专利名称：具有改变性质的葡糖淀粉酶变体的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有改变性质(例如改善的热稳定性和/或比活)的亲代 葡糖淀粉酶的变体。特别的，本发明提供包含葡糖淀粉酶变体的组合物， 包括淀粉水解组合物、动物饲料组合物和清洁组合物。发明还涉及编码变 体的DNA构建体，和在宿主细胞内生产葡糖淀粉酶变体的方法。
背景技术：
葡糖淀粉酶(葡聚糖1，4-oc-葡糖水解酶，EC3.2.1.3 )是淀粉水解的外 作用糖酶，催化从淀粉或相关的寡糖和多糖分子的非还原末端移除连续的 葡萄糖单元。葡糖淀粉酶可以水解淀粉的直链和分支的糖苷键(例如直 链淀粉和支链淀粉)。
多种细菌菌林、真菌、酵母和植物都生产葡糖淀粉酶。特别有趣的， 且商业上重要的是，葡糖淀粉酶AI^外生产的真菌酶，例如来自以下属的 菌林曲霉属(y4s/wg"/ws) (Svensson等人,(1983) Ow7s^erg及&s. Q 附附训. 48:529-544; Bod等人，(1984) /, 3:1097-1102; Hayashida等人，
(1989)爿gnc.CAe附.53:923-929; USP 5,024,941; USP 4，794，175和 WO 88/09795);踝节菌属(r"/ww^c^) (USP 4,247,637; USP 6，255，084 和USP 6,620,924 );根霉属(i^/w/7"s) (Ashikari等人，(1986) v4g"c C7^附.50:957-964; Ashikari等人，(1989) J/;/7. M/cty 6,V /. awd 32:129-133和USP 4,863,864);腐质霉属(i/w附/a /fl) (WO 05/052148和 USP 4,618,579 )和毛霉属() ( Houghton-Larsen等人，(2003) 4pp/. ilf/cn^V /.祝oted朋/. 62:210-217)。编码这类酶的许多基因都已经克隆， 并在酵母、真菌和/或细菌细胞中表达。
在商业上，葡糖淀粉酶是非常重要的酶，已经在多种需要淀粉水解的
5用途中使用(例如从淀粉中生产葡萄糖和其它单糖)。葡糖淀粉酶用于生
产高果糖的玉米增甜剂.其占据超过50%的美国增甜剂市场。 一般，在淀 粉水解过程中，葡糖淀粉酶可以是且通常是与cc淀粉酶一起使用，将淀粉 水解为糊精，再水解为葡萄糖。然后，葡萄糖可以通过其它酶转化为果糖 (例如葡糖异构酶)；结晶；或在发酵中使用来生产多种终产物(例如 乙醇、柠檬酸、乳酸、琥珀酸盐、抗坏血酸中间体、谷氨酸、甘油和1,3 丙二醇)。在含有淀粉和/或纤维素的材料的发酵中使用葡糖淀粉酶生产的 乙醇可以作为燃料来源或用于醇消费。
虽然葡糖淀粉酶已经成功用于商业应用多年，但是仍然需要具有改变 性质的新型葡糖淀粉酶，所述性质例如改善的比活和增加的热稳定性。
曲霉属的葡糖淀粉酶已经产生了不同的突变，其增加了热稳定性和比 活，参考USP 6,537,792; USP 6，352，851; Chen等人，(1996) 9:499 — 505， Chen等人，(1995) iVWEwg. 8:575画582; Fierobe等人，(1996) 5/od^附.35:8698 — 8704;和Li等人，(1997)￡>ig. 10:1199-1204，但 是仍然需要提供葡糖淀粉酶变体，相对于它们的亲本具有改变的性质。
发明概述
在一个方面，本发明涉及在对应于SEQIDNO:2或3的第4、 5、 12、 24、 43、 44、 45、 46、 47、 49、 51、 70、 75、 6、 94、 100、 108、 114、 116、 119、 122、 124、 125、 137、 141、 143、 146、 148、 169、 171、 172、 175、 178、 180、 181、 208、 211、 228、 242、 243、 245、 292、 294、 197、 309、 310、 313、 314、 315、 316、 317、 321、 340、 341、 350、 353、 356、 363、 368、 369、 375、 376、 395、 398、 401、 408、 409、 412、 415、 418、 421、 "3、 436和451位和/或亲本葡糖淀粉酶中等价位置的残基位置处具有一个 或多个氨基酸取代的葡糖淀粉酶变体。可以通过序列同一性确定等价的位 置，从而使亲本葡糖淀粉酶具有与SEQ ID NO:l、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8 或9至少80%序列同一性且少于100%序列同一性。亲本葡糖淀粉酶可以 是SEQIDNO:l、 2或3中的一个。等价位置可以通过与SEQ ID NO:3的结构同一性来确定。本发明的另一方面是这样的葡糖淀粉酶变体，其在对
