专利名称：：Fgf2结合肽及其用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉M纤维细胞生长因子2(FGF2)结合肽，其在体外和体内能与FGF2结^f抑制FGF2的做管生成活性，树先^疫没有预期影响。
背景技术：
：ii聚蛋白是以五聚体结构为特征的蛋白超家族1。经典的^Jti聚蛋白C-A^蛋白(CRP)和血清淀粉状蛋白P组分(SAP)A^^别^A^老鼠体内由肝产生的，对A^介质应答的急性被白2'3。Jti聚蛋白与多种酉沐结^4f涉Wj对微生物的先天的私f生，以;5Ut细胞碎片和细^卜M组分的清除1,6。^i聚蛋白的特点在于具有无关的与类U聚蛋白的C末端结构樹目连的N-末端结构域7。原型^ii聚蛋白PTX3"是一个主要由10-20聚体的多聚体纟JLf^的45kD的糖J^t^白ie。对初始炎症信号响应时，由不同类型的细胞，特别是单核吞喧细胞，树突细#内皮细^部产生^#^出PTX311。对ptx3—〃老鼠的研究显示，在体内从富^t明质酸的细l^卜M的叙己，到雌性生育力和^^ft微生物的先天免疫，该分子^复杂的而非多余的作用12'13。这些至少部分地与PTX3高亲合力地与4H^成分Clq，细l^卜基质蛋白质TSG6和选择的孩t生物结合的能力，#傳激活的活化作用和傻逸巨噬细^^树突细胞的病原体识别有关'"。因此，PTX3是一种在多种病理生理糾下具有独特的而非多余的功能的可溶解模式的识别受体U4。成纤维细魁长因子2(FGF2)是一种rt结合生长因子，其絲养的内皮细胞中通过与高亲合力酪氨^L敝体(FGFRs)的相互作用诱导细麟殖，趋化性，和蛋白酶的产生15。FGF2在体内诱导血管生成并在伤口愈合，炎症，动脉粥样硬化，和胂瘤的生长期间调节新血管生成16。在细i^卜环鴻中，；ut分子与FGF2*，因此PiUL了它与内皮细胞FGFRs的相互作用并抑制了它的血管生成活性(16中的#)。许多这种抑制剂^部和/或全身性产生/#^的，i^A血管生成过程复杂调节的基础。长PTX3高亲合力且特异地与FGF2结合。因此，长PTX3在体外抑制FGF2^!负的内皮细麟殖，在体内抑制血管生成7。絲，在动脉受损后，整个PTX3抑制FGF2^i负的平滑肌细胞活^f沐内勵口厚18。因此，PTX3有可能潜^W助于在以两种蛋白共表达为特征的不同病理背景下调节FGF2的活性，所述病理背景包括炎症，伤口愈合，动脉粥样硬化，和肿瘤形成。然而，已经揭示该蛋白没有治疗作用，表明无法利用这种大衬以及该蛋白的雞的活性。事实上，PTX3通过C末端U聚蛋白结构域与Clq结合1。。目前，i^殳有发现PTX3的N-末端的生物学功能。基于此，发明人研究了PTX3N-末端与FGF2的相互作用的能力。发明详述已敏J腿转录病毒转导的錄达PTX3的N-末端片段(1-178)的内皮细胞，显示出f^f氐的响应FGF2的贿丝分絲性。纯化的重组体PTX3(1-178)结合FGF2并&jh了PTX3/FGF2的相互作用。还有，识别PTX3(87-99)表位的单克隆MmAb-MNB4也P且止了FGF2/PTX3的相互作用并消除了PTX3的FGF2拮抗活性。发明人惊奇_现非常短的肽也^#这样的活性并可用作治疗药物。同样地，合成的肽PTX3(82-110)，PTX3(97-110)，PTX3(97-107)和PTX3(100-104)擅合FGF2，并抑制FGF2与固定在BIAcore传感器芯片上的整个长PTX3相互作用及体内FGF2,的内皮细自歹1^血管生成。因此，这些数据允许在PTX3N-末端扩展区(5f"度为PTX3(97-110)的区域)内鉴定非常短的FGF2结合结构域。与该序列相关的合成肽能够结合FGF2并在体外抑制FGF2^r管生成，并iL^体内对先^Jt疫没有预期的影响。因此4^发明的主要目的是式I的FGF2结合肽<formula>formulaseeoriginaldocumentpage5</formula>(I)其中X,是选自Arg和Lys的^J^;X2是选自Cys和Thr的^tJ^;H或者林在或者由选自SEQIDNO:1和SEQIDNO:3的^Ju^序列纟咸；R2或者不存在或者由选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:4的#^序列纟iL^，并遵从如下如下M:当R,不^^在时，R2也:^"在；当R,;i^J^f列SEQIDN0:1时，R2是-tJ^列SEQIDNO:2;当是^J^列SEQIDNO:3时，R2是选自SEQIDNO:2和SEQIDNO:4的^J^序列；其功能矛汴生物，前体和药学上可接受的盐。优选&是Arg。更优选的是&是Cys。甚至更^Li^斤述肽由选自SEQIDNO:5,SEQIDNO:6，SEQIDNO:7和SEQIDNO:10的^J^列纟赋。本发明进一步的目的是缀^^合肽，其含有式I的M其功能衍生物。术语"肽""^用于指包含4到100或更多的连续^J^的多肽链，通常是5到20个连续^J^。术语"功能，，定义为肽显示FGF2结々阵性，能大大降低FGF2生物学活性。FGF2的生物学活性包M有丝分fl^血管生成作用。特别地，本发明的肽能够抑制FGF2i秀导的内皮细g平滑肌细胞的增殖。"前体"是通过新陈代it^S^的加工^fe用到细^iSl人^ML前或之后能够转变为^^明^^的^^。本文中，术语"盐"指的是本发明的肽，多肽，或其类似物的M^团的盐和氨基的酸加成盐。M基团的盐可以通过^4页域已知的方法制成，包括无机盐，例如钠，银铵，三价铁的或锌盐等等，以及因制备而带有有积碱的盐，例如带有胺，比如三乙醇胺，精氨酸或赖氨酸，旅咬，普鲁卡因等等。酸加成盐包括，例如，用无才几酸的盐，例如盐酸或硫酸，和用有才几酸的盐，例如，乙酸或草酸。任何一种这样的盐应该^i^^上具有本发明的^多M其类似物的类似的活性。本文中所用的术语"^t生物，，指的是可以根据已知的方法由存在于^J^部分的侧链或N-/或C-末端基团上的官能团制备的衍生物。这样的衍生物包括例如^i^团的酉旨或脂肪族氨"f雄，游离^JJ^团的N-^^衍生物，或游离羟M团的0-^4衍生物以及由^^团例如&10&11(^1-或芳^^-基团形成的衍生物。本发明还包括已经披露的肽的肽才勤以物，其中肽的性质已^氨J^^f则链，tt^手性和/或肽主^^平上以化学方法改变。这些改变意，于提供具有类似的(如果没有改善)治疗，诊断及药代动力学'&贡的FGF2结合制剂。例如，当注射到受体后，#易#^^，用不可，的^^勤以^^换特别敏感的肽键可以提l种更稳定的肽，因此治疗时更有效。同样地，L-M^基的置^^一种标准方式，用于^M"蛋白7JC,用具有较低的敏感性，而最终更类似于有才ji^^而非肽。还可采用^JjW的封闭基团比力喊Xl^^J^，乙錄，琥珀醋，甲^j45t祐錄，环絲，己二絲，壬二酰基(azelayl)，丹絲，节萄基羰基，芴基曱ltj^絲，曱錄壬二錄，曱M己二g，曱lLiJ^J^，和2,4-^5肖_^^基。许多，的用于增加效力，延长活性，^it提纯，和/或延长半衰期的#^在^4页^#是已知的。本发明的肽的性质可以在突变的肽中保持，甚至加强。正如^4页域已知的方法决定的或下面的实例所的，突变的肽包括其中一个或多个^J^J^,皮保守替4戈的^序列，只要它们拟目等甚至较高水平Ji^示出^^发明的相同的生物学活性。才本发明，突变肽舰的通常是已知的"保守"或"^^"^f戈。