,alaboratorymanual.第3版.J.Sa迈brook和D.W.Russell.2001.ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)，使用氯化辨来制备大肠杆菌感受态细胞，并通过热休克进行转化。如Holo和Nes所描述的(High-freguencytransformationbyelectroporationof/ac〃ssubsp.cre/por/sgrownwithglycineinosmoticallystabilizedmedia.1989.Holo，H.和I.F.Nes.Appl.Environ.Microbiol.55:3119-3123)，通过电穿孔来转化乳酸乳球菌。根据制造商的说明书，使用高保真Pwo聚合酶(Roche)来进行用于克隆目的的PCR反应。菌落-PCR分析用于证明p鼎33N在氯霉素抗性菌落中的存在。设计用于鉴定PNW33N复制基因repS的PCR引物，其序列为5'-TCGCCTTCTTCTGTGTCATC-3'和5'-CTGGAGGAGAGCAATGAAAC-3'。用牙签挑取菌落，并将少量的细胞材料转移到0.5mLPCR反应管中。通过在微波炉中于1000W温育l分钟来破裂细胞。如制造商所推荐的来制备具有rTaq聚合酶(AmershamBiosciences)和0.5pg每种引物的50juLPCR反应混合物，并添加到具有破裂的细胞的反应管中。在RoboCycler(Stratagene)中进行PCR反应。于941C温育4分钟，随后进行25个循环的30秒变性、58X:l分钟引物退火和72t:1分钟延长。在最后一个循环后，于72t:将反应混合物另外再温育5分钟。电感受细胞的制备需要确定正确的培养条件、收获的时机以及洗涤和电穿孔緩冲液的组成，尽管凝结芽孢杆菌DSM1能够在LB液体培养基上生长，但开发的BC液体培养基提高了电穿孔效率。添加甘氨酸以削弱细胞壁，并对浓度进行优化。甘氨酸的浓度为0.5-2.0%,并且优选地为1.0-1.5%。为了最佳结果，在对数中期初期收获细胞。电穿孔緩冲液的pH为4.3-6.0，并且优选地为4.3-5.0。还需要确定最优的电穿孔设置(电压、电阻、电容)。电压优选地为1.0-2.5kV，并且更优选地为1.25-2.0kV。电阻优选地为100-800O，并且更优选地为200-600O。在涂布在选择培养基上之前的恢复是重要的，并且至少是2小时，优选地是3小时。如下制备凝结芽孢杆菌的电感受细胞。将过夜培养物用于接种(5%体积/体积)50ml补充有1%甘氨酸的培养基(产生大约0.13-0.14的在600nm处的浊度)。在45t:需氧温育2，5小时后，通过离心收获细胞。分別用50niL和25niL冰冷的电穿孔緩沖液(5niMKH2P04、0.4M山梨醇、10%甘油、4mMMgCl2，并调整到pH4.5)洗涤细胞粒状沉淀2次，并重重悬于1mL冰冷的电穿孔緩冲液中。为了电穿孔，将100n1细胞悬浮液与1jug质粒DNA混合并转移到在冰上预冷的0.2cm电穿孑l^池(electroporationcuvet)(Bio—Rad)中。4吏用GenePulser和PulseController设备(Bio-Rad)于200Q和254吏该样品经历1.6kV脉冲。电穿孔后立即加入1mL培养基，并且在Thermomixer(Eppendorf)中于45t:在900rpm下温育3小时，随后将它们涂布在补充有氯霉素的平板上。将这些平板在需氧条件下于45'C温育1-2天。接合将滤膜交配法(filtermating)用于重组质粒从大肠杆菌至凝结芽孢杆菌的接合转移。汇集供体(2mL)和接受者(2mL)的对数生长期细胞，并使用注射器收获在处于塑料滤膜固定器(Schleiger&Schuell)中的经灭菌的0.45醋酸纤维素滤膜(Schleiger&Schuell)上。用lOmL的BC-液体培养基洗涤细胞，并通过强迫空气经过滤膜来干燥滤膜。将滤膜置于无抗生素的BC-平板的表面上，并于451C温育过夜。