专利名称：稳定前列腺特异性抗原的方法和组合物的制作方法
稳定前列腺特异性抗原的方法和组合物
背景技术：
前列腺特异性抗原(PSA)是一种胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶，能够结合 a-l抗胰凝乳蛋白酶(ACT)和其它丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)，例如al-抗胰蛋 白酶(AT)、蛋白酶C抑制剂(PCI)和a-2巨球蛋白(A2M)。血清中的大部分PSA 与ACT结合。然而，在中性到碱性条件下，与ACT复合的PSA会被水解下 来。PSA与ACT的分离导致活性游离PSA分子的形成，其结合于包括A2M 在内的其它抑制剂。与A2M结合的PSA是大多数商品化的检测方法所无法测 出的。PSA与A2M的结合是这样发生的A2M诱饵区域的Tyr686和Glu687 之间肽键被酶裂解，引起构象变化，并使得PSA被A2M捕获。其结果是，在 免疫测定中，识别PSA的抗体无法结合到PSA，由此导致游离PSA和总PSA 测知率下降。在PSA作为生化标记用于前列腺癌的诊断和分期的检测方法中，由 于PSA-ACT在血清或其它缓冲液中稳定性较差，在监测游离PSA和总PSA 的时候产生了问题。PSA-ACT水解可以通过选择微酸性的最适pH来进行控制； 然而，许多检测需要中性到碱性的pH条件，因此无法提供检测PSA水平的最 佳结果。许多这样的检测要评价多个分析物，或者检测条件特殊，以致于检测 中的最适pH有时候会导致PSA失稳，会产生多种形态(游离PSA和总PSA等)。 因此需要用于监测PSA的改良试剂和分析方法。本发明的目的正是满足上述 需要。
发明概述本发明基于以下发现丝氨酸蛋白酶，例如PSA，和丝氨酸蛋白酶 抑制剂(serpin)，例如抗-胰凝乳蛋白酶(ACT)或抗-胰蛋白酶(AT)，能够通过共 价键进行合成连接，得到一种稳定的试剂，例如，用于对照、标样、或用于例 如PSA等丝氨酸蛋白酶的定量试剂中。将丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制 剂通过共价键合成连接还可以对PSA所在基质中的其它分析物、酶和蛋白提供保护。本发明中，连接丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂的共价键，例
如将PSA连接到ACT之类丝氨酸蛋白酶抑制剂上的共价键，不是自然形成的， 而是通过化学合成引入或通过重组DNA技术引入从而将二者连接。非天然产 生的键不同于天然存在的键，后者例如蛋白酶的丝氨酸活性位点和丝氨酸蛋白 酶抑制剂的反应位点环(RSL)之间的酰基酯连接键(acyl ester linkage),据记载， 该键存在于多种丝氨酸蛋白酶抑制剂/丝氨酸蛋白酶中。因此，本发明提供一种 缀合物，其包含与丝氨酸蛋白酶抑制剂之间具有稳定的共价键的丝氨酸蛋白 酶。优选地，所述丝氨酸蛋白酶是前列腺特异性抗原(PSA)，丝氨酸蛋白酶抑 制剂是al-抗胰凝乳蛋白酶(ACT)。在本发明的缀合物中，蛋白酶，例如PSA， 与丝氨酸蛋白酶抑制剂通过至少一个合成共价键或重组键相连。除PSA之外，其它丝氨酸蛋白酶也可以通过合成键或重组键与丝氨 酸蛋白酶抑制剂连接。因此，在一些实施方式中，可将例如人激肽释放酶或者 胰蛋白酶之类丝氨酸蛋白酶与例如ACT或者抗胰蛋白酶之类丝氨酸蛋白酶抑 制剂相连接。在特定的实施方式中，胰蛋白酶这种丝氨酸蛋白酶通过合成或重 组的方式与抗胰蛋白酶这种丝氨酸蛋白酶抑制剂相连。丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制齐U(例如PSA和ACT)可以通过除 天然酰基酯键之外各类稳定的共价键相连。因此，丝氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白 酶抑制剂，例如PSA-ACT，可以通过酰胺键、胺-胺键、巯基连接键或其它任 何稳定的共价键进行连接。本领域技术人员应当知道，可以通过选择连接键的 种类来获得符合要求的稳定性，例如基于缀合物的既定用途来选择。在一些实施方式中，丝氨酸蛋白酶-丝氨酸蛋白酶抑制剂，例如 PSA-ACT，是采用重组技术进行连接的。由此产生了一种融合蛋白，其两个部 分之间通过酰胺键稳定连接。本发明还提供一种将丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂偶联的方 法，其包括使用交联剂将蛋白酶以化学方式与丝氨酸蛋白酶抑制剂连接。在典 型的实施方式中，蛋白酶是PSA，而丝氨酸蛋白酶抑制剂是ACT。在其它实 施方式中，蛋白酶可以是人激肽释放酶或者胰蛋白酶，其与丝氨酸蛋白酶抑制 剂，例如抗-胰蛋白酶或者ACT相连接。本发明的方法采用了已知的化学连接试剂。例如，在一些实施方式中，所述试剂为马来酰亚胺交联剂。在其它实施方式中，本发明还提供另一种将丝氨酸蛋白酶与丝氨酸 蛋白酶抑制剂偶联的方法，该方法采用重组技术表达产生一种蛋白酶-丝氨酸 蛋白酶抑制剂融合蛋白。在典型的实施方式中，蛋白酶是PSA，而丝氨酸蛋白
酶抑制剂是ACT。本发明还包括试剂盒，其中含有本发明的稳定共价相连的丝氨酸蛋 白酶抑制剂-丝氨酸蛋白酶缀合物，例如PSA-ACT。这种试剂盒还可以包括诸 如分析试剂等其它组分。