保守M酸^R^)那些具有十分类似的化学'1"^"的^J^酸进行的，以^#^的结构和生物学功能。文献提供了许多模型，利用这些模型可以基于对天然蛋择。、、5'、，"、，突变的肽可以由传统的编码DNA定点诱变技术，编码DNA序列(比如DNA移码，噬菌体展示/选择)或^水平上的组合技术，计^4雄助设计研究，或^^可雞的已知的适当技术来产生，这些技^M1供了一个J^上与突变糾目应的有限集合，而这些败逸常可以由本刀页域的技^A员利用#技#本专利申请的实施例的教导^yf或I^E。本发明的另一个目的是融^^合肽，^"有式(I)的M其功肯^f生物。所定义的它们的突变体/衍生物，以M于除PTX3以外的蛋白序列的^J^列，以提供额外的私资而不会，削弱FGF2结合活性。可包含在融^V或嵌合的蛋白内的额外的蛋白序列可以选自膜结合序列，膜结妙白的*卜区域，免疫球蛋白的恒定区，多聚化(multimerization)结构域，4&卜蛋白，^f言号肽的蛋白，棘出信号的蛋白。由融沐/或嵌合的多贼赵示出的额外寸^^|^容易提纯的能力,在体液中更长的持续半衰期，或细*卜定位等。这个后天的特'l"树特定的包括在上述定义内的一组融合或嵌M白来^^有特别的重要意义，因为它允许本发明的肽定4i^一个空间内，在这个空间里不但^^的分离和提纯变得^/方便，而且在其中PTX3与FGF2自然^目互作用。与FGF2结合，合的一个或多个序列的选择取决于所述的肽特殊用途。做为^^r法，融妙白的制备可以通处成编码其的核酸片段，利用普通的遗传工程技术，在用于修饰原核或^#宿主细胞的病毒粒源的可复制载体中克隆，利用附加型或非-/同源#^栽体，以絲于转化，4錄，或转染的技术。这些载^lf允许包括FGF2结^'J在内的融M白4^核或4^宿主细胞中，在其自身的转，台/终止调节序列的控制下表达，这些调节序列在所述的细胞中选择为^^型活^iU^可诱导的。然后可以分离提供稳定细胞系的细胞系。特别地，不^f可时，被《辨用于表ii^发明的FGF2结射"的细l^皮直接利用或施用，絲细胞为正常扭PTX3的人类细胞。如*卜序列，输出信号，或信号肽的情况下，当额外的蛋白序列允许FGF2结合结构域分泌到细I^卜空间中时，考虑到下一步的处理，试剂可以更容易^kA^养细胞中收集和纯化，或者可选择地直樹^D或施用细胞。如膜结^"白序列的情况下，当额外的蛋白允许FGF2结^'固定在细絲面时，考虑到下一步的处理，试剂可能不太容易M养细胞中收集和纯化，但可以直^fM或施用细胞，以一种对应于某种天然PTX3的形式提供试剂，尽可育^W:高其性能。还可以通过计^Llt助药物设计的方法ilt^定本发明FGF2结合肽，该方法利用本发明的肽结构和/或序列，或如上面定义的相应的活性突变体。利用计#4對財支术可更有舰用本发明的肽研究PTX3与FGF2之间的相互作用。这种计#^赠助分析可浮，来开发合成的有才;i^或肽(例如:4-20个^4^狄)形式的改善的肽或非肽拟似药。一M些^^经筛选并发现能与FGF2结合，那么将利用细月狄动物才莫型对其用iti^f恃定。本发明的多肽可以与异源部分^h或非M结合，或直接或通过^JD4給剂或接头构成活性缀合物或复合物，这些异源部分可以选自细l^lit剂，#^己(例如，生物素，荧光4朽己)，药物或，的治疗剂。可以利用本领域已知的分子和方法(iW性或荧光^i己，生物素，细l^4生剂，药物或，的治疗剂)制备可用的缀*或复^。细胁f生剂包括化疗剂，毒素(例如，细菌，真菌，植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)，或者iMt性同位素(即，性缀^4勿)。能用的酶活性毒素及其片段包括白喉A链，白喉毒素非结合活性的片段，夕卜毒素A链(源自^l^f菌(Pseudomonasaeruginosa)),11^4"蛋白A链，相思豆絲白A链，蒴莲^^素(modeccin)A链，or帚曲霉素(a-Sarcin)，油桐(Aleuritesfordii)蛋白，石竹素蛋白，美洲商陆(Phytolacaamericana)蛋白(PAPI，PAPII,和PAP-S)，苦瓜(Momordicacharantia)抑制剂，麻W"素蛋白，巴豆毒蛋白，石碱草(Saponariaofficinalis)抑制剂，白树毒蛋白(gelonin)，mitogellin，局限曲菌素，酚霉素，伊诺霉素，和单端^#烯族^^物(tricothecenes)。M,性核素可用于制备;^yt性缀合蛋白。实例包括2"Bi，131I，131In,9°Y，和le。还可以制名^r用的缀*或者复*以改善试剂的药物的递a力。为此，本发明的肽可以与分子比如聚乙二醇及务池天然的或合成的聚合物形成活性缀^7或者复"^(Harris顶和ChessRB，NatRevDrugDiscov.(2003)，2(3):214-21;Gree画ldRB等，AdvDrugDelivRev.(2003),55(2):217-50;Pillai0和PanchagnulaR，Curr0pinChemBiol.(2001),5(4):447-51)。在这一点上，正如在本文中公开的，本发明关注以化学方法修饰的肽，其中肽是与聚^连接的'4，聚*是7條性的，以便缀錄在7j^目，比如生理恥免中不^^D定。用于治疗的缀^可以包含药学可接受的水溶法聚^部分。iM的水可溶性聚絲包緣乙KPEG)，单曱|1^-PEG，单-(C1"C10)^I^PEG，芳llJ^PEG，聚-(N-乙烯基他咯烷酮)PEG，tresyl单曱lL4PEG,PEG丙醛，双-彭白^iE胺基(succinimidyl)碳BPEG，丙二醇均聚物，聚环氧丙烷/环氧乙;^聚物，^乙烯多元醇(例如，甘油)，聚乙烯醇，葡彩瞎，纤维素，或其他的基于碳水^^物的聚合物。适用的PEG可以具有从大约600到大约60，000，包括,例如，5，000,12，000，20，000和25,000的M量。缀^也可以包^i些7j^性聚^的;;^^。缀合物的实例包含了本发明的肽和附着至所述多肽N-末端的，1^化物部分。PEG是一种合适的^S^IU膽。作为说明，本发明的肽可以用PEG来修饰，该过程被称为"PEG^匕"。可以用本领域已知的任何PEG化^M行PEG化。例如，可以用反应性的聚乙JHl^通itm^i^^或者^i^版应进行PEG化。在一种替换的方法中，通it^合激活的PEG形成缀合物，其中PEG的末端羟^ll^已经^^性接头4^。本发明的另一个目的是提供编码本发明的FGF2结^^肽的核酸，与上述核酸杂交的核酸，具有简并序列的核酸。本发明还包括病毒i^贫粒源的表ii^体，其^^发明的核酸得以表达，以^这样的栽^#化的原核或真核宿主细胞和由》讽到的稳定的细胞系，这些细月汰达FGF2结^1]，所述FGF2结合剂可以被分泌或在g面jL4达。实例是人类B细胞。本发明的FGF2结合肽可以利用这样的方法制备，即徊菱当的培养基中培养上面描述的宿主细胞并收集FGF2结合剂。编码本发明的肽的DNA序列可以插入并连接到适当的载体中。一旦制成，将表錄体导Ait当的宿主细胞中，该宿主细胞歸表达出肽。利用适当的表ii^体，在M细胞(例如，酵母，昆虫或哺乳动物细胞)或原核细胞中可以表达^f可在本文中提到的本发明重组肽。可以釆用^4贞域已知的任，何方法。为了能够表ii^斤需的蛋白，4ii^体应该还包^^有与编码所需蛋白的DNA相连的转^^调节信息的特定核苷酸序列，由J^吏得基因表达并产生该蛋白。首先，为了转絲因，基因之前必须有可被RNA聚^i只别的启动子，聚M与^^f由此开始转^t程。