在交配后，将细胞从滤膜上重悬浮于BC-液体培养基中，并将稀释系列涂布在含有7mg/L氯霉素的BC-平板上，并于55。C需氧温育1-2天。雜为、浙在指数生长期培养物中测定使用凝结芽孢杆菌启动子的在凝结芽孢杆菌中酶的过量产生。通过离心收获细胞。使用FastPrepFP120仪器(Qbiogene)以2轮(每轮于速度4进行30秒)来制备无细胞提取物。在每轮之间，将细胞在冰上冷却l分钟。使用牛血清白蛋白作为标准，通过Bradford的方法(Bio-Rad)来测定蛋白质含量。如Sambrook和Russell所描述的(MolecularCloning,alaboratorymanual.第3版,J.Sambrook和D.W.Russell.2001.ColdSpringHarborLaboratoryPress,NewYork)，使用ProteanII电泳系统(Bio-Rad)来进行SDS-PAGE(12.5%)。在340nm处通过分光光度法测定R-乳酸脱氢酶比活性，并且使用1ml含有0.3M甘氨酰甘氨酸緩冲液pH10、0.25%(v/v)TritonX-IOO、5mMNAD和1%R-乳酸的测定法混合物于50C进行。通过添加40或50jal无细胞提取物来起始反应。将比活性表示为AA.分钟、mg—，其中AA是对于1cm路径长度和mg蛋白质量而言在340nm处的吸光度的增加。发^在生物反应器(7LApplikon)中，用没有Bis-Tris緩沖剂并补充有30g/L葡萄糖的4LBC液体培养基来进行分批发酵。将从甘油储液接种的并在50"C下生长的过夜需氧培养物(40mL)转移到360mL新鲜BC液体培养基中，并再温育4-5小时。该400mL用于接种生物反应器。通过自动添加20%(w/v)的石灰溶液来维持pH。在54X:、pH6.5和250-300rpm的搅动速度下进行发酵。利用水浴(Lauda)来控制温度，同时通过ADI1020Bio-Processor(Applikon)来读取/控制pH。通过在线数据获取(ApplikonFMV5.0)来处理所有的数据(pH和碱消耗)。在接种前和发酵结束时抽取样品以用于测量R-和S-乳酸以及可能的副产物。离心样品，并使用MillexGP0.22jamfilter(Millipore)通过过滤来去除残留的碎片。将滤液保存在-21"C直至进一步的分析。使用衍生化和GLC来测量有机酸(乳酸、乙酸、甲酸、琥珀酸)。将R-和S-乳酸甲基化成乳酸曱酯，并通过在手性柱上的顶空分析来进行测量。潜果实施例1.使用天然感受态细胞，用质粒p冊33N转化凝结芽孢杆菌1)凝结芽孢杆菌DSM1的感受态细胞的制备在3个独立的实验中使用如下操作程序。在需氧条件下于45匸在5mlBC-液体培养基中过夜培养凝结芽孢杆菌DSM1。该培养物用于接种25ml预热的C-液体培养基，导致得到0.15的在600nm处的浊度。于45。C需氧温育该新鲜培养物直至在600nm处的浊度达到0.9-1.2(表l)。2)用pNW33N转化凝结芽孢杆菌DSM1使所述感受态细胞的0.5mL部分形成粒状沉淀，并将此粒状沉淀重悬于0.1mL的T-液体培养基中，并与5iag的p冊33N质粒DNA混合。在Thermomixer(Eppendorf)中以，rpm于45C温育1.5小时后，添加0.3mL预热的BC液体培养基，并继续温育2小时，其后将细胞涂布在补充有7mg/L氯霉素的BC平板上。将平板在45r下需氧温育。温育3天后出现菌落(表l)。表l.凝结芽孢杆菌DSM1的天然转化<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>3)从凝结芽孢杆菌DSM1中分离质粒将菌落划线到补充有7mg/L氯霉素的新鲜BC平板上，以用于在45r下过夜温育。使用菌落PCR来检测来自质粒pNW33N的rep5基因的存在。所有的PCR反应产生预期大小的产物。将每个实验中的一个菌落转移到BC-液体培养基中以用于0/N温育以及小量制备质粒的分离。尽管琼脂糖凝胶电泳不能显现任何质粒DNA，但用此小量制备DNA转化大肠杆菌DH5oc导致产生可从中回收p鼎33N的转化体。用AcoRI-57i/1消化质粒DNA以确证pNW33N的完整性。