附图简述
图1以图解方式显示天然形成的非共价键结合的ACT-PSA复合物和 共价结合的ACT-PSA复合物。
发明详述 介绍本发明提供稳定的(例如pH稳定的)丝氨酸蛋白酶-丝氨酸蛋白酶抑 制剂缀合物，例如PSA-丝氨酸蛋白酶抑制剂缀合物，所述缀合物的用途包括 例如作为对照试剂用于多分析物检测。该蛋白酶抑制剂-丝氨酸蛋白酶抑制剂 缀合物是通过合成或重组产生至少一个共价键将丝氨酸蛋白酶抑制剂与蛋白 酶连接而获得的。较之于天然产生的ACT-PSA复合物，这种缀合物更稳定， 所述天然缀合物非经稳定的共价键相连(图1)，而是具有在酸性或中性pH下不 稳定的酰基酯键。本发明的缀合物可以通过本领域已知的各种方法获得，包括化学交 联和重组技术。通常，反应过程中使用的偶联反应形成酰胺键。因此，在一些 实施方式中，丝氨酸蛋白酶(例如PSA)可以采用产生至少一个酰胺键的化学偶 联技术或采用以下所述产生融合蛋白的重组DNA技术与丝氨酸蛋白酶抑制剂 (例如ACT)缀合，所述重组DNA技术产生的融合蛋白内，成员间直接或通过 接头由至少一个酰胺键相连。当丝氨酸蛋白酶(例如PSA)通过化学(或重组)方式与丝氨酸蛋白酶 抑制剂缀合之后，该丝氨酸蛋白酶抑制剂和游离丝氨酸蛋白酶抑制剂的稳定性在多种条件下，例如在血清中、缓冲液中、以及在液体和冻干状态下，均得到 显著提高。
錄潔節朦鄉鄉丝氨酸蛋白酶抑制剂指一类蛋白超家族，由于其多数成员的丝氨酸 蛋白酶活性而得名。该家族成员是单链蛋白，大小通常为40-60kDa(参见综述， 例如，Bird， / ewtoCW/ 24:63-89(1998); Pemberton， Ca"cer ■/
10(1):1-11(1997); Worrall等，所oc/zew 5"oc Traw 27(4):746-50(1999);禾口 Irving 等，Ge"omei es 10:1845-64(2000))。丝氨酸蛋白酶抑制剂家族成员间通常具有 大约15-50%的氨基酸序列同一性。丝氨酸蛋白酶抑制剂的三维计算机模型显 示为超重叠性。丝氨酸蛋白酶抑制剂存在于脊椎动物和动物病毒、植物和昆虫 中，已鉴定的该超家族成员数量接近300个。不是所有的丝氨酸蛋白酶抑制剂 都抑制蛋白酶活性；但是，就本发明而言，本发明缀合物蛋白所使用的丝氨酸 蛋白酶抑制剂典型地具有抑制活性。参见综述，例如，Silverman等，J.说'o/. CAew. 276:33293-33296, 2001。丝氨酸蛋白酶抑制剂的抑制活性所需的构象已经被文 献充分公开(参见，例如，Silverman等所引用的参考文献)。丝氨酸蛋白酶抑制剂在人血浆中的水平相对较高。其中包括ACT、 AT、 PCI、血纤蛋白溶酶原激活物抑制剂1和2 (PAI-1和PAI-2)、组织激肽释 放酶抑制剂、a2-抗纤溶酶和神经丝氨酸蛋白酶抑制剂。这些丝氨酸蛋白酶抑 制剂具有保守的结构。丝氨酸蛋白酶抑制剂通常含有9个a-螺旋和3个P-折叠。 反应位点环(RSL)区域包含蛋白酶识别位点。所述RSL的长度约为20到30个 氨基酸，距离羧基末端30到40个氨基酸。RSL暴露在蛋白表面上。丝氨酸蛋 白酶抑制剂分子的核心结构折叠成为三-P-折叠的梨形，使RSL位于该结构的 顶部。RSL包括所谓的"诱饵"序列，其被认为能够模拟目标蛋白酶的底物，并 通过模拟蛋白酶底物以及在RSL上发生裂解时共价结合蛋白酶来调控特异性 丝氨酸蛋白酶的活性。当丝氨酸蛋白酶抑制剂被目标蛋白酶裂解时，其构象改 变，同时，残余的活性位点环插入其中一个P-折叠中。在该转变过程中，丝氨 酸蛋白酶抑制剂与目标蛋白酶形成一个稳定的耐热复合物。RSL的序列，特别 是Pl和邻近氨基酸残基，决定了有抑制活性的丝氨酸蛋白酶抑制剂对于蛋白 酶的特异性。
丝氨酸蛋白酶抑制剂有多个区域与控制与调节构象变化相关，所述 构象变化与结合目标蛋白酶有关。这些区域是绞链区(RSL的P15-P9部分)； 豁口区(breach)(位于一个p-折叠一Aj3折叠的顶部，即RSL最初插入A|3-折叠 的位点)；闸板区(shutter)(在A卩-折叠的顶部，RSL最初插入A卩-折叠的位点)； 和大门区(gate)(参见，例如，Irving等(2000)的摘要部分)。具有抑制作用的丝 氨酸蛋白酶抑制剂在上述区域内的许多关键氨基酸残基上拥有很高的保守度。在本发明优选的实施方式中，丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如ACT)与蛋 白酶(例如PSA)缀合。ACT是容易获得的。其可以从市场上购买(例如，Scipac Ltd， Kent，英国)，或者从诸如血桨或其它来源中纯化得到(参见，例如， Christe画n等，fe ■/ 194:755 - 63, 1990)。 ACT也可以按照本领域