通用的这种启动子有很多种，其以不同的效率(强启动子和弱启动子)起作用。对于真核宿主，可以才M居宿主的棒I"生,采用不同的转^^调节序列。它们可能衍生自病毒，比如腺病毒，牛乳头瘤病毒，猿猴病毒等等，其中的调节信号与具有高表ii7jc平的特殊基因相关。实例是疱渗病毒的TK启动子，SV40早期启动子，酵母gal4基因的启动子，等等。可以选择能够允i午抑制和激活的转^i台调节信号，以^更调节基因的^Ji。#^有编码本发明蛋白的核苷齡列的DNAM插^^具有有^j^接的转^N^W1节信号的载体中，该栽体能够将所需的基因序列齡到宿主细胞中。也可以通过导入一个或多个允许用于选择包含表ii^体的宿主细胞的才朽己^it择已^皮导入的DNA稳定转化的细胞。^i诚可以为营养缺陷型的宿主提供M营养，还可以提供^^t物剂抗性，如抗生素抗性，或重金属抗性比如铜抗性等等。可选择的才朽己基因可以直接与待表达的DNA基因序列连接，也可以通过共转染导Ai'J同一个细胞中。载体的附加元件还可f沐利于获得本发明蛋白的最佳产品，特别是对于选棒f争别的包含质iNsl病毒载体的细胞易于从不^^体的受体细胞中识别并挑选出包M体的受体细胞；在特殊的宿主中要求的栽体的拷贝数；以及载体是否能如意^不同种类的宿主细胞间"穿梭"。一旦制M用于表达的包^J建体的载^DNA序列，就可以采用<封可合适的方法转化，转染，接合，原生质体融合，电穿孔法，磷酸铞沉淀，直接的显微注射等等将DNA构建体导AJiJ适当的宿主细胞中。宿主细胞可以是原核的或真核的。优选M的宿主，例如哺乳动物细胞，比如人，猴子，小鼠，以及中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，因为它们提M白质分子的l^f后^,，包括正确的折叠或^JE确的位点糖基化。酵母细舰可以进行包4甜唐基化作用的肽的^后#^。存在许多利用强启动子序列和质粒高拷贝数的重组DNA策略可以用于在酵母中制备所需蛋白。酵母能i尸Jj克隆的哺乳动物基因产物的前导序列并分泌具有前导序列的肽(也f^U^前肽)。导入载体后，在选#^养基中培养宿主细胞，该培养基用于筛选包M体的细胞的生长。克隆基因序列的表达导致产生出所需的蛋白。许多综述和书籍|€供了々"可利用栽体和原核或M宿主细胞克隆并生产重组蛋白的教导，例如一些由牛津大学出版社出版的系列标题为"实践方法"的书籍("DNA克隆2:表达体系"1995;"DNA克隆4:哺乳动物体系"，1996;"蛋白表达"1999;"蛋白纯^4支术"，2001)。化学合^^支术的实例是固相合成和斜目合成，其为生产本发明的FGF2结合剂(以liiUM^以物的形式)提供了更多的指导。例如固相合成时，与待合成的肽C-末端对应的^iJ^合到不溶于有才;i^剂的支持物上，！5l^gj^的交替重复，具有^J^侧链官能团用适当的保护基团保护的^J^^l从C-末端到N-末端缩合，再做出与树脂结合的^J^或肽的^J^呆护基，如jfc^f申肽链。才財居4吏用的1呆护基团的类型，固才目^^成方法主#为tBoc方法和Fmoc方法。的保护基团包括用于絲的tBoc(叔丁^J^tt)，Cl一Z(2-氯千M^)，Br-Z(2-溴千^JO，Bzl(苯甲基)，Fmoc(9-芴甲城基)，Mbh(4，4，-二曱^^1苯甲基)，Mtr(4-甲錄-2，3，6-三甲J^絲)，Trt(三苯甲基)，Tos(甲^t^JO，Z(千Il4絲)和ClfBzl(2，6-二絲甲基)；用于胍絲团的恥2(硝基)和Pmc(2,2,5,7，8-五甲基色烷-6-^tJO;和用于羟基的tBu(叔丁基)。需要的肽合成后，对其进行脱保护^并从固体支持物上将其切下。这种肽的切除^，对于Boc方法可以用氟化氬或三氟代曱^t^进行，而对于Fmoc方法则用TFA。通过DNA重组或化学合^U支^I^得的FGF2结射ij最^"经过一次或多次的纯化。可以通过^f^f可用于此目的的已知的方法来进行纯化，也#&，任何包括萃取，W定，层析，电泳等等的常财法。例如可以4^1HPLC(高效斜目色谱法)。可以利用通常用于蛋白纯化的基于7K-乙腈的溶剂进fr冼脱。本发明包括了本发明FGF2结射'j的纯化制剂。本文中^JD的纯化制剂指的是本发明的4^物干重至少1%，M至少5°/。的制剂。如上所述的本发明的4^物(蛋白，肽，有4X4^物)可以用做药物。优选用于抗由于血管生成改变导致的疾病。更优选由生长因子FGF2的活性引fejk管生成的改变。口^疾病选自关节炎疾病，肿瘤#^多，糖尿病'f織网膜病变，牛皮癣，慢性炎症，动乐W更^il肺瘤。^(fei^W瘤选自肉瘤，癌，类癌，骨瘤或神经内分泌瘤。如上所述的本发明的化合物(蛋白，肽，有才;i/f化物)可被用于抗与FGF2依赖的成纤维细胞或平滑肌细胞增殖不受控制，与成纤维细^^it/l相关的瘢痕形成以;^jk管成形后再狭窄相关的疾病。事实上，本发明的FGF2结合肽一旦与FGF2结合，才MJFGF2的抑制剂。实际Ji^发明的肽能够抑制FGF2诱导的内皮细胞或平滑肌细胞的增殖。所以这种分子的治疗潜力在，防和/或治疗在其中抑制FGF2有好处的疾病。其随后的^ii可以用&成少表达FGF2的细胞的lt量。本发明的FGF2结合肽可被用作用，防和/或治疗由血管生成改变导致的疾病的药物组^中的活性成分，其中的血管生成^A由于FGF2的活性引起的。所述疾病的实例是关节炎疾病，肺瘤##，糖尿病'船见网膜病变，牛皮瘅，慢性炎症，动乐W更^il肿瘤，其中肺瘤是，例如，肉瘤，癌，类癌，骨瘤或神经内分泌瘤。本发明的FGF2结^'J还可^UIHM，防和/或治疗与FGF2依賴的成纤维细胞或平滑肌细胞增殖不受抑樹目关的疾病(例如与成纤维细^jSitl相关的瘢痕形成以Ajk管成形后再狭窄)的药物组，中的活性成分。本发明还提供了用预防和/或治疗上述疾病的，含有治疗有效量的式I的肽或其功能衍生物以及适当的稀释剂和/或赋形剂和/或佐剂药物的药物组合物。这些药物组*可以与药学可接受的栽体，赋形剂，稳定剂，或稀释剂一起配制。才^居制剂的'^t,药物组^/可以用于与CD4+T细l&f关的疾病，例如自身免疫疾病，炎症，或感染。包含本发明的FGF2结合肽的药物组*包括了所有的组合物，其中所述的^^物为治疗有效量，也^^^治疗的动物中iii'j医学上期望的^的有效量。药物组^中可以包^t当的药学可接受的载体，生物学相容的适于对动物给药的介质(例如，生理盐水)和^包含的，^更于将活性^^加工成制剂(其在药学上可被使用)的辅剂(像赋形剂，稳定剂或稀释剂)药物组^可以按照^fT^接受的方法配制以满A^药方式的需要。用于药物递送的生物材料及^聚^^的使用，以及不同的用于^iE^药的特定方式的技#模型在文献中e^"披露。对本发明的化^进行^i^以^ii其穿透血脑屏障也是有利的。^^页域的技^A员可以决定并采用^fTT接受的给药方式。例如，可以通过树肠胃外途径比如经皮下，静脉内，皮内，肌内，内，鼻内，经皮，口腔，或面颊来给药。可以通过推注或长时间的平緩灌注iMi行肠胃外给药。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水或非水f生溶液，悬浮剂，和乳剂，其可以包含;^4页域已知的助剂或赋形剂，并且可以按常规方法制备。Hi^卜，活性^^;悬浮剂如油性注射悬浮剂可以用于给药。适当的亲脂性的溶剂或介质包括脂肪油，例如，芝麻油，或合^J旨肪酸S旨，例如，芝麻油，或合^J旨肪酸酯，例如，油酸乙酯或甘油三酸酯。