限制性模式如预期的一样(图1)，这证明质粒pNW33N被转化到凝结芽孢杆菌DSM1中。实施例2.使用电穿孔，用质粒pNW33N转化凝结芽孢杆菌通过电穿孔用1|ig质粒p鼎33N常规地转化凝结芽孢杆菌DSM1。通常，在45。C下温育1天后，在含有氯霉素的平板上出现超过20个的菌落。在一个实验中，在2天的温育后将15个菌落转移到新鲜的含有氯霉素的平板上。在45X:下温育24小时后，使用re/^"特异性引物通过菌落-PCR分析来确证转化。对于所有测试的转化体，获得预期大小的PCR产物，这证明存在p冊33N的repS基因。凝结芽孢杆菌DSM1用作阴性对照并且未得到PCR产物。从氯化铯梯度中分离单个转化体的质粒DNA。用fcoRI以及用fcoRI-5YwI消化质粒DNA以确证p鼎33N的完整性。限制性模式如预期的一样(333-bp和3884-bp片段)，这证明质粒p冊33N被转化到凝结芽孢杆菌DSM1中。实施例3.使用接合，用质粒pNW33N转化凝结芽孢杆菌1)含有转移起点的pNW33N-衍生物的构建将IncP质粒RK2的转移起点(or/了)克隆到pNW33N中。这允许通过共存于大肠杆菌供体中的任何可自我转移的IncP质粒来进行的有效共移动(comobilization)(Plasmidtransferbyconjugationfromi^c力er/cA/aco//toGram—positivebacteria.Trieu-Cuot,P.，Carlier，C.，Martin,P.和Courvalin,P.1987.FEMSMicrobiol.Lett.48:289-294)。将RK2oW7区域作为来自pAT厶S28的平端0.5-kb片段克隆到用消化的pNW33N中。将所得到的质粒pJS28(图2)转化到具有pRK24的大肠杆菌HB101中。该菌抹在与凝结芽孢杆菌DSM1的平板交配法(platematings)中用作供体。2)pJS28从大肠杆菌至凝结芽孢杆菌的接合转移将于37X:在含有氨苄青霉素和氯霉素的LB中需氧生长的具有pJS28和pRK24的大肠杆菌过夜培养物以1/50转移到含有抗生素的新鲜LB液体培养基中，并培养到在600nm处的浊度为0.56。将于45'C在BC液体培养基中需氧生长的凝结芽孢杆菌DSM1过夜培养物以1/50转移到新鲜BC液体培养基中，并培养到在600nm处的浊度为0.52。将等体积(2mL)的大肠杆菌和凝结芽孢杆菌收获到0.45jim滤膜上。将包含细胞的滤膜转移到没有抗生素的BC平板上并于45t:温育过夜。从滤膜上去除细胞，并且将稀释系列涂布在BC平板上，和于55匸需氧温育。1-2天后出现菌落。通过质粒DNA分离来确证pJS28的存在，并通过用Ycol消化得到预期的消化模式(1444-bp和3299-bp片段)来确证完整性。接合效率为大约9，310—7接受者。实施例4.衍生自凝结芽孢杆菌的表达系统的构建1)凝结芽孢杆菌表达系统的构建作为合成的DM片段(图3)来产生具有启动子活性的凝结芽孢杆菌ATCC23498核苷酸序列片段(公开在US5171673中)，并将其作为勘7II-^/rfn片段克隆到用相同酶消化的pMH3中。所得到的克隆载体pJS25(图3)允许通过使用与起始密码子重叠的位点而与该启动子的翻译融合。为了使得能够使用该W"I位点，通过使用大引物(megaprimer)从cat基因中去除位点而从质粒pNZlW构建了第一质粒pMH3。序列为5'-CTATTATTCCGTGGACTTC-3'和5'-CAGCTGAGATCTTGGAG-3'的引物用于产生大引物，其与序列为5'-GACGAAAGTCGACGGCAATAGTTAC-3'的引物组合用于第二PCR反应。所得到的PCR产物包括完整的c^基因，并用5^11-消化以替代pNZ124c〃基因，从而产生质粒pMH3。pJS25(图4)可用在各种嗜温的革兰氏阳性生物，包括枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌和乳明串珠菌(Zeuco/7。