常规方法通过重组技术获得。要重组制备ACT或相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂， 相关多肽和氨基酸序列在现有技术中是现成的(参见，例如，美国专利号 5,079,336)。例如，人ACT蛋白序列(未加工的前体)可参见UniProt登录号 P01011和NCB1登录号NP—001076。成熟的蛋白序列是UniProt登录号P01011 的第26-423位氨基酸(如SEQ ID NO:2中所示)。又例如，mRNA序列可参见 登录号NM—001085。本领域技术人员能够理解，适用的ACT序列包括保留了丝氨酸蛋白 酶抑制剂整体结构的各种变体。基于本领域已知的结构分析(例如，前述参考 文献)能够设计这些变体。例如，ACT蛋白变体可以引入利于与PSA连接的残 基。这些蛋白通常与成熟ACT具有至少65%的序列同一性，更通常地，具有 至少70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%的序列同 一性，并且保留了丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构。
丝鎌歪爐丝氨酸蛋白酶可分为两种类型胰凝乳蛋白酶家族，其包括哺乳动 物酶类，例如胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、弹性蛋白酶或激肽释放酶；以及枯草 杆菌蛋白酶家族，其包括细菌酶类，例如枯草杆菌蛋白酶。这两个家族具有相 同的活性位点几何结构，并通过相同的机理进行催化。丝氨酸蛋白酶的活性位点呈裂口状，多肽底物在此与其结合。形成 催化三联体的三个残基在催化过程中起重要作用。它们是His 57， Asp 102和Serl95，编号是以胰凝乳蛋白酶原为基准。在催化过程中， 一酰基酶作为中间 物连接底物和活性位点的丝氨酸。在第二个步中，酰基酶中间物被一个水分子 水解从而释放肽，并恢复酶的丝氨酸羟基。很多丝氨酸蛋白酶已经是本领域已知的。例如，Rawlings和Barrett RawlingsO&仇五^ymo/. 244:19-61, 1994)提出一种将蛋白酶分为家族(family) 和集群(dan)的分类方法。家族分类根据它们催化结构域的序列比对分值进行 分组。按照这种分类方法，分为5个集群和30个家族。蛋白酶的全面分类可 以从Merops和ExPASy网站上査询得到。在典型的实施方式中，丝氨酸蛋白酶是胰凝乳蛋白酶样蛋白酶，例 如PSA或胰蛋白酶。通常，丝氨酸蛋白酶是PSA。 PSA是腺性激肽释放酶基 因家族的一员。它的底物包括生精蛋白I和II、胰岛素样生长因子结合蛋白3、 纤维结合蛋白和层粘连蛋白。其它相关的蛋白酶也可以用于本发明。例如， PSA、腺性激肽释放酶2(hK2)、和组织激肽释放酶(hKl)是人腺性激肽释放酶 家族的成员，它们结构相似。PSA以及同为前列腺产生的人腺性激肽释放酶 2(hK2)的成熟形态都是237个氨基酸的单体蛋白，它们具有79%的氨基酸序列 同一性。在其它实施方式中，所述蛋白酶是胰蛋白酶或胰蛋白酶相关蛋白。
如上所述，丝氨酸蛋白酶为本领域所熟知，可以容易地通过纯化或 使用表达载体表达蛋白来获得。例如，PSA可以从天然存在的来源，例如人精 浆中纯化得到，或者可以用重组技术产生。PSA的纯化方法是公知的(参见， 例如，Sensabaugh&Blake， C/ra/, 144:1523 - 1526, 1990, Christenssen等，同 上)。PSA也可以从市场上购得(例如波兰的生物处理公司(BioProcessing， Inc.， Portland, ME))。或者，PSA也可以用基础表达技术重组产生。就重组表达而言，作为举例，PSA多肽序列的可以是IMProt登录 号P07288和NCBI登录号A32297的序列。举例来说，核苷酸序可参见GenBank 登录号 AF335478, NM—001030050 ， NM—001030049 ， NM—001030048 ， NM—001030047和NM_001648。人PSA前体蛋白可参见例如UniProt登录号 P07288。 PSA成熟形态对应于残基25-261 。举例来说，该蛋白序列可如SEQ ID NO:l中所示。在一些实施方式中，可将PSA蛋白，例如氨基酸序列有改变的重组表达的PSA蛋白，用于本发明。例如，PSA蛋白变体可以引入利于与ACT连 接的残基。这些蛋白与成熟PSA序列(例如SEQIDNO:l)通常具有至少65%的 序列同一性，更普遍地是至少70%、 75%、 80%、 85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%或99%的序列同一性，都可被PSA抗体识别，且通常能够达到与 天然PSA相同的识别程度，因此，举例来说，用变体蛋白制备的PSA-ACT复 合可以用作对照。可以设计氨基酸序列的变化，例如基于PSA的已知结构来 设计。在一些实施方式中，本发明提供PSA-丝氨酸蛋白酶抑制剂缀合物， 例如PSA-ACT或PSA-AT;或胰蛋白酶-抗-胰蛋白酶缀合物。就两个或两个以上多肽序列而言的"同一的"或"同一性"百分数，表 示两个或两个以上序列或子序列是相同的，或者当通过比较窗口或指定区域对 它们进行比较或比对以得到最大的一致性的时候，其共有指定比例的氨基酸残 基，比对过程可使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法按照后文所述采用默 认参数进行，或者通过手工比对和目测检查。该定义还包括含有删除和/或插入 以及取代的序列。如后文所述，优选的算法考虑了缺口(gap)等情况。优选的， 同一性存在于一个长度超过25个连续的氨基酸的区域，或者更优选地，存在 于长度超过50-100个连续氨基酸或者200、 300、 400或更多连续氨基酸的区 域。