水性注射悬浮液可以包含增加悬浮剂粘性的物质，包括，例如，羧曱基纤维素钠盐，山梨糖醇，和/或葡聚瞎。任g,悬浮剂还可以包^^急定剂。药物组^;包^it当的用于注射给药的溶液，并包^^从大约百分之0.01到99，优i^A大约百分之20到75的与赋形剂-^的活性^^。可以，给药的组合物包緣剂。应理解的是给药剂量将取决于受体的年龄，性别，W:和体重，以及同时发生的治疗方式，如M,还有治疗的频率，以及要求的^t^的'^t。正如本领域^支术人员明白和可决定的，剂量^"适合个体目标。每种治疗所需的总剂量可以通过多次剂量或单次剂量给药。本发明的药物组合物可以直^4十对病况或针对病况的^^状单独或连同其他的疗法给药。通常洽性成分的每日剂量在0.01到100毫克^/〉斤体重之间。本发明的^^可以在药学可接受的载体(例如生理盐水)中通过静脉内给病A^用。可以釆用肽的胞内递送的标准方法，例如，通i^旨质体递送。这些方法对于;^页域的技7pv员来i)L^0^斤周知的。本发明的制剂可以用于肠胃外给药，例力0#脉内，皮下，肌内，和^M内。正如医学领域/^的，用于任何一个的病人的剂量MiS午多因素，包括病人的个体大小，体表面积，橫，待施用的特殊^^/,性别，给药时间和途径，综合的健康状况，和将同时施用的其它药物。本^/斤有《I用的文献在此以《1用方式完4^f入，包4封皮？1用的参考文献中的所有的数据，表格，图形和正文。jW卜，在本文中引用的参考文献中引用的参考文献的所有内容也以？1用方式完4^fA^iL。无^M可，对已知方法步骤，常旨法步骤，已知的方法或常^r法的参考文献不属于W目关
技术领域：
中披露，教导或建i5C^发明的任何方面，描itiH沐实施方案。一旦了解本申#的方法和产品的沐吾、，可以m^易舰itt^"技术的综述推导出必要的和额外的步骤，对于描ii^发明基本细节和一些应用的非限制性的附图和实施例也;i如此。图1.通过jjj转录病4^导的Ntera-PTX3对FGF2的促有丝分裂活性的抑制。(A)对用EGFP，人4^PTX3，sC,-PTX3,或N咖-PTX3逆转录病絲染的鼠科主动脉内皮(MAE)细胞的M培养的蛋白质印迹分析。在sC,-PTX3泳道中存在两条对应于糖基4咏非糖基化形式的重组蛋白ie的免^J^性的条带。(B)用FGF2(0.55nM)刺激逆转录病毒感染的MAE细胞。48小时后，用胰蛋白酶处理细胞并进^i十数。数据表示为在才對以物感染的FGF2处理的细胞中观瘵到的增殖的百分比(细l&Wt力口0.8倍)。(C)用来自感染的MAE细胞的糾培养^j显育GM7373细胞并立即用0.55nM的FGF2处理。24小时后，用胰蛋白,理细胞并进^i十数。数据表示为在添加有FGF2的新鲜培养基中温育的的GM7373细胞中观蕃到的增殖的百分比(细l^^增加1.0倍)。在B和C中，数据是一式三份的3个独立实糊平均数士SD。图2.重组N咖-PTX3对FGF2/PTX3的相互作用的抑制。(A)由转化的;^杆菌细l^达并纯化重组的带6xHis标签的N咖-PTX3和C咖-PTX3。(插图显示的"口载纯化蛋白的SDS-PAGE皿的银染)。然后，涂有FGF2的孔与全长PTX3，N咖-PTX3或C咖-PTX3(都是44nM)在37。C温育30分钟。通定化的FGF2结合的蛋白的相对的量。(B)在不含或^it量10倍摩尔量的全长PTX3，N咖-PTX3或C咖-PTX3的*下，涂有FGF2的孔与生物素化(biotinylated)的PTX3(bPTX3，22nM)—起温育。然后，测定与固定的FGF2结合的bPTX3的量，数据表示为在不含^f可竟争者的条件下测定的结合的百分比。所有的数据都是一式三^j3个独立实验的平均数士SD。图3.PTX3表位图镨。(A)利用单克隆胁mAb-MNB4和mAb-16B5对4^PTX3，Nterm—PTX3,和Ct咖-PTX3(200ng/泳道)进行蛋白质印迹分析。(B)通迚泉合成技术将横跨整个人PTX3序列的128个重叠的13肽排列在纤维素膜上。然后，用抗体mAb-MNB4(黑色柱)和mAb-16B5(灰色柱)对膜进^^!，J，并用光密;t^析法对菔上的免疫复^^进行定量分析。被两种图4.mAb-MNB4阻碍FGF2/PTX3的相互作用。(A)用22nM的bPTX3在不含或含4^PTX3，mAb-MNB4，或mAb-16B5(全都是220nM)的条件下温育涂有FGF2的孔。然后，测定与固定的FGF2结合的bPTX3的量，数据表示为在不含"f壬何竟^的条件下测定的结合的百分比。(B)用FGF2(0.55nM)外加PTX3(220nM)在不含或含mAb-MNB4,或mAb-16B5(两者都是2.2jiM)的条件下培养GM7373细胞。24小时后，用胰蛋白i^t理细胞并进^i十数。数据表示为在，FGF2培养的GM7373细胞中XC^到的增殖的百分比。所有的数据都是一式三份的3个独立实验的平均数±SD。图5.合成的PTX3财FGF2/PTX3相互作用的抑制。(A)人PTX3的N-末端和相关的合成ptx3肽的示意图。(b)涂有标明的ptx3肽的孔(200jjg/孔)加入FGF2(80nM)，并测定FGF2结合的量。数据是一式三份的3个独立实验的平均数士SD,其表示为与涂有PTX3的孑L^合的FGF2量的百分比。(C)上图FGF2(0.8iaM)注射到涂有PTX3或明胶的BIAcore传感器芯片上。下图Sensogram;tJi^示递增量的FGF2(0.1，0.5，0.8和1.1pM)与固定的PTX3的结合。M记录为时间函数(以共4Il^(立RU表示)。(D)在增加浓度的全长PTX3(園)或合成的PTX3肽(82-110)()，混杂的PTX3(82-110)()，或PTX3(57-85)(□)的存在下将FGF2(0.8|aM)注射到涂有PTX3的BIAcore传感芯片上。在注射结束时记^A^并绘制为拮抗剂M的函数。对于^"^种肽，在2-3个的独立实验中M到了刻以的结果。(E)在不含PTX3或含PTX3(220nM)或含标明的PTX3肽(都是66juM)的条件下，用FGF2(0.55nM)培养GM7373细胞。数据是一式三份的3个独立实验的平均数±SD，其表示为在^UUFGF2培养的GM7373细胞中，膝到的增殖的百分比。图6.PTX3(97-110)肽歸FGF2拮抗剂。U)PTX3(82-110)区间肽示意图。(B)涂有标明的PTX3肽(200jag/孑L)的孔用FGF2(80nM)温育并测定结合的FGF2的量。数据是一i^X份的3个独立实验的平均数士SD，表示为与涂有PTX3的孑L结合的FGF2量的百分比。(C)在PTX3(82-110)()，PTX3(97-110)(o)，PTX3(82-101)(■)，或PTX3(82-96)(▲)浓度增加的^下将FGF2(0.8)iM)注射到涂有PTX3的BIAcore传感器芯片上'在注射结束时记^Ml并绘制为拮抗剂浓度的函数。对于^-种肽，在2-3个的独立实验中麟到了类似的结果。(D)在不含或含标明的PTX3肽(都是66/aM)的务降下用FGF2(0.55nM)温育GM7373细胞。数据是一式三份的3个独立实验的平均数士SD，表示为在^UDFGF2温育的GM7373细胞中观测到的增殖的百分比。(E)在PTX3(97—110)()PTX3(100-110)()，PTX3(97-104)(▲)，或PTX3(97-107)(T),PTX3(104-113)()，PTX3(100-113)(▲)，PTX3(100-104)(■)^!