Woc/ac〃s)，以及革兰氏阴性生物大肠杆菌中(Useofthefsg力er/c力2'flco7/P—glucuronidase(^/^)geneasareportergeneforanalyzingpromotersinlacticacidbacteria.C.Platteeuw,G.Simons和W.M.deVos.1994.Appl.Environ.Microbiol.60:587-593)。2)AfW过表达系统的构建使用序列为5'-GACAATTCATGACTAAAATTTTTGC-3'和5'-GGATTTCTCTAGACTGCAGTTAGCCAACCTTAA-3'的引物，通过PCR产生编码R-乳酸脱氢酶并由Bernard等人公开的(CloningoftheD-lactatedehydrogenasegenefromde/6rf/ech7subsp.6u/^^r/ct/sbycomplementationinfsc力er/c力/aco//.1991.Bernard,N.，T.Ferrain，D.Garmyn，P.Hols和J.Delcour.FEBSLett.290:61-64)保加利亚乳杆菌LMG6901/^j基因。将PCR产物作为平端-J&I片段克隆到用Bfll-5izwl消化的pUC18中，并通过核苷酸序列分析来确证其完整性。随后，将W/L4基因作为/cal-J&I片段克隆到用^cfI-J&I消化的pJS25中。所得到的表达载体pJS26(图5)具有与凝结芽孢杆菌启动子在翻译上融合的保加利亚乳杆菌的A/W基因。随后，将包含凝结芽孢杆菌启动子和德氏乳杆菌基因的完整片段作为尸wi-勘/n片段(通过用的部分消化)转移到用^n-^iBHI消化的嗜热克隆栽体pNW33N中，从而产生质粒pJS27(图6)。3)R-乳酸脱氩酶的过量产生通过电穿孔将质粒pJS27转化到凝结芽孢杆菌DSM1中。将R-乳酸脱氢酶比活性测定为在50C下每mg蛋白质每分钟在340nni处的吸光度的降低。具有pNW33N的凝结芽孢杆菌DSM1的比活性为0.45AA分钟^mg蛋白质—1，和具有pJS27的凝结芽孢杆菌DSM1的比活性为2.15AA分钟—1mg蛋白质—'，这证明在包含德氏乳杆菌LMG6901/d/^基因的经修饰的菌株中R-乳酸脱氢酶的过量产生导致4.8倍的活性升高。实施例5.用于R-乳酸生产的凝结芽孢杆菌DSM1的遗传修饰具有pJS27(实施例4)的凝结芽孢杆菌DSM1在模拟工业条件的分批培养中进行生长。具有pNW33N的凝结芽孢杆菌DSM1和没有质粒的凝结芽孢杆菌DSM1用作参照菌林。在发酵后，测定有机酸的浓度和乳酸的光学纯度(表2)。由凝结芽孢杆菌DSMl和具有p冊33N的凝结芽孢杆菌DSM1产生的乳酸以S-形式是对映纯的(enantiopure)，而由具有pJS27的凝结芽孢杆菌DSM1产生的乳酸的相当部分是R-形式。没有检测到副产物形成方面的差异。2-羟基丁酸、乙酸、丁酸、甲酸、丙酮酸的浓度低于检测极限(对于丙酮酸〈0.02%;对于其他<0.01%)。琥珀酸的浓度低于0.1%(v/v)。这些结果证明，可通过引入R-乳酸脱氲酶基因来实现通过凝结芽孢杆菌的R-乳酸生产。只产生R-乳酸的凝结芽孢杆菌菌林的构建需要通过随机或定点诱变来破坏负责S-乳酸脱氢酶活性的基因。_表2.从5Qg/L蔗糖的有机酸生产(重复发酵)_葡萄糖乳酸S-乳酸的手性纯度R-乳酸的手性纯度_(g/L)(g/L)(S/R+S)*100%(R/S+R)*100%凝结芽孢杆菌DSM1<0.125/2899.8/99.70.2/0.3凝结芽孢杆菌03"1+<0.125/2299.8/99.70.2/0.3p鹏3N凝结芽孢杆菌DSM1+<0.126/2784.3/83.115.7/16.9pJS27实施例6.在用于对映纯的R-乳酸生产的凝结芽孢杆菌DSM1中的基因替换1)整合质粒的构建通过将编码主要S-乳酸脱氢酶活性的凝结芽孢杆菌/WZ基因替换为编码R-乳酸脱氢酶的保加利亚乳杆菌A/W基因，来构建产R-乳酸的经修饰的凝结芽孢杆菌菌林。使用条件克隆栽体(例如在45C下具有功能而在55匸下不具有功能的热敏感型复制子)，在2步操作过程中通过同源重组来完成该替换。