就序列比对而言，通常，用一个序列作为参考序列，将待测序列与 其进行比较。当使用序列比较算法的时候，将待测序列和参考序列输入电脑， 根据需要指定子序列组配(subsequence coordinates),然后指定序列算法程序参 数。优选地，可以使用默认程序参数，或可指定可选参数。然后，序列比较算 法按照程序参数计算待测序列相对于参考序列的序列同一性百分比。序列比对的方法是本领域公知的。比较序列间的最佳比对可以采用 下述算法，例如，局部序列比对算法，Smith & Waterman,爿A ^ / /. Ma&. 2:482 (1981);总体序歹ij比对算法，Needl隱n & Wunsch, J. M /編.48:443 (1970); 相似性搜索法，Pearson & Lipman, Proc. A^7. ^caof. 85:2444 (1988);
以及这些算法的计算机执行程序(GAP、 BESTF1T、 FASTA和TFASTA，威斯 康辛遗传学软件包，遗传学计算机组(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group), 575 Science Dr.， Madison, Wl);或手工比对和目测检查(参见，例如，《当代分子生物学方法》Ci^re;^ Pratoco/s ^fo/ecw/w 所o/ogy (Ausubel等编著，1995增刊)).适用于计算序列同一性百分数和序列相似性的算法的例子还包括 BLAST禾卩BLAST 2.0算法，它们分别记载于Altschul等，M/c ^cZcfe i 仏 25:3389-3402 (1977)和Altschul等，Mo/. 215:403-410 (1990)。作为典型 例，采用默认参数运行BLAST和BLAST 2.0来计算本发明中核苷酸和/或蛋白 质的序列同一性百分数。对于氨基酸序列，BLASTP程序的默认值为字长 (W)3、期望值(E)10和BLOSUM62得分矩阵(参见Henikoff & Henikoff (1989)， 尸rac. A^/. JcW. >SW. 89:10915))。本发明使用默认参数运行BLAST2.0算 法。
丝賓麼歪A朦碧合，丝賓浚蛋A艨滞虔^/游缀^激丝氨酸蛋白酶一般通过化学反应与丝氨酸蛋白酶抑制剂缀合。在本 发明中，PSA用作丝氨酸蛋白酶的代表例，ACT用作丝氨酸蛋白酶抑制剂的 代表例。可以理解，在此所述的技术可以用于将任何丝氨酸蛋白酶共价与丝氨 酸蛋白酶抑制剂连接。在本发明中，"合成共价键"是指两个基团之间非天然形成而是化学 合成的共价键，所述的化学合成是以获得产品为有目的进行的化学反应。本申请中，"稳定的共价键"是指这样一种共价键，其能够在pH值约 为7.0的条件下抗水解。本发明中，"抗水解"的意思是， - 种丝氨酸蛋白酶-丝氨酸蛋白酶抑 制剂缀合物，例如PSA-ACT，不表现出明显的水解。"无明显水解"或"无可测 游离PSA"是指2-8。C下，在pH值大约为7.0的血清、血浆、蛋白或缓冲液 中，至少5天后，通常至少10天或至少20天后、或至少30天后，少于约10% 的PSA从PSA-ACT复合物中解离出来。如本领域技术人员能够理解的，本发明稳定的蛋白酶-丝氨酸蛋白酶 抑制剂复合物(例如PSA-ACT)的特征之一是在pH7.0下能够抗水解，其在更低 的pH下同样能够抗水解，并可用于除pH 7.0(左右)以外的其它pH条件。例如， 本发明的具有合成共价键的稳定共价连接的PSA-ACT复合物可用于在pH值 大约为5.5、大约6.0或大约6.5条件下进行的实验。而且，在低pH范围内，例如pH为大约5.0到大约6.5，本发明的复合物比非合成共价键连接的天然 PSA-ACT复合物更加稳定。可以使用很多已知的方法，包括化学连接和重组连接，将PSA与丝 氨酸蛋白酶抑制剂(例如ACT)缀合。例如，PSA具有很多官能团，例如，羧基 (COOH)、游离胺基(-NH2)或巯基(-SH)，它们可以用于与丝氨酸蛋白酶抑制剂 上合适的官能团反应(反之亦然)。还可以对PSA和/或丝氨酸蛋白酶抑制剂进行 衍生反应从而露出或接装其它反应性官能团。衍生反应可以包括接装大量接头 分子中的任何一种，例如那些购自皮耶斯化学公司(Pierce Chemical Company, Rockford Illinois)的接头分子。有很多连接丝氨酸蛋白酶抑制剂和PSA蛋白的化学方法。这些方法 记载于，例如，《生物缀合技术》(BioconiugateTechniques), Heimanson主编， Academic Press(1996)。例如，可以用异-双官能偶联试剂。连接基团可以是化 学交联剂，包括例如，琥珀酰亚胺基-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-l-羧酸酯 (SMCC)。连接基团也可以是另外的氨基酸序列，包括例如，聚丙氨酸、聚甘 氨酸或类似的连接基团。其它化学接头包括糖类接头、脂类接头、脂肪酸接头、聚醚类接头， 例如PEG等。举例来说，聚(乙二醇)接头可以购自美国阿拉巴马州海鸥聚合物 公司(Shearwater Polymers, Inc., Huntsville， Alabama)。这些接头可以选择性 地具有酰胺连接键、巯基连接键或杂官能连接键。