增加的糾下将FGF2(0.8nM)注射到涂有PTX3的BIAcore传感器芯片上。在注射结束时记^A^并斜'J为拮抗剂浓变的函数。对于^"种肽，在2-3个的独立实验中，到了类似的结果。图7.PTX3(82-110)肽的:Rjk管生成活性。在第11天#^有介质(a)或含16pmol的FGF2且不含(b)或含有(c)3nmol的PTX3(82-IIO)的藻^珠子才lA^鸟胚胎绒4^^M(CAM),在第14AXt其进行拍照。原始放大倍数，x5。实施例实施例1化学药品分别在大肠杆菌和和中国仓鼠卵巢细胞中表达人重组FGF2(登记号码09038)和PTX3(躬己号码swiss-protP26022)^^文献,进4询化。合成的人PTX3(31-60)，PTX3(57-85)，和PTX3(107-132)肽由Primm(Milan,意大利)|^供，^fe所有的肽由Tecnogen(PianadiMonteverna,Caserta，意大利)提供(HPLC純度>95%)。表1以单字母^^显示了所有的肽的^tj^列，编号是从PTX3前导序列位置1中的曱石M^^^开始。表l.人PTX3的N-末端区间的合颇。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>针对纯化的人PTX3的大鼠单克隆^#4之贿所描述1D'2°(MNB1目录号ALX-804-463,MNB4目录号ALX-804-464,AlexisBiochemicals)。细月姊养胎牛主动脉内皮GM7373细胞"在含有10^胎牛血清(FCS)的Eagle，sMEM培养基中生长。人胚肾(EcoPack2-293)包装细胞(Clontech，CA，美国)在含有10%FCS的DMEM培养基(LifeTechnologies,Gaithersburg,MD)中生长。Balb/c鼠科主动脉内皮22106细胞(MAE细胞)获自R.Auerbach(Wisconsin大学，Madison，WI)并妙有10%FCS的DMEM培养基中生长。逆转录病毒感染编石马人PTX3和增强型绿色荧光的蛋白(EGFP)的cDNA才財居e^的文献"描^:得。通过PCR和标准的克隆技术由pLX-PTX3"产生编码与用于PTX3分泌的前导序列PTX3(1-17)融合的N-末端片段PTX3(1-178)(N咖-PTX3)和C末端片段PTX3(179-381)(sC咖-PTX3)的cDNA。所有的cDNA克隆到pBABE逆转录病毒载体中，生成pBABE-PTX3，pBABE-Nterm-PTX3，pBABE-sC咖-PTX3,和pBABE-EGFP，用于在Lipofectamin"存在的条件下转染EcoPack2-293錄细胞(packagingcells)。用嘌呤霉素(1Mg/ml，Sigma)筛选转导的细胞，持续2周。病毒滴A变高于106cfu/mL的克隆用于进一步的实验。然后在含有聚凝胺(8ug/ml，Sigma)的条件下，将MAE细胞的铺满培#^用来自pBABE-PTX3，pBABE-Nterm-PTX3，pBABE-sC咖-PTX3,或pBABE-EGFP^细胞的M培养^显育24小时。用嘌呤霉素筛选受感染的细l^并持续7天。用,焚絲孩i镜(AxiovertS100显孩￡镜，x10/0.25;ZeissG6ttingen，德国)对感染EGFP细胞的观测显示逆转录病毒的感^t率高于80%。为了评定受感染细胞的转基因蛋白的表^#放的水平，在M清^t下培养细胞2天。然后，收集糾培养基，离心分离，用CentriconYM-10过滤器(Millipore)棘10倍，取100ju1的等^#进行蛋白质印迹检测分析。细麟殖微按照文献描述22用内皮细^^行细^>曾殖"。简而言之，GM7373或廳细月&^种在96孔的平皿中，接种量分别为75，000细胞/cm2或25，000细胞/cm2。16小时后，在含或不含不同拮抗剂的糾下，在包含0.4%FCS夕卜加FGF2(0,55nM)的新鲜培养基中温育细胞。分别在24或48小时后，在Burker小室中对细舰行胰蛋白舰S^i十数。重组的带6xHis-标各的PTX3片段的;t^杆菌的表缺纯化利用含外加的核苷酸的引物通过PCR由pLX-PTX3扩增出NtOT-PTX3和Cterm-PTX-3的c薩ptx3-n:(+)caccgagaactcggatgattatga8(seqid17);(-)ttaacctgccggcagccagctcc(seqid18);ptx3-c:(+)cacctgtgaaacagctatttta(seqid19);(-)ttatgaaacatactgagctcc(seqid20).将这些cDNA克隆到pENTRT0P0载体中(pENTRDiectinonalT0P0CloningKit,Invitrogen)并测序。然后利用Gateway(g)^支术(Invitrogen),将源自pENTRT0P0栽体的Ntem-PTX3和Cterffl-PTX3的cDNA克隆到pDEST17载体中，使得6xHis标^4iA^重纟且蛋白的C-末端上。然后用逸两个重《rt粒转化^杆菌BL21-AI细胞(Invitrogen)，^ff吏:t^杆菌在37。C下，在含100iag/mL氨千青霉素的LB培养Ui生长。在0.2%的L-阿拉伯糖存在的条件下，30。C培养过夜以诱导重组蛋白的表达。诱导后，将细胞重悬于緩冲溶液中(20mM磷酸钠，0.5MNaCl，10raM咪峻，pH7.4)并用超声处理使细胞H^。澄清的悬浮,;M0.45lam的itj虑器i^虑并上才羊到3.OmlHiTrapImmobilizedMetalAffinityColumn(IMAC)(AmershamBiosciences)上用4^提纯。用^"有100niM咪哇的结合緩液涤冲^^析柱，#^照厂商的说明用300虛的咪哇'皿下结合的蛋白。通狄疫印^^v测出含有重组蛋白的流分，收集阳性流分并在PBS中通过^Mit;虑层析法(SephadexG25columnPD10，Amersha迈)进行脱盐。通过SDS-PAGE随后为的银染的测定显示重组蛋白的#高于90%(参见图2A的插图)。在4。C下用含有FGF2(270nM)100ial/孔100mMNaHC03，pH9.6CIA緩沖'測温育的ELISA微平板16小时。然后，在室温下用含5。/。fa旨奶粉的;t^緩冲液涂敷小孔2小时。接下来，在37。C在涂有FGF2的小:JUi温育100ja1等份试样的含有全长PTX3，重组N咖-PTX3或C,-PTX3(4^P是44nM)的PBS30^4中。然后，用MPTX3的多克隆M(1:2000稀释)(在蛋白质印#ELISA中，该抗体以相同的效率识别PTX3片段)在37。C继续温育小孔1小时，用抗触物素化的胁(1:2000),和100ja1的抗生蛋白链菌素,^itlU匕物酶(1:5000，Amersham)在室温下温育1小时。然后加入100m1/孔的色原体底物2，29-联氮基-双-(3-乙基笨并二氢噢唑磺酸)(2,29-azinobis(3-ethylbenzthiazolinesulfonicacid))。在自动ELISA读取器中读取405nm处的piUb值。在某些实验中，是^"或者没有竟争物的的^Ht下在涂有FGF2的小孔上，于37'C温育100ju1等^#的含有生物素#^的PTX3(bPTX3)(22nM)的PBS30分钟。