我们使用在pNZ124或pMH3中存在的pSH71复制子，其被发现在兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种中具有这样的热敏感性质。整合载体pRKl(图7)包含pNZ124复制子，2个在凝结芽孢杆菌DSM1染色体中位于/必丄侧翼并且现在位于与保加利亚乳杆菌/^^基因融合的凝结芽孢杆菌ATCC23498a町启动子侧翼的l-kb区域，以及编码氯霉素抗性的c"基因。通过下述盒的连接来构建该整合载体(i)1.8-kb^/I-Z6al片段，其具有制成平端的Sfl/I位点，包含pNZ124复制子；(ii)1.l-kbi7;al-A/nHI片段，其包含/必Z基因的上游区域，所述片段剪切自使用引物-GCGAGATCTAGAGGCCATCTGGGGGGCTTTCT-3'和5'-CGCGGATCCATGGATAATCTTCCTCCCCATCAAAAGTA-3'以及作为模板的凝结芽孢杆菌DSM1而产生的PCR片段；(iii)1.0-kb^威I-户WI片段，其包含cW基因，所述片段剪切自使用引物5'-CGCGGATCCCCTTCTTCAACTAACGGG"^和5'-GCGCTGCAGTTCGCTACGCTCAAATCC-3'以及作为模板的pMH3(实施例4)而产生的PCR片段；(iv)1.3-kb片段，其包含与凝结芽孢杆菌ATCC23498az7/启动子在翻译上融合的保加利亚乳杆菌LMG6901AfW基因，所述片段剪切自pJS27(实施例5);(v)1.l-kbrp/2l-Ag/n片段，其具有制成平端的位点，包含/WZ基因的下游区域，所述片段剪切自使用引物-CGCGGGTACCGGCCGGGCTTTATGG-3'和5'-GCGCAGATCTGTCGAGTAAACGCGGAAAGCATTG-3'以及作为模板的凝结芽孢杆菌DSM1而产生的PCR片段。2)用保加利亚乳杆菌LMG6901^/W基因交换凝结芽孢杆菌DSM17必Z基因通过电穿孔将质粒pRKl转化到凝结芽孢杆菌DSM1中。在于45。C生长的补充有7mg/L氯霉素的BC平板上获得转化体。在通过质粒分离确证转化之后，于45C在BC液体培养基中培养单个菌落至对数中期，其后将温度变为55C并继续温育1小时。将稀释系列涂布在BC平板上并于55X:温育过夜。汇集菌落，并以第二稀释系列涂布在BC平板上。于55C过夜温育后，通过PCR分析来测试菌落的整合状况，从而确证单交换事件。选择出一个菌落以用于通过于55C在含有抗生素的BC液体培养基中相续转移1/1000稀释液(大约IO代)来进行连续培养。大约100代后，将稀释系列涂布在具有抗生素的BC平板上。于55C过夜培养后，通过菌落PCR就A/力Z基因的不存在来测试菌落系列。备选地，通过经菌落PCR就/^Z基因的不存在进行测试，可以在第一事件中的单交换突变体中筛选双交换突变体。从在这些PCR反应中呈现阴性的菌落中分离染色体DNA，并进一步就/必力的存在进行评估，和通过Southern印记分析来确证正确的整合。实施例7.使用经修饰的凝结芽孢杆菌DSM1来生产对映纯的R-乳酸1)经修饰的菌林的构建使用实施例6中描述的方法来构建凝结芽孢杆菌DSM1的衍生物，其中/WZ基因被盒替换，所述盒包含与来自工业凝结芽孢杆菌菌林的启动子融合的来自工业德氏乳杆菌菌林的/必J基因以及来自pMH3的cW基因。所得菌林被命名为RDSM1。2)使用RDSM1进行的发酵RDSM1菌林在模拟工业条件的分批培养中进行生长。在发酵后，测定有机酸的浓度和乳酸的光学纯度(表3)。由凝结芽孢杆菌RDSM1产生的乳酸的99.5%为R-形式。与凝结芽孢杆菌DSM1(实施例5)相比，没有检测到副产物形成的差异。2-羟基丁酸、乙酸、丁酸、甲酸、丙酮酸的浓度低于检测极限(对于丙酮酸<0.02%;对于其他<0.01%)。琥珀酸的浓度低于0.1%(v/v)。这些结果证明，天然凝结芽孢杆菌基因的染色体删除和染色体插入以及(异源)基因的功能表达是可能的，并且可应用于通过凝结芽孢杆菌来生产对映纯的R-乳酸。表3.