接头试剂可以含有反应性亲核官能团，这样的官能团能够与蛋白质 (例如PSA和/或ACT)上的亲电基团反应形成稳定的共价键。蛋白质上有用的 亲电基团包括但不限于醛和酮幾基。接头上有用的亲核基团包括但不限于酰 肼、肟、氨基、肼、縮氨基硫脲、联胺羧酸酯和芳基酰肼。羧酸官能团和氯甲酸酯官能团也是接头有用的反应位点，因为它们 能够与蛋白质上的仲胺基反应形成酰胺键。可用作反应性位点的还有接头上的 碳酸酯官能团(例如但不限于对硝基苯碳酸酯)，其能与蛋白质上的氨基(例如但 不限于N-甲基缬氨酸)反应形成氨基甲酸酯连接。在一些实施方式中，PSA或丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如ACT)可以在 赖氨酸残基上引入巯基修饰。可用于修饰赖氨酸的试剂包括但不限于N-琥珀 酰亚胺S-乙酰基硫代乙酰酯(SATA)和2-亚胺基硫醇盐酸盐(Traut试剂)。
在另一个实施方式中，PSA或ACT可以在一个或多个糖类基团上引 入巯基修饰。在另一个实施方式中，PSA或ACT可以有一个或多个糖类基团，这 些糖基可被氧化成醛基(—CHO)(参见，例如，Laguzza等，(1989) J. Med. Chem. 32 (3) :548-55))Coligan等，"当代蛋白质科学方法"第2巻("Current Protocols in Protein Science", Vol. 2， John Wiley & Sons (2002))，在此引入作为参考。本发明的PSA-丝氨酸蛋白酶抑制剂缀合物可用多种交联剂来制备， 包括但不限于下列试剂BMPEO、 BMPS、 EMCS、 GMBS、 HBVS、 LC-SMCC、 MBS、 MPBH、 SBAP、 SIA、 SIAB、 SMCC、 SMPB、 SMPH、硫代-EMCS、 硫代-GMBS、硫代-KMUS、硫代-MBS、硫代-SlAB、硫代-SMCC以及硫代-SMPB 和SVSB(琥珀酰亚胺-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)，还包括双-马来酰亚胺试剂DTME、 BMB、 BMDB、 BMH、 BMOE、 BM(PEO)3和BM(PEO)4， (Pierce Biotechnology, Inc. Rockford, Illinois)购得。双-马来酰亚胺试剂能够使蛋白质半胱氨酸残基的 硫醇基团与含硫醇的蛋白质部分或接头中间物以相继的或同时发生的方式连 接。除马来酰亚胺外能够与蛋白质或接头中间物的硫醇基团发生反应的其它官
能团包括碘乙酰胺、溴乙酰胺、乙烯基吡啶、二硫化物、吡啶基二硫化物、异 氰酸酯和异硫氰酸酯。 PSA-丝氨酸蛋白酶抑制剂缀合物也可以通过使用各种各样的双官 能蛋白-偶联剂来制备，例如N-琥珀酰亚胺-3 -(2-吡啶基二硫醇)丙酸酯(8 0 )、 亚氨基硫垸(IT)、亚氨酸酯的双官能衍生物(例如二亚胺代己二酸二甲酯二盐 酸)、活性酯(例如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛类(例如戊二醛)、双-叠氮化合 物(例如二-(对叠氮苯基)-已二胺)、双-重氮衍生物(例如二-(对重氮苯基)-乙二 胺)、二异氰酸酯(例如亚节基2,6 -二异氰酸酯)和双-活性氟化物(例如1, 5 二氟-2,4-二硝基苯)。在一个实施方式中，PSA通过马来酰亚胺偶联剂与丝氨酸蛋白酶抑 制剂(例如ACT)连接。在这些反应中，水溶性生物聚合物(例如蛋白质)的羧酸 部分可以与肼、羟基胺和胺偶联，所述偶联反应在水溶液中用水溶性碳化二亚 胺(例如l-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDAC))进行。已经证 明，反应混合物中包括N-羟基硫代琥珀酰亚胺能够提高EDAC介导的蛋白-羧 酸缀合的偶联效率。为了减少作为常见副反应之一的蛋白质分子内和分子间赖氨酸残基偶联，碳化二亚胺介导的偶联反应通常在低pH浓縮蛋白溶液中进行，
并使用大量过剩的亲核试剂。反应产生酰胺键，其对水解极其稳定，只有在煮 沸的碱或极强的酸性条件下才发生水解。该反应形成的共价键是肽键，因此与 蛋白质内其它任一天然肽键一样稳定。丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂连接，例如PSA连接ACT，可 以在任何位点进行，只要PSA可被测知，例如在检测分析中用抗体测知。通 常，连接不使用蛋白酶上的丝氨酸基团，该基团是供检测分析中检测蛋白酶所 用抗-蛋白酶抗体(即抗-PSA抗体)识别的位点。在一些实施方式中，蛋白酶和 丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如PSA和ACT)首尾相连，例如，在重组融合蛋白中 首尾相连。蛋白酶相对于丝氨酸蛋白酶抑制剂的方向并不重要，即蛋白酶的 N-末端可以连接到丝氨酸蛋白酶抑制剂的C-末端，或者蛋白酶的C-末端可以 连接到丝氨酸蛋白酶抑制剂的N-末端。本发明可以采用重组遗传学领域的常规技术来制备丝氨酸蛋白酶抑 制剂多肽、丝氨酸蛋白酶多肽、和/或丝氮酸蛋白酶-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合 多肽。 一些基础教科书公开了本发明中所使用的一般方法，包括《分子克隆， 实验室手册》 (Sambrook & Russell, Mo/ecw/ar C7謹'"g, 爿 /^oratory ^fam^/(2001年第3版))；《基因传送与表达实验室手册》(Kriegler, Ge"e Trara，朋d J Z^6orator_y Ma"wfl/ (1990》；以及《当代分子生物学