然后，沖洗小孔，射口文献描述"测定结合bPTX3的量。可选择地，#成的PTX3肽如上所述固定到ELISA的微平板孔上(200pg/孔)。然后，加入FGF2(80nM),射口上所舰itjf]兔抗FGF2的多克隆抗体(l:7000)在37'C温育1小时，艇为免^Jj^检测，对与固^i^合的FGF2进^f^则。PTX3表位图谱为了确定与抗PTX3单克隆M结合的表位的^J^序列，通迚泉合^^^"将128个肽排列在纤维素紅。肽^113个>^，且具有3个^JJ^的移码。用在Tween-TBS(MBS)中的2%的牛奶在4。C封闭膜16小时。洗涂后，用单克隆胁mAbMNB4或mAb16B5(都是在MBS中1:1000稀释)在37'C孵育薄膜90^t,然后再用兔的碱性^^酶缀合的抗大鼠IgG(1:30，000，Sigma)在MBS中于37。C孵育90分钟。如文献描述"发生显色反应，利用光密^"析法对薄膜的信号强度进#^则。BIAcore结^i^r辆BIAcoreX设备(BIAcoreInc，Piscataway，NJ)。利用表面等离子絲振iM^则由FGF2结合固定在BIAcore传感器芯片上的PTX3的能力引起的折射率变化。为此，允许PTX3(2,2laM)与CM4传感器芯片的流动细^^，所述细_前用50ia1的0.2MN-乙基-N'-(3-二甲絲丙基)-碳二亚胺氢氯化物与0.05M的N-^^t珀itit胺的混^激活。这些实lNHt得以固定住5，000^#4^立(RUs)，相当于大约0.1pmol的PTX3。明胶固定^^得了类似的结果，其作为阴'f树照，用于空白扣除。然后，林或者没有合成PTX3肽的务ft下，用4分钟将f^l增加的FGF2注射到覆盖在PTX3表面的稀,沖液(PBS夕卜加O.005。/。表面活性剂P20，5.0juig/mL的CaCl2和MgCU中(使得其与固定的PTX3接触)，然后洗涤直^!￡#到分离。鸡胚胎绒樣鰊(CAM)微如文献描述24制备包含介质或16pmol的FGF2，并舍有或者不含合成的PTX3肽的藻g珠子(5Ml)并在温育的第11天将其置于受精的白色来亨鸡卵的CAM的顶端(每实验组10个鸡卵)。72小时后，在立体显微镜(STEMI-SR，x2/0.12;Zeiss)下两个观测者以双盲的方式统计朝着^^v物方向汇合的血絲PTX3N-末端区域结合脂PTX3蛋白的特点在于与经典的^liLi聚蛋白CRP和SAP同源的C末端203tt酸区域(C咖-PTX3)，以M示出与i^f可雞已知的蛋白没有^^T明显的同源性N-末端178-^扩展区(N咖-ptx3)8。在鉴定PTX3的^管生成的FGF2结合结构域的尝试中，^f古了C咖或Nterm-PTX3部分与FGF2相互作用的能力。上述的观测显示由于#^文的PTX3结合到外源生长因子上和其的l^卜环嫂聚J^出上，用含有人^PTX3,PTX3N-絲扩展区N咖-PTX3，或与PTX3前导序列融合用于分泌的PTX3C-末端(sCtera-PTX3)的逆转录病#染鼠科主动脉内皮(MAE)细胞。对照细胞用含EGFP的逆转录病毒感染。受感染的细胞it4达^i文出相似数量的相应蛋白(图1A),而JL^示出在^i-^^Ht下相似的生^iiJL然而，树外源FGF2响应时，与妙PTX3錄达类似，N咖-PTX3的it^达导致受感染细胞增殖能力的明显下降(图1B)。当与受EGFP感染的对照细l^目比时，sCtera-PTX3的it^Ji^而没有产生抑制。为了进一步确定N咖-PTX3作为FGF2拮抗剂的能力，用被感染的MAE细1C)。如同预期的，在N咖-PTX3感染或PTX3感染的MAE细胞的M培养基存在的条件下，用FGF2温育GM7373细胞导fW生长因子的M丝分裂活性的明显抑制，而sCtera-PTX3感染的和EGFP感染的MAE细胞的糸件培养基却没有絲(图1C)。所有糾培养絲不导致由10%FCS引起的GM7373细J^曾殖的明显抑制，因此证实了作用的特异性。为了证实N,-PTX3的FGF2拮抗活性是由于其与生长因子直接相互作用的能力，由转化的;U^杆菌表錄纯化重组的带6xHis-标苍的蛋白Nterm-PTX3;纯化的重组的带6xHis-标各的C咖-PTX3用作对照(图2A，插图)。当"^f古FGF2的相互作用时，MPTX3和重组的UTX3片段显示出与固定在非组织培养的塑辨'J品上的FGF2结合的能力。相^J殳有^L^到与重组CM-PTX3间的相互作用(图2A)。因此，过量10倍摩尔量的重组N咖-PTX3或4^lPTX3，而不是C,-PTX3，FiUi了生物素化的PTX3(bPTX3)与固定的FGF2的结合(图2B)。综上所述，这些结果暗示了PTX3N-末端区域与FGF2的相互作用。抗N咖-PTX3的单克隆^MtFGF2/PTX3相互作用的抑制针对:RAJ^艮PTX3的一组大鼠单克隆g的筛选鉴定出MmAb~MNB42°(MNB4目录号ALX-804-464，AlexisBiochemicals)和mAb-16B51。(MNB1目录号ALX-804-463，AlexisBiochemicals),二者在蛋白质印迹中分别选棒l"生地结合重组N咖一PTX3和C』一PTX3(图3A)。为了标出被两种M识别的PTX3表位，作者利用了点合^^支术23,通itil种才支^纤维素MJL朝^'J了横J^4^人PTX3序列的128个重叠的13肽。当用二个单克隆^^t该膜进4刊果测时，免疫复杨检测显示mAb-MNB4识别存在于PTX3N-末端扩展区的表位PTX3(87-99)，而mAb-16B5识别位于PTX3C-末端区域的表位PTX3(306-312)(图3B)。当针对影响FGF2/PTX3相互作用的能力进行测试时，mAb-MNB4,而不是mAb-16B5,Pibh了bPTX3与固定的FGF2的结合，类似于过量摩尔量的游离的无才朽己的PTX3(图4A)。因此，mAb-MNB4消除了4^:PTX3在内皮GM7373细胞中抑制由FGF2产生的促有丝分裂活性的能力，而mAb-16B5则没有作用(图4B)。因此，mAb-鹏4对N-末端PTX3(87-99)表位的识别中和了FGF2/PTX3的相互作用。FGF2拮抗剂的合成的N!era-PTX3相关肽为了进一步确定在PTX3N-末端扩展区域中的FGF2结合区，发明AJft合成肽PTX3(82-110)以及部^t跨N咖-PTX3^J^序列的三个不同的合成肽PTX3(31-60)，PTX3(57-85),和PTX3(107-132)的FGF2拮抗活性进行了评估，所述合成肽PTX3(82-110)包舍陂中和性mAb-MNB4识别的PTX3(87-99)表位(参iLL面)(图5A)。在第一组实验中，在固相结^^睑中，"^了四个合成的PTX3片段与FGF2相互作用的能力。如图5B所示，游离的FGF2与固定在非组织培养的塑料制品上的PTX3(82-110)结合，而不是与固定的PTX3(31-60)或PTX3(57-85)结合，与固定的PTX3(107—132)條示出有限的相互作用。接下来，利用表面等离子共振(surfaceplasmonresonance)来译阶四种肽影响FGF2/PTX3相互作用的能力。结果显示，FGF2(0.8jaM)具有;f艮强的与固定在BIAcore传感器芯片上的PTX3结合的能力(在注射阶^a^期结合了350-400RU)(图5C，上图)。与涂有明胶的传感器芯片没有结合证明了相互作用的特异性。