从50g/L蔗糖的有机酸生产(重复发酵)<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>权利要求1.用于通过遗传改造来修饰兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的方法，所述方法包括:将克隆在包含pSH71复制子或其同系物的热敏感型质粒系统中的DNA引入兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的细胞中；于对于质粒复制而言的许可温度下在选择培养基上培养所述细胞，以选择能够于所述许可温度下在所述选择培养基上生长的经转化的细胞；于对于质粒复制而言的非许可温度下在选择培养基上培养所述经转化的细胞，以选择能够于所述非许可温度下在所述选择培养基上生长的经转化的细胞。2.根据权利要求l的方法，其中所述DNA提供所需的功能性。3.根据权利要求1或2的方法，其中于对于质粒复制而言的非许可温度下进行的培养允许将所述DNA引入芽孢杆菌染色体中，优选地通过同源重组。4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中通过同源重组从芽孢杆菌染色体中去除不需要的功能性。5.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中通过同源重组向芽孢杆菌染色体中引入所需的功能性并同时从芽孢杆菌染色体中去除不需要的功能性。6.根据权利要求6的方法，其中通过将编码S-乳酸脱氬酶的基因替换为DNA构建体来修饰芽孢杆菌属物种，所述DNA构建体包含编码SEQIDNO:1的氨基酸序列或者与其基本上同源并具有R-乳酸脱氢酶活性的氨基酸序列的DM序列，所述DNA序列与在芽孢杆菌属物种中有功能的启动子相融合。7.根据权利要求7的方法，其中所述启动子来自被去除的内源S-乳酸脱氢酶基因。8.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述芽孢杆菌属物种是史氏芽孢杆菌和/或凝结芽孢杆菌。9.根据前述权利要求中任一项的方法，其中所述芽孢杆菌属物种是在孢子形成方面具有缺陷的。10.经遗传改造的中度嗜热芽孢杆菌菌林，其是通过前述权利要求中任一项的方法可获得的兼性厌氧且同型乳酸的芽孢杆菌菌林的衍生物。11.经遗传改造的芽孢杆菌属物种，其是产R-乳酸的。12.用于制备目的化合物的方法，所述化合物优选地为乳酸和/或乳酸盐，其中使用权利要求11的经遗传修饰的兼性厌氧的中度嗜热芽孢杆菌物种。13.根据权利要求12的方法，其中产生R-乳酸和/或R-乳酸盐。全文摘要本发明涉及用于兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属(Bacillus)物种的工业应用的遗传修饰。本发明包括用于通过遗传改造来修饰兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的方法，所述方法包括将克隆在包含pSH71复制子或其同系物的热敏感型质粒系统中的DNA引入兼性厌氧且同型乳酸的中度嗜热芽孢杆菌属物种的细胞中；于对于质粒复制而言的许可温度下在选择培养基上培养所述细胞，以选择能够于所述许可温度下在所述选择培养基上生长的经转化的细胞；于对于质粒复制而言的非许可温度下在选择培养基上培养所述经转化的细胞，以选择能够于所述非许可温度下在所述选择培养基上生长的经转化的细胞。本发明的方法可用于修饰芽孢杆菌以用于R-乳酸的生产，除乳酸以外的其他有机酸、醇、酶、氨基酸和维生素的生产。特别地，本发明提供了一种方法，其中通过将编码S-乳酸脱氢酶的基因替换为包含编码R-乳酸脱氢酶的DNA序列的DNA构建体来修饰芽孢杆菌属物种。文档编号C12N15/75GK101374951SQ200780003441公开日2009年2月25日申请日期2007年1月24日优先权日2006年1月24日发明者E·A·J·海因茨,E·J·G·穆勒科姆,J·斯内尔德斯,M·范哈茨坎普,R·范克拉嫩堡申请人:普拉克生化公司