方法》(Cw〃ew/尸ratoco/s /" Afo/ecw/flr B/o/ogy(Ausubel等编著，1994-1999))。
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丝氨酸蛋白酶(例如PSA)或丝氨酸蛋白酶抑制剂(例如ACT)或融合 蛋白(例如包含PSA- ACT的融合蛋白)可以采用本领域公知的技术进行表达。 可以使用真核生物宿主细胞和原核生物宿主细胞，例如动物细胞、昆虫细胞、 细菌、真菌和酵母。使用宿主细胞表达分离的核酸的方法是本领域技术人员所 公知的，并可以在诸如上述的一般参考文献中找到。相应地，本发明还提供包 含在此所述核酸序列的宿主细胞和表达载体。编码丝氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂或者融合蛋白的核酸可以使用标准重组技术或合成技术来制备。所述核酸可以是RNA、 DNA或者其杂 合体。本领域技术人员能够构建很多含有功能等同(例如编码同一多肽)的核酸 的克隆。为此目的的克隆方法以及验证核酸序列的测序方法是本领域公知的。在一些实施方式中，核酸在体外(/"i^ra)合成。脱氧核苷酸可以按照 Beaucage & Caruthers, 7^ratedrow22(20): 1859-1862 (1981)中描述的固相 亚磷酰胺三酯方法，使用自动合成仪(例如参见Needham-VanDevanter等， Wwc/e/c v4c/A12:6159-6168(1984》化学合成得到。在另一些实施方式中， 编码目标蛋白质的核酸可以通过例如PCR等扩增反应制得。本领域技术人员知到许多方法可以产生指定多肽序列的变体。最常 见地，多肽序列可通过改变其相应的核酸序列并表达来改变。本领域技术人员可以根据在此所述的序列和本领域现有关于PSA和 丝氨酸蛋白酶抑制剂的结构和功能的常识选择合意的本发明核酸或多肽。这些 蛋白质的物理性质和一般性质是本领域技术人员公知的，包括其活性位点，如 前所述。为获得PSA、丝氨酸蛋白酶抑制剂或PSA-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合 蛋白的高水平表达，可构建了这样的表达载体，其包括下列元件引导转录的 启动子、转录/翻译终止子、用于转录起始的核糖体结合位点等等。合适的细菌 启动子是本领域熟知的，例如上文中引用的提供表达克隆方法和方案的参考文 献中就有所描述。用于表达核糖核酸酶的细菌表达系统可以是例如大肠杆菌(K co//)、芽孢杆菌属(Bac/〃M平)和沙门氏菌(同样参见Palva等，Ge"e(《基因》) 22:229-235(1983); Mosbach等，淑厨(《自然》)302:543-545(1983))。这些表 达系统的试剂盒可在市场上购得。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核 表达系统是本领域公知的，同样可以在市场上购得。除启动子以外，表达载体通常还包括具备在宿主细胞内表达核酸所 有其它必要元素的表达盒或转录单位。因此，典型的表达盒包含与编码PSA、 丝氨酸蛋白酶抑制剂或融合蛋白的核酸序列操作性连接的启动子、转录产物加 Poly(A)所需的信号序列、核糖体结合位点和翻译终止子。根据不同的表达系统， 编码PSA、丝氨酸蛋白酶抑制剂、或融合蛋白的核酸序列可以与可切除的信号 肽序列连接，以促进转化细胞分泌编码的蛋白。如上所述，表达盒还应当包含位于结构基因下游的转录终止区，用以有效地终止转录。终止区可以与启动子序列来自同一基因，也可来自不同基因。用于将遗传信息转进细胞的具体表达载体不是特别重要。各种用于 在真核细胞或原核细胞表达的常规载体均可使用。标准的细菌表达载体包括质 粒，例如pBR322系列质粒、pSKF、 pET15b、 pET23D、 pET-22b (+)，以及融 合表达系统，如GST禾BLacZ。可以为重组蛋白加上表位标签(例如6-his)以便 于分离。在含有编码序列的表达盒以外，所述载体还包含T7启动子、转录起 始因子和终止子、pBR322复制起始位点、bla编码序列和lacl操纵子。包含编码核糖核酸酶分子或融合蛋白的核酸序列的载体可以在多种 宿主细胞中表达，所述细胞包括大肠杆菌、其它细菌宿主、酵母以及各种更高 等的真核细胞，例如COS、 CHO和HeLa细胞系和骨髓瘤细胞系。除了细胞以 外，载体可以由转基因动物进行表达，优选绵羊、山羊和牛。典型地，在这种 表达系统中，表达出的重组蛋白存在于转基因动物的乳汁中。本发明的表达载体或质粒可以采用公知的方法转移进选定宿主细胞 中，例如适用于大肠杆菌的氯化钙转化法和适用于哺乳动物细胞的磷酸钙处 理、脂质体融合或电穿孔法。质粒转化的细胞可通过抗生素耐受性来选取，所 述耐受性是由质粒上携带的基因，例如amp、 gpt、 neo和hyg等基因提供的。成功表达后，表达出的蛋白可以按照本领域的标准方法进行纯化， 包括硫酸铵沉淀、柱层析(包括亲和层析)、凝胶电泳等等(参见， 一般地，《蛋 白质纯化》(R. Scopes,尸rate/"尸wri/7ca,/o", Springer~~Verlag， N. Y. (1982), Deutscher,《酶学研究的方法第182巻蛋白质纯化指南》(Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification.), Academic Press, Inc. N. Y. (1990); Sambrook， Ausubel，如上文所述)