应于选自第4、 5、 24、 29、 43、 49、 70、 75、 76、 100、 108、 119、 124、 137、 146、 148、 169、 171、 172、 175、 178、 181、 208、 211、 243、 292、 294、 297、 314、 316、 317、 340、 341、 350、 356、 363、 368、 369、 376、 395、 401、 412、 433、 436 和451位的位置具有一个或多个M酸取代，且与SEQ ID NO:2具有至少 90%序列同一性。在一些方面， 一个或多个M酸取代对应下列位置5、 24、 43、 49、 70、 75、 76、 94、 119、 141、 146、 148、 172、 175、 178、 180、 181、 208、 211、 243、 294、 309、 314、 353、 369、 375、 409。亲本葡糖淀粉酶可以是以下任一项的木霉属物种(7Wd^fifer附flr
5/7/7.)、曲霉属物种(JS/^/"-//^ 5/7/7,)、腐质霉属物种(/^M附'Wfl 5/7/7.)、
青霉属物种(尸e"/c/〃/"附s/7尸.)、踝节菌属物种(7"fl/an 附j;ces^ 5p/7.)，或
裂殖酵母属物种(Sc/^OSflCCA"f7^C^S/，/7.)。在一些方面，葡糖淀粉酶变 体优选的是木霉属物种或曲霉属物种。
在本发明的其它方面，葡糖淀粉酶变体包括在对应至少一个下列位置 的位置中的取代D4L/E/R/S/C/A/QAV，
F5C/M/N/R/S/T/V/W， II2L/R， D24E/LyY/T， F29L/I/D/C/S/V/W， I43F/R/DA7S, D44E/I^/K/S/NA7F/R， Y47W， Y49N， Q70R/K/M/P/G/UF， Q75R/K/A, R76IVM/K/T/P， P94L， D100W/I/Q/M/P/A/N， N119P/TA7D/E， N146S/G/C/H/E/D/T/W/L/M， Q148WY/H/A/C/D/G/M/RyS/T， Y169D/F， Q172C/A/D/R/E/F/H/V/L/M/N/S/T/V， E180A/C/G/H/I/LWP/Q/R/S/T/V/Y， V181E/C/D/G/H/I/P/TA7S/K/F/A， Q20817A/C/E/N/F/H/T， S211C/R/E/A/Y/W/M/H/I7I/R/Q/T， E243S/R/N/MA7A/L， R245A/E/M/I/P/V， I292D/H/P/R/T/N/V/F/L， G294D/E/T/Q脆， K297M7P/T/M/D/N/Q/A/Y愿/R/W， R309A/C/G/H/I/N/P/Q/S/T/WA7L， Y3丽G/UP/S/W/R/Q, D313Q， V314A/R/N/D/C/E/Q/G/H/I/K/UM/F/P/S/T/W/Y, Y315F， Y316Q/R， N317T/H， K340D/T, K341F/D腊/G/S， T350S/E/層，Q35$H/D/E, T363L/R/C/H/W， S368W/D/F/L， S369F, N376Q/T/H/S/V， Y395Q/R/S, A398S肌， S401C/V， R408S， N409W/T/K， T412A/h/K/G， R433H/Q， I436A/T,和S451WT/H 。
一些优选的变体具有172位上的取代。其它优选的变体具有在208或211 位上的取代。其它优选的变体具有对应于Q172F、 Q208N或S221R的取
7代。其它优选的变体具有至少一个在314位的取代。在一些方面，变体具 有在24、 181、 208、 243、 292、 294、 353、 375或409位的至少一 个取代。 一些优选的取代是位于位置D24E/L/Y、 V181K/L、 Q208C、 E243Y、 1292V、 G294A/Q、 T353R、 N375N/Q和/或N409K/W。在一 方面，与亲本葡糖淀粉酶相比，葡糖淀粉酶变体表现出增加的热稳定性。 可选的，或者此外，变体还表现出与亲本葡糖淀粉酶相比增加的比活。