还将^1增加的FGF2(从0.1到1.1jiM,图5C，下图)注射在PTX3表面上，以测定FGF2/PTX3相互作用的动力学^IL结^t拾逸明^jt的相互作用的动力学解离常数(k。ff)是6xl(T5s—动力学缔合常数(KJ是0.2x103s1M"1，因此产生的L值等于0.3x10"6NT1。^jtt^P出上，在流动相中评估了四种合成的PTX3肽务^FGF2的能力，由此P且止了FGF2与PTX3传感器芯片相互作用。如图5D所示，PTX3(82-110)以剂量依赖方式抑制了FGF2与PTX3表面的结合，其效力比游离的4^:PTX3所显示出的效力低30倍(而对于游离的PTX3和PTX3(82-110)肽瓜。分别等于1.OpM和30"M)。在同样的实验条件下，使用PTX3(31-60)，PTX3(57-85)，和PTX3(107-132)跃而没有抑制錄(图5D及^tUi集的数据)。还有，^J^I赋相当于PTX3(82—110)的混杂的^^U^(scrambledsyntheticp印tide)[sPTX3(82-110)，表l]显示出有限的抑制絲(ID5。>3000|iM)(图5D),由此表明PTX3(82-110)中的一^tJ^序列对FGF2相互作用是很重要的。PTX3(82-IIO)肽与FGF2的结合能力促使了发明AJt其做为FGF2拮抗剂的能力进^ffWK当对内皮GM7373细^i^f^时，^:PTX3和PTX3(82-IIO)都f^卬制由外源FGF2产生的M丝分裂活性，而混杂的PTX3(82-110),PTX3(31-60)，PTX3(57—85)，和PTX3(107-132)肽则没有作用(图5E)。剂量响应曲线证实PTX3(82-110)的FGF2拮抗活性;UH量依赖型的(对于PTX3(82-110)和PTX3，m。分别等于30iaM和30nM)。PTX3的N-末端扩展区域中最小的线性FGF2结合序列的识别综上所述，上述数据表明在PTX3N-末端扩展区域中的线'^tJ^列82-110在FGF2相互作用中^重要的作用。在试图鉴定最小的线性FGF2结合序列时，在固相结^iH3,横跨整个PTX3(82-IIO)序列的三个重叠的合成肽PTX3(82-96)，PTX3(82-101),和PTX3(97-110)(图6A和表1)^UU来评估其与FGF2相互作用的能力。在同样的实验条件下，游离的FGF2与固定的PTX3(97-110)结合，与亲本PTX3(82-110)和4^:PTX3—样，而与PTX3(82-96)或PTX3(82-101)没有相互作用(图6B)。因此，在流动相中，PTX3(97-110)结合FGF2，由此阻止了FGF2与固定在BIAcore传感器芯片上的PTX3相互作用(图6C)。PTX3(97-110)的抑制活性与亲本肽PTX3(82-110)类似，而PTX3(82—96)和PTX3(82—101)则没有作用(图60。与这些观测相一致的是，在内皮GM7373细胞中PTX3(97-110),而不是PTX3(82-96)或PTX3(82-101)抑制了由FGF2产生的促有丝分裂活性(图6D)。为了进一步研究横跨肽PTX3(97-110)的最小的线性FGF2结合序列，发明Aii过测定FGF2与固定在BIAcore传感器芯片上的PTX3相互作用分析了下列短肽与FGF2的结合:PTX3(97—107)，PTX3(97—104),PTX3(100-104)和PTX3(100-110)，(图6E)。肽PTX3(97-107)和PTX3(100-104)显示出明显的与FGF2的结合。相反，肽PTX3(97-104)和PTX3(100-110)则没有阻止游离的FGF2与固定在BIAcore传感器芯片上的PTX3结合(图6E)。因此，PTX3(100-104)似乎^^了在PTX3N-末端扩展区域中最小的线性FGF2结合^J^f列。因此，PTX3(100-104)抑制FGF2i秀导的内皮细g殖。合成的N咖-PTX3相关肽抑制FGF2的血管生成活性为了评估N咖-PTX3-相关肽影响体内FGF2诱导的新血管形成的能力，将仅吸附FGF2或添加有PTX3肽的海绵胶植入11天的鸡胚CAMs的顶端。如图7所示，与吸附介质的藻皿珠子相比，吸附FGF2(16pmol/胚胎)的珠子产生有效的血管生^X^(肉眼可JU月着^v物的血管錄，对于二个实I^BL分别为44士7和11士5条血管/胚胎)。与体外观测一致的是，通錄FGF2;^t^物中加入3.0nmol的PTX3(82-110)肽，体内FGF2絲的血管生^A^明显减少(28±5条血管/胚胎，方差分析p<0.05)(图7)。因此，80nmol的PTX3(97-110)导致由FGF2引起的血管生^JS50M皮抑制；PTX3(82-96)反而无效。#论发明人指出FGF2的相互作用是由PTX3的N-末端扩展区域介导的。絲，用中和性单克隆抗体和合成的PTX3相关lidi行的实验指出M酸线性序列PTX3(97-110)是itA该相互作用的原因。这些结论是以下列实聪^E^为基础的i)短jti聚蛋白CRP和SAP是^^L率的FGF2结合剂17,尽管它们的序列与PTX3的C-末端同源7;ii)PTX3的N-末端片段(1-178)(N咖-PTX3)，而不是sCte-PTX3的逆转录病毒转导在内皮细胞中抑制了由外源的FGF2产生的贿丝分裂活性；iii)重组Nterm-PTX3，而不是Cterm-PTX3，与固定的FGF2结合并抑制PTXVFGF2的相互作用；iv)针对线性表位PTX3(87-99)的单克隆抗体raAb-MNB4阻止了FGF2/PTX3的相互作用并在内皮细胞中消除了PTX3的FGF2拮抗活性；v)基于PTX3的N-末端不同区域的合成的肽PTX3(82-110)和较短的肽PTX3(97-110)，PTX3(97—107)和PTX3(100-104)，而不另_务池的肽，通it^合FGF2阻止了FGF2/PTX3的相互作用，由jtb^制了体夕卜FGF2^的内皮细自歹1^体内的血管生成。PTX3由巨噬细胞27,成纤维细胞9，^细胞28，小M细胞29，和内皮细胞8产生，表明它对内皮能够产生旁分泌(paracrine)和自分泌(autocrine)的功能。类A她，^4t刺激，包括jil^介质IL-1和一氧化氮3°'"^it受刺激的自分泌环的内皮细胞中诱导FGF2的M。因此，PTX3和FGF2^以由内皮细月^^其它类型的细g达。因此，由炎症细M内皮细胞自身产生的PTX3可以在体外和体内影响由内^Ji的FGF2产生的自分泌咖旁分泌活性。这些将允i^iiitik管生成抑制剂和刺激剂的产生,密调节新血管形成。FGF2是多效性的生长因子，其刺激树内胚层和中胚缺源的细胞类型32。因此，在各种病理生理条件下由FGF2产生的作用不P艮于其血管生成活性。例如，FGF2刺激伤口愈合期间的成纤维细胞以及动脉粥样硬化33'34和再狭窄35期间的平滑肌细胞的迁移和增殖。同时，它可以在受损的中;^申经系统中倡进神经元细胞的存活和神皿质细胞的增殖36。在所有的这些情况中，PTX3的伴随产生37'38调节由这些细胞且的FGF2产生的活性。事实上PTX3体外抑制FGF2的平滑肌细胞活化，体内抑制在动脉受损后的内勵口厚18。总之，发明人首次证明了PTX3的N-末端涉及FGF2的相互作用。PTX3在先a疫，炎症，M^^、，和雌性生育力之间的交JU、是个多功能的可溶解的模式识别受体。它通过与许多具有不同衬'&贡的酉e^目互作用发挥其多功能的活'性。