稳定性分析本发明的PSA-丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物相对于现有技术中的 PSA-丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物更加稳定，因为其共价键在后文所述条件下是 pH稳定且不可逆的。现有自然产生的PSA-丝氨酸蛋白酶抑制剂，例如 PSA-ACT复合物，如果没有过量纯化丝氨酸蛋白酶抑制剂例如ACT存在下储 存一段时间后，会在pH 7.0或更高值时发生水解。为了确定本发明的PSA-ACT复合物(或其它PSA-丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物)是否具有本发明所述的稳定 性，本领域技术人员可以将PSA-丝氨酸蛋白酶抑制剂复合物在pH值大约7.0 的缓沖液中孵育，例如白蛋白(HSA、 BSA或其组合)缓冲液。缓冲液的一个例 子是含有EDTA、碳酸氢钠、磷酸和盐溶液，和4g/dL蛋白的蛋白质缓冲溶液。 将PSA-丝氨酸蛋白酶抑制剂保存一段时间，例如至少5天，或者，更常用的 是30或36天，开瓶方案(参见实施例2)。如果没有测到明显有PSA从复合物 释出，例如，如果从复合物中释出的PSA少于约10%，则认定该复合物是稳 定的。可以用例如免疫测试方法(例如，用于检测总PSA和游离PSA的Roche Elecsys试剂盒)检测总PSA和游离PSA。可以理解，本发明的稳定丝氨酸蛋白酶抑制剂-蛋白酶复合物，例如 PSA-ACT复合物，可以用于除pH 7.0以外的pH值。例如，使用合成共价键 连接的PSA-ACT在pH大约5.5或高于5.5，例如大约6.0、大约6.5、大约7.0 或大约7.5或更高的条件下也是稳定的，因而可以用于在上述pH下进行的实 验。相比自然形成的PSA-ACT复合物，含有合成共价键的稳定PSA-ACT复 合物通常在较低的pH范围也更稳定。
试剂盒本发明还提供含有本发明丝氨酸蛋白酶-丝氨酸蛋白酶抑制剂复合 物(例如PSA-ACT)的试剂盒。举例来说，可将PSA-ACT复合物包含在检测患 者PSA水平的试剂盒里作为对照，这包括包含在多分析物试剂盒中。另外， 本发明还可以用于各种含有蛋白酶的免疫测定试剂盒或对照，这些试剂盒和对 照中的蛋白酶可能因自身反应或与其它分子反应而降低其自身或其它分析物 的稳定性或性能。
实施例
实施例l.ACT-PSA缀合物的制备 ACT通过化学方法缀合到PSA上，使用的是本领域公知的两步碳 二亚胺-介导的偶联反应。简而言之，将PSA配制于冷冻的pH6.0磷酸盐缓冲 液(PBS)中，浓度为0.03ng/mL。配制含1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚 胺盐酸盐(EDAC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHSS)的溶液，并且冷冻。然后使上述两种溶液进行反应，孵育2小时。接下来制备ACT溶液并将其加入到
PSA/EDAC/NHSS溶液中。将该混合物孵育2小时，使PSA与ACT发生缀合。 孵育后，对缀合PSA溶液进行透析，去除未结合的EDAC/NHSS，透析使用的 是标称分子量(MW)截留为3500的透析膜，透析在冷冻的pH7.0磷酸盐缓冲液 中进行。
实施例2. ACT-PSA缀合物的稳定性对实施例1中制备的ACT-PSA缀合物的稳定性进行了检测，以确定 该缀合物在pH大于7.0的条件下是稳定的。采用开瓶稳定性研究法和加速稳 定性研究法测定稳定性。在一种开瓶稳定性测评中，将测试瓶在2-8'C冻存指 定时间，每个工作日从冷藏箱中取出，置于试验台上直到其达到室温。然后混 匀测试瓶，収下盖子，让空气进入，再盖上盖子并将样品放回冷藏箱中。该检 测被涉及为拟似产品典型的日常使用。在一种加速稳定性研究中，将测试瓶置 于各种高于其保藏温度的温度下，由此加速被测物的降解。 PSA-ACT缀合物在血清、缓冲液中，在液态或冻干状态下都是稳 定的。例如，在一个稳定性测试中，每日将测试瓶升至室温、打开瓶子、盖上 瓶子并将其重新保存于2-8。C，如此重复17天后，据测定，在血清中，总PSA 回收率的变化低于2%，游离PSA回收率的变化低于3%。该测试中，PSA的 浓度为33 ng/mL。据一次稳定性测试检测，在缓冲液中，采用相同的实验过程，艮口， 将瓶子保存于2-8°C、将其取出以升至室温、打开瓶子、盖上瓶子并重新保存 于2-8X:，如此重复36天后，指标仅略有下降，游离PSA的变化低于1%，总 PSA的变化约为1%。该实施例中总PSA的浓度为40ng/mL。游离PSA和总 PSA在0.1 ng/mL到35ng/mL的浓度下是稳定的。