本发明的另一方面是编码本文中描述的变体的多核苷酸。另一方面是 含有多核苷酸的宿主细胞。本发明的另一方面是包含本文中描述的葡糖淀 粉酶变体的酶组合物。在一个方面，在淀粉转化过程或动物饲料配方中使 用组合物。在其它方面，在醇发酵过程中使用酶组合物。
发明的另一方面是在宿主细胞内生产葡糖淀粉酶变体的方法，这是通 过用包含编码变体葡糖淀粉酶的多核苷酸的DNA构建体转化宿主细胞； 在适合葡糖淀粉酶变体表达和生产的条件下培养宿主细胞，并生产变体。 方法还可以包括从培养物中回收葡糖淀粉酶变体的步骤。
附图简述
图1A示例具有632个氨基酸的里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)亲本葡 糖淀粉酶(SEQ ID NO:l)。信号肽是下划线的，催化区域(SEQ ID NO:3 ) 是粗体的，开始于氮基酸残基SVDDFI ( SEQ ID NO:160 )，具有453个 氨基酸残基；接头区是斜体的，结合结构域既是斜体又是下划线的。成熟 的蛋白质包括催化结构域(SEQ ID NO:3 )、接头区域和淀粉结合结构域， 由SEQ ID NO:2表示。图1B示例编码TrGA的cDNA ( SEQ ID NO:4 )。
图2示例质粒pDONR誦TrGA，其包括亲本TrGA的cDNA (SEQ ID NO:4)。
图3示例质粒pREP3Y-DEST (A)和pREP3Y-TrGA (C)。 图4A4B示例亲本葡糖淀粉酶的催化结构域的比对比较，所述亲本葡 糖淀粉酶包括来自泡盛曲霉(爿印e/^7/ws au^附oW) (AaGA) ( SEQ ID NO:5);黑曲霉(j^^rgf7/附w/gw) (AnGA) ( SEQ ID NO:6 );米曲 霉(爿s/^rg/〃船or^"e ) (AoGA ) ( SEQ ID NO:7 );里氏木霉(TWcbd^TWfl画".)(TrGA) (SEQ ID NO:3 );灰腐质霉(好画W" gW卿)(HgGA ) (SEQ ID NO:8 );和^v/wcr^ v/"^a (HvGA) ( SEQ ID NO:9 )的葡 糖淀粉酶。用星号(*)指示了相同的M酸。
图5示例(A )质粒pTrex 3g-DEST和(B )质粒pTrex3g-TrGA，其 作为表达载体，用于在里氏木霉宿主中表达和生产变体葡糖淀粉酶。
图6示例在6(TC和32'C下，亲本(野生型)TrGA和变体V314、S211R、 Q172F和Q208N之间的Vmax ( 葡萄糖/秒)比较，如实施例8中进一 步讨论。
图7示例组合突变体对淀粉的活性。
图8示例单位点突变体对玉米淀粉的活性。
图9示例TrGA和TrGA变体LR8对实施例10中的玉米醪液液化物 (corn mash liquefact) (NE )的样品的GA活性。
图10示例TrGA和TrGA变体LR8对实施例10中的玉米醪液液化 物(BSE)的活性i普。
图11示例可溶性玉米淀粉底物上的TrGA变体LR8。 图12是从侧面观察的木霉葡糖淀粉酶(黑色)(SEQ ID NO:2 )和泡 盛曲霉葡糖淀粉酶(灰色)三维结构的比较。
图13是从顶面》见察的木霉葡糖淀粉酶(黑色)和泡盛曲霉葡糖淀粉酶 (灰色)三维结构的比较。
发明的详细描述 I.定义
除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所 属领域普通技术人员常规理解相同的意思。Singleton等人，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY,第2版，John Wiley和Sons, New York (1994)，和Hale & Markham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, N.Y. (1991) 为技术人员提供了本文中使用的许多术语的常规含义。但是，出于清楚和《更于参考的原因，下文仍然定义了一些术语。
如本文中使用的，术语"葡糖淀粉酶(EC 3.2.1.3)"指催化从淀粉和 相关的S^瞎和多糖的非还原端释放D-葡萄糖的酶。
术语"亲本"或"亲本序列"指宿主细胞内天然的或天然存在的序列。 术语"TrGA"指具有SEQIDNO:2中所示成熟蛋白质序列的亲本里 氏木霉葡糖淀粉酶序列，其包括具有SEQ ID NO:3中所示序列的催化结构 域。TrGA的分离、克隆和表达描述在WO 2006/060062和2006年5月4 日公开的美国专利
发明者M·谢弗斯, P·范索林恩, R·博特, W·埃勒 申请人:丹尼斯科美国公司