参考文献1.GariandaC,BottazziB，BastoneA，MantovaniA.Pentrax'msatthecrossroadsbetweeninnateimmunity,inflammation,matrixdeposition,andfemalefertility.AnnuRevImmunol.2005;23:337-3662.SteelDM，WhiteheadAS.Themajoracutephasereactants:C-reactiveprotein,serumamyloidPcomponentandserumamyloidAprotein.ImmunolToday,1994;15:81-883.PepysMB，BateMLAcutephaseproteinswithspecialreferencetoC-reactiveproteinandrelatedproteins(pentaxins)andserumamyloidAprotein.AdvImmunol.1983;34:141-2124.DuClosTW.TheinteractionofC-reactiveproteinandserumamyloidPcomponentwithnuclearantigens.MolBiolRep.1996;23:253-2605.GewurzH,ZhangXH，LintTF.Structureandfunctionofthepentraxins,CurrOpinImmunol.1995;7:54-646.NautaAJ，DahaMR,vanKootenC，RoosA.Recognitionandclearanceofapoptoticcells:aroleforcomplementandpentraxins.TrendsImmunol.2003;24:148-1547.GoodmanAR，CardozoT，AbagyanR，AltmeyerA,WisniewskiHG,Vilcek丄Longpentraxins:anemerginggroupofproteinswithdiversefunctions.CytokineGrowthFactorRev,1996:7:191-2028.BreviarioF，d'AnielloEM,Go，ayJ,PeriG,BottazziB,BairochA,SacconeS,MarzellaR，PredazziV,RocchiM，etal*lnterleukin-1-induciblegenesinendothelialcells.CloningofanewgenerelatedtoC-reactiveproteinandserumamyloidPcomponent.JBiolChem.1992;267:22190-221979.LeeGW,LeeTH,Vilcek丄TSG-14,atumornecrosisfactor-andIL-1-inducibleprotein,isanovelmemberofthepentaxinfamilyofacutephaseproteins.JImmunol.1993;150:1804-181210.BottazziB，Vouret-CraviariV，BastoneA,DeGio旧L，MatteucciC，PeriG,SpreaficoF,PausaM，D'EttorreC，GianazzaE,TagliabueA，SalmonsM,TedescoF，lntronaM,MantovaniA.MultimerformationandligandrecognitionbythelongpentraxinPTX3.SimilaritiesanddifferenceswiththeshortpentraxinsC-reactiveproteinandserumamyloidPcomponent.JBiolChem.1997:272:32817-3282311，BasileA，SicaA，d'AntelloBreviarioF,GanldoG,CastellanoM，MantovaniA，lntronaM.CharacterizationofthepromoterforthehumanlongpentraxinPTX3，RoleofNF-kappaBintumornecrosisfactor-alphaandinterleukin-1betaregulation.JBiolChem.1997;272:8172-817812.SalustriA,GariandaC，HirschE，DeAcetisM，MaccagnoA，BottazziB，DoniA，BastoneA,MantovaniG,BeckPeccozP,SalvatoriG，MahoneyDJ，DayAJ，SiracusaG，RomaniL,MantovaniA.PTX3playsakeyrateintheorganizationofthecumulusoophorusextracellularmatrixandininvivofertilization.Development.2004;131:1577-158613.GarlandaC,HirschE,BozzaS,SalustriA,DeAcetisM,NotaR,MaccagnoA,RivaF,BottazziB，PeriG,DoniA,VagoL,BottoM,DeSantisR,CarminatiP,SiracusaG,AltrudaF,VecchiA,RomaniL,MantovaniA.Non-redundantraleofthelongpentraxinPTX3inanti-fungalinnateimmuneresponse.Nature.2002;420:182-18614.MantovaniA,GarlandaC,BottazziB.Pentraxin3,anon-redundantsolublepatternrecognitionreceptorinvolvedininnateimmunity.Vaccine.2003;21Suppl2:S43"4715.GerwinsP,SkoldenbergE，Claesson-WelshL.Functionoffibroblastgrowthfactorsandvascularendothelialgrowthfactorsandtheirreceptorsinangiogenesis.CritRev.Oncol.Hematol.2000:34:185>19416.PrestaM,De"'EraP,MitolaS,MoroniE,RoncaR,RusnatiM.Fibroblastgrowthfactor/fibroblastgrowthfactorreceptorsysteminangiogenesis.CytokineGrowthFactorRev.2005;16:159-17817.RusnatiM,CamozziM,MoroniE，BottazziB,PeriG,IndraccoloS,AmadoriA，MantovaniA，PrestaM.Selectiverecognitionoffibrob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