实施例3. ACT-PSA缀合物的使用通过与丝氨酸蛋白酶抑制剂连接而稳定化的PSA可以作为临床实验 室的对照、标样或试剂使用。可以多分析物对照样品为例来展示稳定化PSA 的用途。通过将PSA与ACT缀合使之稳定增强了其在广泛pH背景下的稳定 性。多分析物对照样品中可包括其它感兴趣的临床分析物，而该多分析物样品的pH为对于所述其他临床分析物的稳定性来说最适的pH。非缀合PSA只在
较窄的、弱酸性pH范围内相对稳定，例如pH5到6。本发明使得PSA能够在 例如高于大约pH7的pH范围上保持稳定性，典型地，使用pH范围是4到8。 本发明允许对照样品的pH为中性到微碱性以确保其它待测分析物的稳定性， 本发明由此实现了可在原本不适合PSA的pH值下，例如中性到碱性pH下， 在对照样品中包含稳定的PSA。为了显示本发明缀合物的有效性，采用上述步骤制备了非缀合PSA 和缀合PSA-ACT对比样品。对这些样品进行为期33天的开瓶稳定性检测。目 标分析物是总PSA和游离PSA，使用Abbott Axsym仪器系统进行检测。非缀 合PSA样品的总PSA和游离PSA的损失百分比分别为26.4%和43.7%。缀合 PSA-ACT样品的总PSA和游离PSA的损失百分比分别为3.2%和3.7%。这表 明PSA稳定性得到了显著提高，可以有效地用于临床实验室的对照、标样或 试剂。本说明书中引用的所有出版物、专利、登录号和专利申请通过引用 纳入本发明内容，如同各出版物或专利申请被具体、单独引用纳入。虽然为便于清楚理解而采用了说明和举例的方式对上述发明进行了 细节的描述，然而，根据本发明的技术教导，在不背离后面的权利要求的精神 和范围的情况下，对其进行一定的改变和修饰，对于本领域一般技术人员而言 是显而易见的。
SEQ IDN0:1人PSA蛋白序列的示例(成熟蛋白)
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SEQIDN0:2人ACT蛋白序列的示例(成熟蛋白)
LDSQTMMVLVNYIFFKAKWEMPFDPQDTHQSRFYLSKKKWVMVPMMSLHHLTIPYFRDEELSCTWELKYTGNASALFILPDQDKMEEVEAMLLPETLKRWRDSLEFREIGEL
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权利要求
1.一种缀合物，包含与丝氨酸蛋白酶抑制剂相连的前列腺特异性抗原(PSA)，其中，PSA与丝氨酸蛋白酶抑制剂通过至少一个合成共价键相连接。
2. 如权利要求1所述的缀合物，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂是al-抗胰凝乳 蛋白酶(ACT)。
3. 如权利要求1所述的缀合物，其中，丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制 剂通过酰胺键连接。
4. 如权利要求1所述的缀合物，其中，丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制 剂通过胺-胺酸连接键连接。
5. 如权利要求1所述的缀合物，其中，丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制 剂通过巯基-胺连接键连接。
6. 如权利要求1所述的缀合物，其中，丝氨酸蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制 剂通过硫氢连接键连接。
7. —种缀合物，包含与丝氨酸蛋白酶抑制剂相连的前列腺特异性抗原 (PSA)，其中，PSA与丝氨酸蛋白酶抑制剂通过重组技术连接成一个重组融合 蛋白。
8. 如权利要求7所述的缀合物，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂是ACT。
9. 一种将前列腺特异性抗原(PSA)与丝氨酸蛋白酶抑制剂偶联的方法，所 述方法包括使用交联剂将PSA以化学方法与丝氨酸蛋白酶抑制剂连接。
10. 如权利要求9所述的方法，所述丝氨酸蛋白酶抑制剂是ACT。
11. 如权利要求9所述的方法，所述交联剂是马来酰亚胺交联剂。
12. —种将蛋白酶与丝氨酸蛋白酶抑制剂偶联的方法，所述方法包括重组 表达蛋白酶-丝氨酸蛋白酶抑制剂融合蛋白。
13. 如权利要求12所述的方法，其中，所述蛋白酶是PSA，所述丝氨酸 蛋白酶抑制剂是ACT。
14. 一种组合物，其包含权利要求l所述的缀合物。
15. —种试剂盒，其包含权利要求l所述的缀合物。
16. —种组合物，其包含权利要求2所述的缀合物。
17. —种试剂盒，其包含权利要求2所述的缀合物。
全文摘要
本发明提供不可逆连接的稳定的蛋白酶-蛋白酶抑制剂缀合物，例如，包含前列腺特异性抗原(PSA)相连的1-抗胰凝乳蛋白酶的缀合物或胰蛋白酶-抗胰蛋白酶缀合物，制备所述缀合物的方法以及使用所述缀合物的方法，例如，作为对照或标样用于PSA检测分析、或用于多分析物的对照。
文档编号C12Q1/37GK101563101SQ200780037844
公开日2009年10月21日 申请日期2007年10月10日 优先权日2006年10月13日
发明者K·米兰 申请人:生物辐射实验室股份有限公司